Phân đoạn/cắn Số peak Phân đoạn/cắn Số peak
M 28 B 29
A 26 C 25
Nhận xét: Các cắn A, B, C đều có khả năng tách với hệ dung môi CHCl3 – MeOH (9:1). Riêng với c ắn A có thể khai triển tiếp với sắc kí cột để phân lập chất bằng hệ dung môi trên.
Khảo sát thêm các hệ dung môi trên cắn A: chấm sắc kí lớp mỏng cắn A trong MeOH các hệ dung môi sau:
- CHCl3 – MeOH (9:1) - CHCl3 – EtOAc (1:1) - n-Hexan – EtOAc (3:1)
Kết quả: với hệ khả năng tách của A tốt hơn với các hệ còn lại (4 vết nhìn thấy dưới ánh sáng thường)
Thực hiện khai triển tiếp cắn A với hệ CHCl3 – MeOH nhưng gradient nồng độ các thành phần trong hệ dung môi (tăng dần độ phân cực) để đánh giá khả năng tách chất:
- CHCl3 – MeOH (85:15) - CHCl3 – MeOH (80:20) - CHCl3 – MeOH (75:25)
Kết quả: khả năng tách c ủa cắn A tăng dần theo độ phân cực của hệ dung môi. Do đó có thể lựa chọn cắn A thực hiện chạy cột sắc kí để phân lập một số chất trong dược liệu. Hệ dung môi tốt nhất để chạy cột sắc kí là CHCl3 – MeOH.
3.1.3.4. Phân lập các chất bằng phƣơng pháp sắc kí cột
a. Lần 1: chạy sắc kí cột lớn (Chiều cao cột 50cm, đường kính 3,5 cm) Ổn định cột với dung môi CHCl3 rồi thêm dần MeOH để rửa giải dần.
Các phân đoạn hứng được gộp lại ở các phân đoạn giống nhau và kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi n-Hexan – EtOAc (3:1) (có acid hóa bởi dd acid formic) để đánh giá khả năng tách. Kết quả được trình bày trong hình 3.16.
Xem xét khả năng tách cũng như khối lượng của các cắn phân đoạn, nhận thấy phân đoạn gộp A20 (m=0,38g) có thể triển khai tiếp với hệ dung môi n- Hexan-EtOAc.
b. Lần 2: chạy sắc kí cột nhỡ (Chiều cao cột là 50 cm, đường kính 2,5 cm) Ổn định cột bằng n-Hexan rồi khai triển tiếp bằng việc thêm dần EtOAc. Khối lượng các phân đoạn rất nhỏ nên không thực hiện xác định khối lượng. Thực hiện chấm SKLM lại các phân đoạn đã gộp với hệ dung môi khai triển là : n-Hexan: EtOAc (6:2, acid hóa bởi 2 giọt acid formic). Kết quả được trình bày trong hình 3.17.
a
b
Hình 3.16. Hình ảnh SKLM các phân đoạn gộp lần 1 với hệ dung môi n-Hexan – EtOAc (3:1)
a. UV 254 nm, b. UV 366 nm
a b
Hình 3.17.Hình ảnh SKLM các phân đoạn gộp lần 2 với hệ dung môi n-Hexan: EtOAc (3:1) a.UV 254 nm, b. UV 366 nm
Xem xét khả năng tách nhận thấy phân đoạn A20.4 có khả năng tốt nhất. Thực hiện chấm SKLM phân đoạn này với các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn hệ dung môi chạy cột lần 3 và hệ dung môi được lựa chọn là CH2Cl2 – EtOAc (3:1) (acid hóa bởi HCOOH) thì phân đoạn A20.4 tách tương đối tốt.
Khảo sát thêm hệ này với tỉ lệ khác nhau các thành phần nhận thấy khi tăng độ phân cực (tăng EtOAc) thì vết ra chậm hơn. Do đó sử dụng EtOAc để ổn định cột, sau đó tăng dần thành phần CH2Cl2 trong hệ lên để rửa giải dần chất ra. c. Kết quả chạy cột lần 3 (cột nhỏ có chiều dài 50cm, đường kính 1cm, ban đầu ổn định cột bằng EtOAc rồi khai triển bằng cách thêm dần CH2Cl2): thu được 7 phân đoạn A20.4.1, A20.4.2, A20.4.3, A20.4.4, A20.4.5 , A20.4.6, A20.4.7
Thực hiện chấm lại SKLM các phân đoạn trên với hệ 3 dung môi n-Hexan – EtOAc (1:1), CHCl3 – MeOH (9:1), CH2Cl2 – EtOAc – HCOOH (1:1:0,015) nhận thấy phân đoạn A20.4.6 vết lên rõ nhất và chỉ có 1 vết.
a b c
Hình 3.18. Hình ảnh SKLM phân đoạn A20.4.6
3.1.3.5. Nhận dạng chất phân lập đƣợc (A20.4.6)
Hợp chất 20.4.6 là bột kết tinh trắng. Phổ 1
H-NMR xuất hiện tín hiệu của một nối đôi nội vòng thế ba lần tại 5,37 (br d, J = 5,1 Hz, H-6), một tín hiệu của một nhóm oxymethin tại 3,54 (tt, J = 5,1, 11,7 Hz, H-3), hai tín hiệu singlet cộng hưởng ở vùng trường cao tại 0,68 (3H, s, H-18) và 1,01 (3H, s, H-19) đặc trưng cho hai nhóm metyl bậc ba. Ngoài ra, phổ proton còn xuất hiện ba tín hiệu doublet với mỗi tín hiệu có cường độ tích phân tương ứng là 3H tại 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,83 (3H, d, J = 7,3 Hz, H-26), 0,81 (3H, d, J = 6,8 Hz, H-27), và một tín hiệu triplet tại 0,84 (3H, t, J =7,5 Hz, H-29) của một nhóm methyl bậc một. Các dữ liệu này rất giống với cấu trúc của hợp chất -sitosterol [28].
Phổ 13
C-NMR xuất hiện tín hiệu của 29 nguyên tử carbon, trong đó nối đôi thế ba lần nội vòng được xác định tại 141,17 (s, C-5) và 122,50 (d, C-6), một carbon oxymethin tại 72,19 (d, C-3) cùng với 6 tín hiệu của 6 nhóm methyl. Các dữ liệu này cũng phù hợp với dự đoán được phân tích qua phổ 1
H-NMR.
Khi so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố cho hợp chất -sitosterol, nhận thấy các dữ liệu phù hợp hoàn toàn (phụ lục 6). Do đó, sơ bộ kết luận hợp chất 20.4.6 là -sitosterol. Công thức cấu tạo được trình bày trong hình 3.19 và bảng
3.9. 2 1 6 19 22 24 HO 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 21 23 25 26 27 28 29