Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng sinh học của cây nút áo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ LÊ THU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NÚT ÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1... Cây Nút

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Quỳnh Hoa, ThS Vũ Vân Anh – những người thầy đã trực tiếp dạy dỗ và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi

trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể giảng viên, kỹ thuật viên

bộ môn Thực Vật vì đã luôn quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ LÊ THU

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NÚT ÁO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Hoàng Quỳnh Hoa

2 Th.S Vũ Vân Anh

Nơi thực hiện:

Bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Quỳnh Hoa, ThS Vũ Vân Anh – những người thầy đã trực tiếp dạy dỗ và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi

trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể giảng viên, kỹ thuật viên

bộ môn Thực vật vì đã luôn quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành

MỤC LỤC

Trang

Danh mục các kí hiệu, chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Đặt vấn đề……… 1

Phần 1 - Tổng quan……… 3

1.1 Đặc điểm thực vật và phân lo ại chi Spilanthes………3

1.1.1 Vị trí phân lo ại của chi Spilanthes……… 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Spilanthes và một số loài thuộc chi này……….3

1.2 Thành phần hóa học của cây Nút áo……….5

1.3 Tác dụng sinh học, công dụng của cây Nút áo……….8

1.3.1 Tác dụng sinh học của cây Nút áo……… 8

1.3.2 Công dụng, cách s ử dụng của cây Nút áo……… 8

1.4 Một số vi khuẩn gây sâu răng……… 10

Phần 2 – Đối tượng và phương pháp nghiên cứu……….12

2.1 Đối tượng nghiên cứu………12

2.1.1 Nguyên liệu nghiên c ứu……… 12

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu……… 13

2.2 Nội dung nghiên cứu…….………13

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật………13

2.2.2 Thử hoạt tính sinh học ……… 14

2.2.3 Định tính các thành phần hóa học và phân lập một số thành phần hóa học trong mẫu cây Nút áo có hoạt tính………14

2.3 Phương pháp nghiên c ứu……… 14

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật……….……… 14

2.3.2 Thử hoạt tính sinh học bộ phận trên mặt đất cây Nút ……… ……….15

2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học ……… 18

Phần 3 – Thực nghiệm, kết quả và bàn luận……….……… 20

3.1 Kết quả thực nghiệm………20

3.1.1 Nghiên cứu về thực vật……… 20

3.1.2 Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết các phần trên mặt đ ất……… 28

3.1.3 Nghiên cứu thành phần hóa học……… 32

3.2 Bàn luận ……… 45

3.2.1 Bàn luận về phương pháp nghiên cứu….……… 45

3.2.2 Bàn luận về kết quả nghiên cứu……… 46

Kết luận và kiến nghị……….……….50 Tài liệu tham khảo

Phụ lục

Phụ lục 1: Hình ảnh một số loài thuộc chi Spilanthes

Phụ lục 2: Sắc kí khí khối phổ tinh dầu Nút áo

Phụ lục 3: Đường kính vòng vô khuẩn các mẫu thử

Phụ lục 4: Hình ảnh peak SKLM các phân đoạn M, A, B, C

Phụ lục 5: Phổ NMR của A20.4.6

Phụ lục 6: Bảng so sánh s ắc kí NMR của A20.4.6 và β-sitosterol

Phụ lục 7: Phiếu giám định tên khoa học và giấy chứng nhận mã số tiêu bản

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ATCC American Type Culture Collection

DM Dung môi

CC Column Chromagraphy

GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry

HPTLC High performance thin layer chromatography

L Carl Linnaeus

MBC Minimum Bactericidal Concentration

MIC Minimum Inhibitory Concentration

NCTC National Collection of Type Cultures

NMR Nuclear magnetic resonance

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng số Tên bảng Trang 1.1 Các chất chuyển hóa thứ cấp trong chi Spilanthes 7

2.1 Bảng kí hiệu các mẫu thực nghiệm 12

3.1 Đường kính trung bình vòng vô khuẩn các mẫu thử 28

3.2 Đường kính trung bình vòng vô khuẩn mẫu thử và Gentamycin 31

3.3 Kết quả định tính các nhóm chất trong c ụm hoa Nút áo 32

3.4 Hàm lượng các thành phần trong tinh dầu hoa Nút áo 33

3.5 Kết quả định tính các c ắn A, B, C bằng phản ứng hóa học 36

3.6 Số peak sắc kí SKLM từng phân đoạn M, A, B, C 37

3.7 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 20.4.6 43

3.8 Bảng so sánh đặc điểm hình thái các mẫu nghiên cứu 46

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

2.1 Sơ đồ quy trình thử hoạt tính kháng vi sinh vật 17

3.2 Ảnh hình thái lá các mẫu Nút áo 22

3.5 Ảnh hình thái hoa Spilanthes sp1 (V) chụp qua kính lúp soi

3.13 Đường đáp ứng của Gentamycin với Streptococcus mutans 31

3.15 Hình ảnh SKLM c ắn M và các phân đoạn A,B,C trong hệ 37

dung môi CHCl3 – MeOH (9:1)

3.16 Hình ảnh SKLM các phân đoạn gộ p lần 1 với hệ dung môi

3.19 Cấu trúc hóa học của hợp chất 20.4.6 42

Nút áo (hay còn gọi là Cúc áo, Nụ áo, Cỏ the, Cuống trầm…[7] [8]) là tên gọi

chung một số loài thuộc chi Spilanthes của họ Cúc Cây Nút áo từ lâu đã được các

thầy lang, các nhà khoa học, thực vật học nghiên cứu rất nhiều và cho thấy tác dụng hiệu quả trong điều trị nhiều bệnh như: đau răng, viêm miệng, đau họng, bại lưỡi, sốt rét, viêm phế quản, hen suyễn, các bệnh ngoài da, phong thấp, đau xương, bệnh scorbut…Tuy nhiên, công dụng phổ biến nhất của cây Nút áo là chữa đau nhức răng, sâu răng bằng các giã nhỏ, ngâm rượu để ngậm hoặc đặt trực tiếp vào chỗ răng đau [13].Với nhiều tác dụng như vậy, Nút áo được xem là một dược liệu rất đáng để khai thác, đặc biệt là hướng đến việc điều trị các bệnh liên quan tới nhiễm khuẩn răng miệng Hiện nay, trên thế giới, việc nghiên cứu về cây Nút áo đã được tiến hành rất nhiều Tuy nhiên, về thực vật, trong khi số lượng loài trong chi

Spilanthes khá lớn và phân bố hầu như rộng khắp trong cả nước nhưng vẫn chưa có

nghiên cứu nào thực hiện việc so sánh đặc điểm hình thái của các loài để tránh nhầm lẫn khi giám định tên khoa học các loài đó Ở Việt Nam, các đề tài nghiên cứu về hóa học, thực vật cũng như hoạt tính sinh học của cây Nút áo còn hạn chế Những đề tài nghiên cứu về mặt hóa học chủ yếu dừng lại ở việc định tính các nhóm hợp chất trong hoa Nút áo Còn về mặt nghiên cứu tác dụng sinh học của cây thì hoàn toàn chưa được thực hiện

Xuất phát từ những lí do trên, nhằm tìm hiểu sâu hơn về nguồn gốc và đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Nút áo, chúng tôi

tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Nút áo” với các mục tiêu sau:

1 Mô tả đặc điểm thực vật của các mẫu cây Nút áo, giám định được tên khoa học của các mẫu này

2 Nghiên cứu thành phần hóa học của cụm hoa cây Nút áo

3 Đánh giá hoạt tính sinh học của cây Nút áo bằng việc xác định mức độ ức chế

vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans của dịch chiết phần trên mặt đất, so

sánh hoạt tính sinh học của dịch chiết với Gentamycin

PHẦN 1- TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN LOẠI CHI SPILANTHES

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Spilanthes [1], [6], [9], [10], [13], [14]

Chi Spilanthes thuộc họ Cúc (Asteraceae), bộ Cúc (Asterales), phân lớp Cúc

(Asteridae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Spilanthes và một số loài thuộc chi

này

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Spilanthes

Cây cỏ, mọc hàng năm, cao trung bình từ 40 đến 60 cm [52] Lá mọc đối Cụm hoa đầu ở ngọn hay ở nách lá, thường có cuống dài; tổng bao lá bắc xếp 1-2 dãy Đế hoa lồi Hoa vàng hay trắng, hoa hình lưỡi nhỏ là hoa cái, tràng ngắn; hoa hình ống

là hoa lưỡng tính, có 4-5 thùy; nhị 5, bao phấn có mũi bởi một phần phụ hình tam giác cứng, có tai ở gốc hay không; bầu thường có lông mi, vòi có 2 nhánh cụt Quả đóng dẹp [6]

1.1.2.2 Đặc điểm một số loài thuộc chi Spilanthes

Chi Spilanthes có khoảng 60 loài [32], phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới

Ở nước ta có khoảng 5-6 loài Trong khuôn khổ của khóa luận này chỉ đề cập đến đặc điểm thực vật của các loài sau:

a S oleracea L

Cây cỏ, thân nằm rồi đứng, cao 20-50cm, màu tía Lá hình tam giác, mép nguyên hay có răng cưa, gân chính 3, gân phụ 5 cặp; cuống lá 1-1,5cm Cụm hoa đầu mọc đơn độc ở ngọn cành, cuống ngắn 1,5-2cm, tổng bao lá bắc có 2 hàng lá, hoa đầu rộng 8mm (không kể hoa) Quả đóng, đường kính 2mm, màu đen, không lông [6], [7], [10]

Phân bố ở châu Mỹ, châu Phi và cả châu Á Ở nước ta phân bố ở khắp nơi, khắp các độ cao [6], [7]

Mùa hoa từ tháng 1 đến tháng 5 trở đi [7], [13]

S acmella mọc hoang ở khắp các nơi đất ẩm Có ở Việt Nam, Lào,

Campuchia, Ấn Độ, Malaixia, Philipin… Cây có nguồn gốc ở Nam Mỹ [9]

c S paniculata Wall ex DC

Cây cỏ, mọc hàng năm, cao 20-60cm, thân tròn, bò hay đứng lúc non có lông mịn Lá có phiến hình tam giác, gốc lá tù hay tròn, dài 2,5-4cm, rộng 1,5-2cm, gân chính 3, gân phụ 3 cặp, có lông rồi không lông, cuống dài Cụm hoa đầu, 1-3 đầu ở nách lá, cuống dài đến 12cm, tổng bao lá bắc 1-2 hàng Hoa hình lưỡi nhỏ ít, 3-5 hoa, hoa hình ống nhiều Quả đóng, dẹp, mép mỏng, lông dài, ở đầu quả có 2 răng gai cao [6], [7], [10] Ra hoa từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau [6], [7]

Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Malaixia [6] Ở nước ta mọc ở nơi đất khô, đất hoang từ vùng thấp tới vùng cao 1700 m [6], [7], [10]

d S iabadacensis A H Moore

Cây cỏ, hàng năm, cao 60-80cm Lá có phiến bầu dục, đầu tù hay hơi nhọn, mép nguyên hay có răng Cụm hoa đầu, nhiều, tập hợp thành ngù, cuống dài 12cm

Lá bắc 5-7, cùng một cỡ, đế hoa sau dài 4-5mm Quả đóng có rìa lông cao 1,5mm [6], [10] Ra hoa vào tháng 1 [6]

Phân bố ở Việt Nam, Thái Lan, Campuchia, Indonexia Ở nước ta có gặp từ Nghệ An vào Quảng Trị và Kon Tum [6]

Mọc ở ven hồ và các bãi ẩm, ở độ cao từ 400 đến 1200m [6], [10]

e S grandifllora Turcz

Cây cỏ, cao 1m Lá có phiến thon, gốc lá tù, ngọn lá nhọn, mép có răng nằm, gân phụ 5 cặp, cuống lá dài Cụm hoa đầu, tận cùng cành, cuống dài 5-10cm; tổng bao lá bắc có 3 hàng, không lông hoặc có lông Quả đóng, dẹp, trụi, không lông [10]

f S calimorpha A.H.Moore

Cây cỏ, hàng năm, cao 40-80 cm Thân hình trụ, hơi có màu tía, không lông, phân nhánh ở phần trên, trên các đốt có rễ Lá đơn, mọc đối, hình ngọn giáo rộng, dài 3-7cm, rộng 1,5-2,5 cm, đầu có mũi nhọn, gốc hình nêm, mặt trên màu lục, mặt dưới màu lục tro, mép có răng thô hoặc lượn sóng; gân bên 2-4 đôi Cụm hoa đầu, màu vàng, ở nách lá hoặc ở ngọn thân; lá bắc 2, cuống hoa dài 5-9cm; hoa ở mép hình lưỡi nhỏ là hoa cái; hoa hình ống là hoa lưỡng tính Quả đóng [6]

Phân bố ở Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Thái Lan và Indonexia Ở nước ta gặp tại Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng và Lạng Sơn [6]

Cây mọc trên các trảng cây bụi và ven rừng thưa, ở độ cao từ 300 đến 1300 m [6]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY NÚT ÁO

Theo các tài liệu cho thấy thành phần hóa học trong cây Nút áo (Spilanthes spp.) bao gồm các chất sau: Spilanten (trong tinh dầu từ cụm hoa cũng như toàn

cây) [7], [9] Spilanthol hay N-isobutyl-2E, 6Z, 8E-decatrienamide (cao nhất ở hoa [52]) [9], [10], [16], [29], [32], [36], [41 ], [49], [54], [60]

Trong lá và đọt non có chứa: Nước 86,8 %, protid 7,8 % , glucid 8,3 %, xơ 1,6

%, tro 1,5 %, caroten 5,6mg%, vitamin C 22,5mg % [7]

Trong cây và hoa có chứa: Sterol [7] (như stigmasterol [32]), 1 polysaccharid không khử [7], Limonene, β-caryophyllen, Z-β-ocimene, γ-cadienen, thymol, germacrene-D, myrcene (trong tinh dầu từ hoa) [20], [50], [62]

Hình 1.1 Spilanthol Hình 1.2 Stigmasterol

Trong các dịch chiết bằng dung môi hữu cơ của hoa hoặc toàn cây có chứa các chất: N-isobutyl-2E,4Z,8Z,10E-dodecatetraenamide [54], butylated hydroxytoluene [54], n-hexandecanoic acid (Palmitic acid) [50], [54], tetradecanoic acid (Myristic acid) [54], polygodial, eudesmanolide [54], 3-acetylleuritolic acid, vanillic acid, sitostenone [53], [64], (2E)-N-isobutyl undeca-2-en-8, 10-diynamide [36], [49], (R,E)-N-(2-methylbutyl) undeca-2-en-8, 10-diynamid [41], [49], (2E, 4Z)-N-isobutyl-2, 4- undecadiene-8, 10 – diynamide [32], (2Z)-N-isobutyl-2-nonene-6, 8-diynamide [32] [29 ], (Z)-dec-2-en-6, 8-diynoic acid isobutylamide [29], (2E, 7Z)-N-isobutyl-2, 7- tridecadiene-10, 12- diynamide [36] [41], 7Z-N-isobutyl-7-tridecene-10, 12- diynamide [41], undeca-2E, 7Z, 9E-trienoic acid [41], [32], [50], isobutylamide [41], (2E, 7Z)-N-isobutyl-2,7-decadienamid [52], myricyl alcohol [23], scopoletin [53], trans-ferulic acid [53], trans-isoferulic acid [53], hỗn hợp stigmasteryl-3-O-β-D-glucopyranoside và β-sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside [53]

Bảng 1.1 Các thành phần hóa học trong chi Spilanthes [32]

1 S acmella

- N-butylamide: spilanthol [41] ; undeca-2E, 7Z, 9E-trienoic acid isobutylamide [41]; undeca-2E-en-8, 10-diyonic acid isobutylamide [41]; 2E-N-(2-methylbutyl)-2-undecene-8, 10-diynamide [36]; 2E, 7Z-N-isobutyl-2, 7-tridecadiene-10, 12-

diynamide [36]; 7Z-N-isobutyl-7-tridecene-10, diynamide [36]

12 Phytosterol: β12 sitosterol [33], stigmasterol [56], [33], α và β-amyrins [33]

- Tinh dầu: limonene, β-caryophyllen, ocimene, germacrene D, myrcene [17]

(Z)-β Hydrocarbon: hỗn hợp của các hydrocarbon thong thường từ C22 đến C35 [18]

- Alcohol: myricyl alcohol [33 ], [56]

N-isobutylamide: spilanthol; undeca-2E, 7Z, trienoic acid isobutylamide; acetylenic amides; acetylenes [62]

9E-3 S.oleracea

N-isobutylamide: spilanthol; 2-methyl butylamide; (Z)-non-2-en-6, 8-diynoic acid isobutylamide.; (Z)-dec-2-en-6, 8-diynoic acid isobutylamide [29]

4 S.ocumifolia Phenylethylamide: N-2-phenylethylcinnamamide

8E-decadienamide [52]

- Phenylethylamide: N-(2-phenelethyl)-2E, 6Z, decatrienamide [52]

8E-1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC, CÔNG DỤNG CỦA CÂY NÚT ÁO

1.3.1 Tác dụng sinh học của cây Nút áo

- Dịch chiết cây Nút áo có tác dụng ức chế và gây độc cho ấu trùng Plutella xylostera – là sâu tơ phá hoại rau màu Ngoài ra, Spilanthol có trong hoa Nút áo

được xem là chất có hoạt tính sinh học mạnh nhất [16]

- Dịch chiết cồn của Spilanthes oleracea thể hiện hoạt tính mạnh (83% tỉ lệ

gây chết) với Tuta absoluta – là một loại sâu phá hoại cà chua [49]

- Dịch chiết chloroform và methanol cũng có thể ức chế sự phát triển của

nhiều vi khuẩn như Corynebacterium diptheriae NCTC 10356 với MIC nằm

trong khoảng 64-256 g/mL và Bacillus subtilis ATCC 6633 với MIC trong

khoảng 128-256 g/mL [44], [50]

- Một số hợp chất trong dịch chiết Nút áo (S acmella) cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Staphylococcus aureus, Samonela typhimurium và

ấu trùng cái của Onchocerca gutturosa [44], [53]

- Dịch chiết ether dầu hỏa của S acmella có tác dụng ức chế sự phát triển của

vi khuẩn Bacillus spharicus, Pseudomonas aeruginosa, Klebesiella aerogenes,

Chromobacterium violaceum [44]

- Bột dược liệu của S calva có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn

Streptococcus mutans (vi khuẩn gây bệnh răng miệng) [26]

1.3.2 Công dụng, cách sử dụng của cây Nút áo

Từ lâu, Nút áo đã được sử dụng trong rất nhiều các bài thuốc dân gian cũ ng như nghiên cứu để bào chế ra các sản phẩm điều trị nhiều bệnh Ở Ấn Độ, người ta dùng hạt chế cồn thuốc trị đau răng, cồn này có tác dụng mạnh đối với ấu trùng muỗi Hạt nhai làm tiết nước bọt Ở Malaysia, lá nấu lên dùng chữa mày đay [7]

Trong thử nghiệm in vitro thành phần Spilanthol từ dịch chiết Nút áo có tác

dụng như một chất chống oxy hóa (antioxidant) [54] Spilanthol có vị cay tê mạnh,

có tác dụng làm se, gây tê [32] Chính điều này đóng vai trò quan trọng trong việc làm giảm tình trạng đau ở những bệnh nhân đau răng

Toàn bộ cây Nút áo từ rễ, thân, lá đến hoa đều có rất nhiều công dụng Một số công dụng cũng khá tương đồng giữa các bộ phận

Hoa là bộ phận được sử dụng nhiều nhất với các mục đích: Chữa đau răng [7] [9], [13], [23], [30], [40], [50], [51], trị các chứng viêm miệng [23], [30 ] và đau họng [7], [10], [13], [23], [30], [50], chữa bại lưỡi [10], [13], [16], [26], [51], phương thuốc chữa nói lắp ở trẻ em [13], [61], dùng như gia vị [48], tăng tiết nước bọt [9], [10], [13], cảm sốt đau đ ầu [7], [13], [22], [30], [25], sốt rét cơn [7]; viêm phế quản, ho gà [7] [13]; ho lao, hen suyễn [7], [30]; phong thấp, nhức xương, tê bại [7], [13], [22], [25], [50]; dùng ngoài trị nhọt độc [7], [9], [13], [40], lở ngứa [7], [13], [38], vẩy nến [38], rắn độc cắn [7], vết thương tụ máu sưng tấy[7], [9], đau mắt [7], [9], [13], chữa gai đâm [13]; trị bọ gậy muỗi anophen (cao chiết với ether dưới dạng nhũ dịch với xà phòng và hòa loãng với nước), diệt sâu bọ [13], [50]; gây tê tại chỗ [13], trị nôn mửa [13], trục thai chết [13], trị bệnh nhiễm trùng [13], [30], trị bệnh dại [30], lợi tiểu [60], trị bệnh scorbut [38 ]

Lá được sử dụng với các mục đích như: trị đau răng, viêm họng [30], [50], làm chất kích thích [10], [55], thuốc lợi nước bọt [6], [10], [48] (thành phần trong lá

có tác dụng tăng tiết nước bọt), chất gây tê tại chỗ [55], sử dụng trong các bệnh về nấm và vi khuẩn ở da (lở ghẻ, mẩn ngứa) [9], [13], [24], [50], có tác dụng lợi tiểu [9], [10], [13], [50], [51], [69] và tiêu sỏi [9], [13], [47], [50], [51], trị nhức đầu [9], [10], [13], làm rau ăn [7], [9], [10], chữa bệnh scorbut (chảy máu chân răng) [6], [7], [9], [13], [47], chữa nói lắp cho trẻ [6], [7], làm thuốc tẩy [13]; cảm cúm [30], bệnh dại [30]

Rễ được sử dụng với mục đích: trị đau răng [50], [51], làm thuốc tẩy, xổ [9], [13], [46] và thuốc nhuận tràng [46], chữa cảm lạnh và cúm [13], [46], [50], chữa

đau đầu [46], đau bụng [13], chữa hen [56 ], bệnh thấp khớp [13], [50], [56], trị bệnh tả [50]; trị ghẻ lở, vẩy nến, bệnh nhiễm trùng, bệnh scorbut [38]

Hạt có tác dụng: trị đau răng (cồn thuốc) [10], tăng tiết nước bọt [13]

Có thể sử dụng toàn cây Nút áo với mục đích như: trị đau răng [6], trị lỵ (luộc ăn) [13]; lợi tiểu, tiêu sỏi (nước sắc) [6], [13], nấu nước tắm trị thấp khớp [6], [13]; ghẻ lở, vảy nến [13], nước ép tươi làm thuốc đắp và bó vết thương [13]; làm thuốc bả cá (Ấn Độ) [13]; diệt bọ gậy [13], sâu bọ [15], [41], [57], vi khuẩn [27], [44], [58], nấm [35], [39], [45], [59], giun tròn [60]; trị gãy xương, ngã tổn thương,

bế kinh, trị đau dạ dày và trị ngoại thương xuất huyết [6], trị nhức đầu (nước sắc) [6]; giải độc, tiêu viêm, chỉ thống, trị cảm mạo, rắn độc cắn, [6], làm hạ đường huyết [13], [50]

Trong dân gian, Nút áo đã được sử dụng từ rất lâu để trị đau răng, viêm họng: hoa Nút áo tán nhỏ, ngâm rượu ngậm hoặc ngậm tươi nuốt sống [7]; sưng họng: lá nút áo giã nhỏ với ít muối, bọc vào mảnh vải rồi ngậm [13]

Như vậy, có thể nhận thấy công dụng trị đau răng, trị các bệnh răng miệng là một công dụng nổi bật và rất quan trọng của Nút áo Đây cũng là lí do tại sao chúng tôi thực hiện đề tài này với mục đích tìm hiểu sâu hơn về công dụng trị đau răng Từ

đó ứng dụng phát triển nguồn dược liệu đã có từ lâu đời trong dân gian này, mà dường như ngày nay đang bị lãng quên

1.4 MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY SÂU RĂNG

Những vi khuẩn có khả năng lên men đường thành acid lactic tồn tại trong khoang miệng là nguyên nhân gây sâu răng Chúng chủ yếu thuộc 3 chi:

Streptococcus (Streptococcus mutans (S mutans), Streptococcus sorbrinus, Streptococcus milleri v.v…), Lactobacillus (Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei v.v…) và Actinomyces Trong số những vi khuẩn này, S mutans

được coi là nguyên nhân chính gây bệnh sâu răng do vi khuẩn này luôn được phát hiện trong nước bọt, mảng bám răng của người và có số lượng rất cao ở những vùng

răng bị sâu, bệnh sâu răng giảm hoặc mất hẳn khi không có mặt S mutans [11]

S mutans hay còn gọi là Mutans streptococci được tìm thấy trong khoang

miệng của tất cả các quần thể thu mẫu, qua đó chỉ ra rằng các loài vi khuẩn này có

sự phân bố toàn cầu

S mutans có khả năng gây sâu răng là do vi khuẩn này có khả năng sinh acid mạnh và chịu acid tốt S mutans là vi khẩn Gram (+), có thể sinh trưởng hiếu khí hay kị khí S mutans trong điều kiện kị khí (đáy mảng bám răng) thiếu oxy chúng

lên men kị khí, tạo axit lactic gây ăn mòn men răng và gây sâu răng [11]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về S mutans và nhiều chủng

đã được công bố Các nhà khoa học đã phát triển nhiều phương pháp cả ở mức độ

hóa sinh và sinh học phân tử để phát hiện nhanh, chính xác sự có mặt và số lượng S mutans trong nước bọt cũng như trên bề mặt răng góp phần chẩn đoán và điều trị

bệnh sâu răng Nhiều loại môi trường khác nhau cũng đã được các nhà nghiên cứu

sử dụng trong việc phân lập, nhận dạng các chủng vi khuẩn này trong các điều kiện khác nhau [11]

Cùng với S mutans S sobrinus cũng được nhận định là nhân tố chính gây sâu răng ở người Trong khi S mutans có mặt ở hầu như các đối tượng mắc bệnh sâu răng thì S sobrinus chỉ có mặt với tỉ lệ phát hiện thấp từ 8- 35% ở người ở các

nước khác nhau Đây là 2 loài có độ tương đồng rất cao Các nghiên cứu vào thập kỉ

80 về mối quan hệ của các loài vi khuẩn liên quan đến sâu răng đều gộp 2 loài này

với nhau do khi đó S sobrinus chưa được nhận dạng chính thức Mặc dù S mutans

và S sobrinus có thể được phân biệt bởi các kiểm tra sinh lý, hóa sinh thích hợp

trong phòng thí nghiệm nhưng các thí nghiệm thường tốn kém, mất nhiều thời gian nên không phải lúc nào cũng khả thi để nhận dạng ở mức loài với phạm vi nghiên

cứu [11]

PHẦN 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯ ỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

- Các mẫu Nút áo được thu hái tại huyện Yên Định, tỉnh Thanh Hóa từ tháng 7 năm

2011 đến tháng 2 năm 2013 với kí hiệu mẫu được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Bảng kí hiệu các mẫu thực nghiệm

- Mẫu tươi gồm các bộ phận trên mặt đất (thân, lá, hoa) của 2 loài V và L dùng để làm nguyên liệu thử hoạt tính sinh học

- Cụm hoa loài V tươi phơi cho se rồi sấy khô ở 60oC, bảo quản trong túi nilon kín,

để chỗ mát làm nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

 Thuốc thử, dung môi, hóa chất:

- Các thuốc thử, dung môi, hóa chất thông dụng đủ tiêu chuẩn sử dụng trong phân tích của các hãng như Merck, Fisher, Prolabo…

- Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans ATCC 700610 ở Khoa Sinh, trường Đại

học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

- Ống nghiệm, đĩa petri, pipet…

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái các bộ phận sinh sản và sinh dưỡng của các mẫu thu hái được

- So sánh đặc điểm hình thái gi ữa các mẫu thu hái được với đặc điểm trong khóa phân loại [14] và các tài liệu chính thống khác như Cây cỏ Việt Nam [10], Từ điển thực vật thông dụng [6], Từ điển cây thuốc [9], Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam [13] Từ đó giám định tên khoa học các mẫu thu hái được

- Làm vi phẫu rễ, thân, lá, mô tả đ ặc điểm giải phẫu của mẫu nghiên cứu

2.2.2 Thử hoạt tính sinh học

- Mẫu tươi các bộ phận trên mặt đất của 2 mẫu cây Nút áo mọc phổ biến được thu hái tại huyện Yên Định, tỉnh Thanh Hóa để thử hoạt tính sinh học (V, L)

- Thử tác dụng ức chế vi khuẩn Streptococcus mutans của các dịch chiết mẫu

nghiên cứu trên Lựa chọn mẫu cây có hoạt tính cao để nghiên cứu thành phần hóa học

2.2.3 Định tính các thành phần hóa học và phân l ập một các thành phần hóa học trong mẫu cây Nút áo có hoạt tính

- Định tính các thành phần trong dịch chiết cụm hoa Nút áo mẫu V

- Chiết xuất tinh dầu trong cụm hoa và sử dụng phương pháp sắc kí khí khối phổ liên hợp để xác định thành phần của tinh dầu

- Chiết phân đoạn dịch chiết cồn và sử dụng sắc kí cột để phân lập các thành phần; đo phổ NMR để xác định cấu trúc hóa học của thành phần đó

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật

- Phương pháp: mô tả phân tích và so sánh hình thái

- Tài liệu khóa phân loại trong Thực vật chí Việt Nam [14] và các tài liệu chuyên sâu về thực vật như: Cây cỏ Việt Nam [10], Từ điển thực vật thông dụng [6], Từ điển cây thuốc [9], Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam [13]… để xác

định tên khoa học

- Tiến hành phân tích đặc điểm vi phẫu các cơ quan dinh dưỡng của cây: làm tiêu bản vi học [2], quan sát đặc điểm cấu tạo vi phẫu trên kính hiển vi, chụp ảnh và

mô tả đặc điểm

2.3.3 Thử hoạt tính sinh học dịch chiết bộ phận trên mặt đất cây Nút áo

 Mẫu vật: phần trên mặt đất (thân, lá và hoa) c ủa cây Nút áo thu hái tại huyện

Yên Định, Thanh Hóa

 Chủng thử: Vi khuẩn Streptococcus mutans ATCC 700610 được phân lập tại

khoa Sinh, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

 Phương pháp thử: phương pháp khuếch tán đường ngang trên đĩa thạch đục lỗ

 Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch thường, điều chỉnh pH 7,4 – 7,6

Công thức môi trường:

 Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy: Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 28oC trong 24h

 Tiệt trùng dụng cụ và môi trường:

- Dụng cụ: sấy tiệt trùng ở nhiệt độ 130oC trong 2h

- Môi trường: hấp tiệt trùng ở 121oc trong 15 phút

- Buồng cấy: lau cồn và bật quạt gió một chiều

 Với mỗi mẫu làm trên 30 giếng thạch và tiến hành thử lặp lại 3 lần Như vậy tổng số lần lặp lại trên mẫu là 90 lần

 Chất chuẩn đối chứng: Gentamycin 80mg/2ml (theo quy định của Dược điển Việt Nam IV)

 Xử lý kết quả: đường kính vòng vô khuẩn được đo bằng thước kẹp có độ chính xác 0,02 mm và được xử lý như sau:

- Tính đường kính trung bình vòng vô khuẩn:

 =

- Xây dựng đường đáp ứng của Gentamycin với chủng vi sinh vật:

 Từ đó tính được hoạt tính kháng khuẩn của chất thử so với Gentamycin

 Quy trình thử: hoạt tính kháng khuẩn được thử theo quy trình 12 bước

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thử hoạt tính kháng Vi sinh vật

Chuẩn bị dụng cụ

Chuẩn bị môi trường giữ giống

Giữ giống vi sinh vật

Chế tạo nhũ dịch cấy truyền cho thử nghiệ m

Pha nhũ dịch VSV vào môi trường dinh dưỡng

Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng

Phân tán môi trường có VSV ra các đĩa Petri

Cho khuếch tán các dịch thử nghiệ m

Ủ các khay thí nghiệ m trong tủ

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.2.1 Chiết xuất các thành phần trong cụm hoa

Phương pháp: Ngâm lạnh

- Sấy dược liệu ở 60oC trong vòng 4 giờ

- Nghiền nhỏ dược liệu (sử dụng thuyền tán)

- Cân khoảng 500g dược liệu đã được nghiền nhỏ

- Thấm ẩm bằng 300ml cồn 90o trong khoảng 20 phút

- Ngâm với dung môi cồn 90o trong bình ngâm

2.3.2.2 Định tính các thành phần hóa học trong dịch chiết cụm hoa

Định tính bằng phản ứng hóa học:

- Sử dụng dịch chiết để định tính các nhóm chất thường gặp trong cụm hoa: glycoside tim, saponin, anthranoid, flavonoid, coumarin, tannin, alkaloid, sterol theo tài liệu Thực tập Dược liệu (Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc (Nguyễn Viết Đàn, Nguyễn Viết Tựu)

2.3.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu cất từ cụm hoa

Phương pháp cất kéo hơi nước [4]

- Tinh dầu được cất bằng bộ dụng cụ theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III

- Thể tích tinh dầu được tính bằng ml, độ ẩm dược liệu được tính bằng phương pháp cân

- Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu được tính theo công thức sau:

X% =

Với : X là hàm lượng phần trăm tinh dầu (ml/g)

a là thể tích tinh dầu đọc được sau khi cất (ml)

b là khối lượng dược liệu đã trừ độ ẩm (g)

Định tính và định lượng các thành phần có trong tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ liên hợp (GC-MS)

2.3.2.4 Phân lập và xác định một số thành phần chính trong cụm hoa

- Cô dịch chiết cồn 90o dưới áp suất giảm, thu được cắn M Cân cắn M để xác định khối lượng

- Hòa cắn trong một lượng nước, đun nóng nhẹ (<50oC) Chiết phân bố lần lượt với các dung môi chloroform, ethyl acetate Bay hơi (hoặc cất thu hồi) dung môi của các dịch chiết lần lượt thu được cắn A (trong CHCl3) , cắn B (trong EtOAc) và cắn C (trong nước)

- Định tính lại các cắn bằng phương pháp hóa học và bằng sắc kí lớp mỏng

- Phân lập các cắn bằng sắc kí cột silicagel [5], lựa chọn hệ dung môi phù hợp cho kết quả tách tốt nhất dựa vào việc chấm thử các phân đoạn trên bản mỏng tráng sẵn silicagel (Merck)

 Bản mỏng: silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn, được ho ạt hóa ở 110oC trong 1h, bảo quản trong bình hút ẩm có chứa các hạt silicagel

 Dung môi khai triển: thăm dò trên các hệ dung môi

 Tiến hành: chấm dịch chiết lên bản mỏng (chấm dưới một nguồ n nhiệt-sử dụng máy sấy) Cho vào bình s ắc kí đã bão hòa dung môi Sau khi khai triển lấy bản mỏng ra và s ấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi Quan sát vết dưới ánh sáng thường, ánh sáng UV ở 2 bước sóng 366nm, 254nm

 Cột sắc kí: cột có đường kính 3,5cm (cột lớn), 2,5 cm (cột nhỡ), 1cm (cột nhỏ), dài 50-60cm, chất nhồi là silicagel (dạng hạt mịn 15-40m)

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được bằng các phương pháp đo phổ MS, NMR

PHẦN 3- THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ B ÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1.1 NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT

3.1.1.1 Đặc điểm thực vật các mẫu nghiên cứu

Thực hiện nghiên c ứu đặc điểm thực vật của cả 3 mẫu thu hái được (hình 3.1, 3.5) Từng mẫu được mô tả như sau:

a Đặc điểm thực vật mẫu Spilanthes sp 1 (V)

Cây cỏ, sống hàng năm, cao khoảng 20-50cm Thân nằm, rồi đứng, màu tía

Lá mọc đối, phiến lá hình tam giác, rộng 3-5cm, dài 5-6cm mép lá răng cưa Gân lá gồm có 3 gân chính từ gốc và 5 cặp gân phụ Cuống lá dài 1-1,5cm (hình 3.4)

Cụm hoa đầu đơn độc ở ngọn nhánh, cuống cụm hoa tương đối ngắn 2cm, đế cụm hoa có hình nón nhọn cao 5-7mm, đường kính mặt cắt ngang cụm hoa kho ảng 5-7mm Tổng bao lá bắc có 2 hàng lá Hoa hình lưỡi nhỏ ở bên ngoài, hoa hình ống ở giữa Hoa có màu vàng, hoa cái hình lưỡi nhỏ dài 5-6 mm, hoa lưỡng tính hình ống dài 4-5mm Bộ nhị 5, chỉ nhị rời và đính vào ống tràng Bao phấn dính lại với nhau thành một ống, mở bằng khe nứt dọc vào phía trong Bộ nhụy có 2

1,5-lá noãn dính nhau thành bầu dưới (hình 3.7)

b Đặc điểm thực vật mẫu Spilanthes sp 2 (L)

Cây cỏ, sống hàng năm, cao kho ảng 30-60cm, mọc đứng, có khi mọc bò lan trên mặt đất, phân thành nhiều cành Lá mọc đối, phiến xoan tam giác hoặc hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 3-7 cm, rộng 1-3cm, gốc hơi thuôn, đầu nhọn, mép có răng cưa to hay hơi lượn sóng, gân chính 3, cuống dài 1,5-2cm (hình 3.4)

Cụm hoa đầu mọc ở ngọn thân hay ở nách lá, cuống cụ mhoa dài khoảng 12

cm, cụm hoa hình nón nhọn, cao 9-11mm, đường kính 5-7mm Tổng bao có lá bắc

hình bầu dục nhọn đầu Hoa hình lưỡi nhỏ ở bên ngoài, hoa hình ống ở giữa Đài là

2 răng cứng Tràng hoa màu vàng, tràng hoa hình lưỡi dài 5-6mm, tràng hoa hình ống dài 3-4mm cao 4-6mm Bộ nhị 5, chỉ nhị rời Bao phấn có phần phụ hình tam giác, hơi có tai ở gốc, bầu gần bầu dục, có lông Bộ nhụy có 2 lá noãn dính nhau thành bầu dưới 1 ô (hình 3.8)

c Đặc điểm thực vật mẫu Spilanthes sp 3 (T)

Cây cỏ, cao đến 1m Thân màu xanh, mọc đứng hoặc bò lan Lá có phiến thon, rộng 1-1,5cm, dài 3-5cm, chót nhọn, mép có răng, gân phụ 5 cặp với 1 cặp to, cuống dài 2-5cm (hình 3.4)

Cụm hoa đầu, mọc đầu cành, trên cuống cụm hoa dài 5-10cm Cụm hoa cao 8-9mm, đường kính 4-5mm Đế cụm hoa hình nón nhọn, cao 4-6 mm Tổ ng bao lá bắc với 3 hàng lá, cao 2,5-3mm, không lông hoặc có lông, hoa hình lưỡi nhỏ bên ngoài là hoa cái dài 3-4mm, hoa hình ống ở giữa là hoa lưỡng tính, dài 2-3mm Bộ nhị 5, chỉ nhị rời và đính vào ống tràng Bao phấn đính gốc, dính lại với nhau thành một ống, mở bằng khe nứt dọc vào phía trong Bộ nhụy có 2 lá noãn dính nhau

thành bầu dưới 1 ô (hình 3.9)

Hình 3.4 Hình thái cụm hoa các mẫu Nút áo

1 Cụm hoa có cuống, 2 Cụm hoa phóng to,

3 Cụm hoa cắt dọc, 4 Cụm hoa cắt ngang

Hình 3.5 Hình thái hoa Spilanthes sp1 (V)chụp qua kính lúp soi nổi

1 Hoa lưỡi nhỏ, 2 Hoa hình ống, 3 Đế hoa, 4 Đế hoa cắt dọc

5.Nhị hoa, 6 Đế hoa cắt ngang, 7 Bầu hoa cắt ngang, 8 Đài hoa

(ô vuông nền có kích thước 1x1 mm)

Hình 3.6 Ảnh hình thái hoa Spilanthes sp2 (L) chụp qua kính lúp soi nổi

1 Hoa lưỡi nhỏ, 2 Hoa hình ống, 3 Đài hoa, 4 Đế hoa, 5 Nhị , 6 Nhụy (ô

vuông nền có kích thước 1x1 mm)

Hình 3.7 Ảnh hình thái hoa Spilanthes sp3 (T) chụp qua kính lúp soi nổi

1 Hoa lưỡi nhỏ, 2 Hoa hình ống, 3 Đế hoa, 4 Nhụy, 5 Nhị

(ô vuông nền có kích thước 1x1 mm)

3.1.1.2 Giám định tên khoa học các mẫu nghiên cứu

Qua quan sát, mô tả và phân tích các đặc điểm hình thái thực vật, đối chiếu với các khóa phân loại thực vật hiện có [6], [7], [9], [10], [13], [59], được sự giúp đỡ của Tiến sĩ Hoàng Quỳnh Hoa, mẫu dùng nghiên cứu được giám định tên khoa học là:

- Mẫu V: Spilanthes oleracea L., họ Cúc (Asteraceae)

- Mẫu L: Spilanthes acmella L Murr., họ Cúc (Asteraceae)

- Mẫu T: Spilanthes grandiflora Turcz., họ Cúc (Asteraceae)

3.1.1.3 Đặc điểm vi phẫu cơ quan sinh dƣỡng các mẫu nghiên cứu

Nhìn chung, các bộ phận rễ, thân và lá c ủa 3 mẫu nghiên cứu có nhiều đặc điểm tương đồng Một số bộ phận có các đặc điểm phân biệt với nhau giữa các mẫu nghiên cứu Đặc điểm vi học được mô tả như sau:

vỏ gồm một vài lớp tế bào có màng mỏng, xếp không đều, có các khoảng gian bào

Kế đến là bó libe-gỗ gồm có libe cấp 2 bắt màu hồng nằm bên ngoài và gỗ cấp 2 bắt màu xanh ở bên trong, ở giữa là tầng phát sinh libe-gỗ Trong cùng là mô mềm ruột (hình 3.8)

Phần mô mềm vỏ của mẫu V và T có khoảng không gian gi ữa các tế bào khá

lớn, mẫu SA các tế bào xếp xít nhau hơn

b Vi phẫu thân:

Cắt ngang thân các mẫu nghiên cứu, quan sát tiêu bản vi phẫu thân, nhận thấy mặt cắt thân tròn, từ ngoài vào trong có: biểu bì là một hàng tế bào xếp đều đặn, bắt màu xanh; mô dày là những tế bào sống xếp xít nhau, đều đặn, bắt màu hồng; mô

mềm vỏ gồm những lớp tế bào thành mỏng, bắt màu hồng; các bó libe-gỗ xếp thành vòng liên tục, các sợi libe bắt màu xanh và mô mềm libe bắt màu đỏ ở bên ngoài, gỗ

ở phía trong bắt màu xanh; trong cùng là mô mềm ruột (hình 3.9)

Phía bên ngoài thân mẫu L có lông che chở; ở bên trong, mô mềm vỏ là những

tế bào khá thưa thớt, không thấy có sợi libe như 2 mẫu V và T mà chỉ có mô mềm libe bắt màu đỏ

c Vi phẫu lá:

Quan sát tiêu bản vi phẫu lá các mẫu nghiên cứu, nhận thấy cấu tạo chung c ủa

3 mẫu như sau:

Cấu tạo phiến lá từ dưới lên trên bao gồm các phần: biểu bì dưới là một hàng tế bào nhỏ xếp xít nhau Tiếp theo là mô khuyết có cấu tạo bởi những tế bào không đều, để hở những khoảng trống Phía dưới biểu bì trên là lớp mô giậu gồm 2 hàng tế bào dài xếp sát cạnh nhau như những cọc của một bờ giậu Biểu bì trên cấu tạo bởi một hàng tế bào hình chữ nhật

Gân lá lồi ở cả 2 mặt Ngoài cùng là lớp biểu bì trên và biểu bì dưới được cấu tạo bởi những tế bào kéo dài theo chiều dọc của gân, trên lớp biểu bì có các lông che chở Dưới biểu bì là lớp mô dày làm nhiệm vụ nâng đỡ Phía trong lớp mô dày là mô mềm Ở giữa có các bó libe-gỗ, các bó libe-gỗ xếp thành vòng cung (Hình 3.10)

1 Bần, 2 Mô dày, 3 Mô mềm vỏ, 4 Libe cấp 2

5 Tầng phát sinh libe-gỗ, 6.Gỗ cấp 2, 7 Mô mềm ruột

1 2

1 Biểu bì, 2 Mô dày, 3 Mô mềm vỏ, 4 Sợi libe,

5 Mô mềm libe, 6 Gỗ, 7 Mô mềm ruột, 8 Lông che chở

Hình 3.10 Hình ảnh vi phẫu lá Nút áo 3.1.2 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT CÁC PHẦN TRÊN

MẶT ĐẤT CỦA CÂY NÚT ÁO

- Do loài Spilanthes grandiflora Turcz (T) không phải là loài phổ biến nên số

lượng mẫu thu hái được nhỏ Vì thế, đề tài này chỉ tiến hành thử hoạt tính sinh

học của 2 loài Spilanthes oleracea L Murr (V) và Spilanthes acmella L (L)

- Các mẫu lá và thân ở các nồng độ khác nhau không có tác dụng trên chủng

Streptococcus mutans Các mẫu hoa có tác dụng khá tốt trên chủng vi khuẩn gây

sâu răng này Kết quả được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.11 (mẫu SOH (1:1)

do sơ suất trong quá trình cô dịch chiết đã bị hỏng)

1 Lông che chở, 2 Biểu bì trên, 3 Mô giậu, 4 Mô khuyết,

5 Biểu bì dưới, 6 Mô mềm, 7 Libe, 8 Gỗ, 9 Mô dày,10.Biểu bì gân lá

Bảng 3.1 Đường kính trung bình vòng vô khuẩn các mẫu thử

Nhận xét: Tất cả các mẫu hoa của 2 loài thử đều có tác dụng trên chủng

Streptococcus mutans Trong đó, mẫu VH với tỉ lệ 1:2 thể hiện khả năng kháng

khuẩn mạnh nhất với đường kính vòng vô khuẩn trung bình là 7,28 mm Mẫu LH

với tỉ lệ 1:3 ức chế chủng Streptococcus mutans kém nhất với đường kính vòng vô

khuẩn trung bình là 6.21 mm Mẫu VH ở tỉ lệ 1:2 đã thể hiện hoạt tính mạnh hơn mẫu LH ở tỉ lệ 1:3 Điều đó chứng tỏ hoa của loài V là có ho ạt tính mạnh nhất trong 2 loài

Vì vậy mẫu VH (1:2) được đưa vào thí nghiệm tiếp theo so sánh với tác dụng của Gentamyin Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.12

a b

Hình 3.12 Hình ảnh đĩa thạch thử VH và Gentamycin

a Gentamycin 80mg/2ml, b Gentamycin 4mg/ml

Bảng 3.2 Đường kính trung bình vòng vô khuẩn mẫu thử và Gentamycin

Mẫu thử Đường kính vòng vô khuẩn trung bình (mm)