Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Lục thảo hoa thưa (Chlophytum laxum R. Br.), họ Lục thảo (Anthericaceae)
Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế Trờng đại học dợc h nội Nguyễn thị hoi Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thnh phần hoá học v số tác dụng sinh học lục thảo hoa tha (Chlorophytum laxum R Br.), họ lục thảo (Anthericaceae) Chuyên ngành: dợc liệu - dợc học cổ truYền Mà số: 62.73.10.01 Tóm tắt Luận án tiến sĩ dợc học H nội - 2008 Công trình đ hon thnh tại: Trờng Đại học Dợc Hà Nội, Trờng Đại học Y - Dợc Huế, Viện công trình đ công bố Khoa học - Công nghệ Việt Nam, Viện Dợc liệu liên quan đến luận án Nguyễn Thị Hoài, Phạm Thanh Kỳ, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm (2007), Các hợp chất flavonoid từ Lục thảo hoa tha Ngời hớng dÉn khoa häc: GS TS Ph¹m Thanh Kú (Chlorophytum laxum R Br Anthericaceae), Tạp chí dợc học, số 372, tr 29-32 Nguyễn Thị Hoài, Phạm Thanh Kỳ, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm (2007), Nghiên cứu thành phần hoá học rễ Lục thảo hoa Phản biện 1: GS TSKH Phan Tống Sơn Phản biện 2: GS TSKH Hoàng Tích Huyền tha, Tạp chí dợc liệu, tập 12, số 3+4, tr 95-100 Nguyễn Thị Hoài, Phạm Thanh Kỳ (2007), Nghiên cứu đặc điểm thực vật Lục thảo hoa tha Chlorophytum laxum R Br., Tạp chí Phản biện 3: GS TS Là Đình Mỡi dợc học, số 376, tr 9-11 Nguyen Thi Hoai, Pham Thanh Ky, Chau Van Minh, Phan Van Kiem (2007), A new derivative of furancarboxaldehyde from Luận án đợc bảo vệ trớc hội đồng chấm luận án cấp nhà nớc 45, số đặc biệt, tr.131-135 họp Trờng Đại học Dợc Hà Nội Vào hồi giờ, ngày 04 tháng Chlorophytum laxum R Br (Anthericaceae), Tạp chí hóa học, tập năm 2008 Nguyễn Thị Hoài, Phạm Thanh Kỳ (2008), Nghiên cứu độc tính cấp tác dụng gây độc tế bào rễ Lục thảo hoa tha (Chlorophytum laxum R Br., Anthericaceae), Tạp chí thông tin y dợc, số 4, tr 31-34 Có thể tìm đọc luận án tại: - Th viện Quốc gia Hà Nội - Th viện Trờng Đại học Dợc Hà Nội - Th viện Trờng Đại học Y - Dợc Huế 24 ã Đà xác định hàm lợng 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd phân đoạn chiết cloroform rễ 14,88% rễ khô 0,17% Về tác dụng sinh học ã liều uống 120g dợc liệu/kg chuột, cao gấp 34 51 lần so với liều dùng rễ khô theo kinh nghiệm ngời dân địa phơng không gây biểu bất thờng không gây chết chuột nhắt trắng thí nghiệm 72 theo dõi, không xác định đợc LD50 ã Hợp chất 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd ức chÕ chđng vi khn thư nghiƯm ë nång ®é 500cg/ml Cũng nồng độ Cirsiumaldehyd Chlorophaldehyd [= 5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd] øc chÕ vµ chđng vi khn thư nghiệm ã Hợp chất 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd, Cirsiumaldehyd Chlorophaldehyd [= 5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd] hoạt tính kháng nấm Candida albicans Aspergilus niger ã Cao nớc (1:1) rễ Lục thảo hoa tha có tác dụng làm tăng cân nhng tác dụng tăng lực nghiệm pháp chuột bơi cỡng với liều thí nghiệm ã Hợp chất Quercetin-3-O--L-rhamnopyranosid có tác dụng chống oxy hoá hệ DPPH với 55,57 0,2% khả quét gốc tự giá trị IC50 39,33g/ml ã Methyl caffeat có khả gây độc cho dòng tế bào ung th− gan, ung th− mµng tim vµ ung th− phổi thử nghiệm invitro với giá trị IC50 lần lợt 0,19, 0,55 2,6g/ml phần trăm tế bµo sèng sãt sau thư nghiƯm lµ 0,00, 12,9 vµ 33,9% Hợp chất 1,2-Di-O-(9Z,12Z-octade catrienoyl)-3-O-D-galactopyranosylglycerol có tác dụng với giá trị IC50 1,4 1,33g/ml phần trăm tế bµo sèng sãt sau thư nghiƯm lµ 10,8 vµ 12,4% ®èi víi tÕ bµo ung th− gan vµ ung th− màng tim ã Đề nghị: Tiếp tục nghiên cứu độc tính bán trờng diễn tác dụng sinh học để giải thích đầy đủ cách sử dụng nhân dân địa phơng cho phụ nữ sau sinh nghiên cứu sâu tác dụng ức chế tế bào ung th hợp chất phân lập đợc từ dợc liệu A Giới thiệu luận án Đặt vấn đề Nớc ta có nguồn dợc liệu vô phong phú, tri thức sử dụng thuốc nhân dân ta đa dạng, đặc biệt tri thức sử dụng thuốc địa đồng bào dân tộc ngời Lục thảo hoa tha (Chlorophytum laxum R Br.) thuộc họ Lục thảo (Anthericaceae) (tên địa phơng gọi ngải) thuốc đợc đồng bào dân tộc Kà Tu, Tà ôi Pa cô xà A Roàng, A Đớt, huyện A Lới, tỉnh Thừa Thiên Huế thờng sử dụng cho phụ nữ sau sinh ®Ĩ phơc håi søc kháe nhanh, sím trë lại với công việc Theo Võ Văn Chi, Lục thảo hoa tha có vị đắng, tính mát, có tác dụng nhiệt giải độc, tiêu thũng, thống, dùng trị rắn cắn, đòn ngà sng đau Cho đến Việt Nam cha thấy có công trình nghiên cứu Lục thảo hoa tha Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học Lục thảo hoa tha (Chlorophytum laxum R Br.), họ Lục thảo (Anthericaceae). đà đợc tiến hành nhằm tạo sở khoa học cho việc sử dụng thuốc, góp phần tạo nguồn dợc liệu Mục tiêu nội dung luận án: 2.1 Mục tiêu luận án: Xác định đặc điểm thực vật, định tên khoa học, nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học dợc liệu nghiên cứu 2.2 Nội dung luận án: ã Về thực vật: o Mô tả đặc điểm hình thái, xác định tên khoa học nghiên cứu o Xác định đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột dợc liệu ã Về thành phần hoá học: o Định tính, định lợng số nhóm chất dợc liệu o Chiết xuất, phân lập số chất o Xác định cấu trúc chất phân lập đợc ã Về tác dụng sinh học: o Xác định ®éc tÝnh cÊp 2 Thư mét sè t¸c dơng sinh học: tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, tăng lực, chống oxy hoá gây độc tế bào ý nghĩa luận án: Đây lần Lục thảo hoa tha mọc Việt Nam đợc nghiên cứu thực vật, thành phần hoá học tác dụng sinh học - Xác định tên khoa học đà giúp cho kết nghiên cứu hoá học tác dụng sinh học đợc khẳng định rõ nguồn gốc - Xác định đặc điểm vi học góp phần nhận biết tiêu chuẩn hoá dợc liệu - Kết nghiên cứu thành phần hoá học đà phát hợp chất đợc phân lập từ tự nhiên hợp chất lần đợc phân lập từ loài Chlorophytum laxum R Br - Kết nghiên cứu độc tính tác dụng sinh học chứng minh dợc liệu độc, đà góp phần giải thích kinh nghiệm sử dụng ngời dân địa phơng sở khoa học mở triển vọng nghiên cứu đầy đủ để sử dụng rộng rÃi dợc liệu cộng đồng Những đóng góp luận án: 4.1 Về thực vật: Đà xác định tên khoa học nghiên cứu, mô tả chi tiết đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học dợc liệu 4.2 Về hoá học: - Đà xác định thành phần hoá học rễ Lục thảo hoa th−a cã c¸c nhãm chÊt: alcaloid, saponin, anthranoid, acid amin, tanin, phytosterol, polysaccharid chất béo; có: alcaloid, saponin, coumarin, flavonoid, acid hữu cơ, carotenoid, acid amin, tanin, phytosterol chất béo - Đà định lợng 15 nguyên tố vô có rễ Lục thảo hoa tha - Đà phân lập xác định cấu trúc đợc 14 chất, bao gồm chất từ lá, chất từ rễ, chất có rễ, có: + chất lần đợc phân lập từ tự nhiên là: 7-C-[β-Dglucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl]-6-O-β-D-glucopyranosyloxy4',8-dihydroxyflavon; 5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd; β-sitosterol3-O-(6'-O-hexadecanoyl)-β-D-galactopyranosid 23 o kÕt luËn VÒ thùc vật - Đà xác định tên khoa học Lục thảo hoa tha thu hái A Lới (Thừa Thiên Huế) để nghiên cứu Chlorophytum laxum R Br họ Lục thảo (Anthericaceae) - Đà xác định đặc điểm vi phẫu rễ, đặc điểm bột phần mặt đất bột rễ Lục thảo hoa tha Về thành phần hóa học ã Đà xác định Lục thảo hoa tha có: alcaloid, saponin, coumarin, flavonoid, acid hữu cơ, carotenoid, acid amin, tanin, phytosterol, chất bÐo vµ rƠ cã: alcaloid, saponin, anthranoid, acid amin, tanin, phytosterol, polysaccharid chất béo ã Đà xác định 15 nguyên tố vô có rễ Lục thảo hoa tha ã Đà phân lập đợc chất từ Lục thảo hoa tha, có: chất lần phân lập từ thiên nhiên: 7-C-[-D-glucopyranosyl-(12)--D-glucopyranosyl]-6-O--Dglucopyranosyloxy-4',8-dihydroxyflavon (Laxuminosid) chất lần phân lập từ Lục thảo hoa tha: Quercetin-3-O--Dglucopyranosid; Quercetin-3-O--L-rhamnopyranosid; Quercetin-3-O-L-rhamnopyranosyl-(16)--D-glucopyranosid; 5-hydroxymethyl-2furancarboxaldehyd ã Đà phân lập đợc chất từ rễ Lục thảo hoa tha, có: chất lần phân lập từ thiên nhiên: 5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd (Chlorophaldehyd) -sitosterol-3-O-(6'-O-hexadecanoyl)--D-galactopyranosid (Laxosid) chất lần phân lập từ Lục thảo hoa th−a: 5-hydroxymethyl-2furancarboxaldehyd; Cirsiumaldehyd hay bis(5-formylfurfuryl) ether; 1,5Dihydroxy-3-hydroxymethylanthraquinon (ω-hydroxyziganein); Acid chrysophanic; Stigmast-5-en-3-ol; Methyl caffeat; 1,2-Di-O-(9Z,12Zoctadecatrienoyl)-3-O--galactopyranosylglycerol 22 Các kết nghiên cứu thành phần hoá học đóng gãp míi cđa ln ¸n 4.3 VỊ t¸c dơng sinh học: Kết thử độc tính cấp với liều cao cho chuột uống đợc 120g dợc liệu/kg t.t.chuột, cao gấp 34 51 lần so với liều dùng rễ khô theo kinh nghiệm ngời dân địa phơng nhng không xác định đợc LD50 cđa mÉu thư, cho thÊy liỊu dïng theo kinh nghiệm ngời dân an toàn Tác dụng kháng khuẩn đợc thử 10 chủng vi khuẩn gây bệnh thờng gặp Cả dẫn chất khung furan có khả ức chế phát triển vi khuẩn Kết cho thấy hợp chất có cấu trúc đơn gi¶n nhÊt øc chÕ nhiỊu chđng vi khn nhÊt, chÊt có nhóm phức tạp tác dụng ức chế số chủng vi khuẩn giảm Nh thấy liên quan cấu trúc tác dụng, cấu trúc cồng kềnh đà làm hạn chế khả ức chế vi khuẩn hợp chất thử Hợp chất đà đợc biết với tác dơng øc chÕ vi khn lao, kÕt qu¶ thÝ nghiƯm đà chứng minh có tác dụng nhiều chủng vi khuẩn khác, đóng góp luận ¸n T¸c dơng chèng oxy ho¸ trªn hƯ DPPH, c¸c flavonoid đợc phân lập có tác dụng mức độ khác Đây đóng góp ban đầu vỊ t¸c chèng oxy hãa cđa c¸c chÊt tinh khiÕt phân lập đợc từ loài Chlorophytum laxum R Br Kết thử nghiệm gây độc tế bào phù hợp với công bố tài liệu khả ngăn chặn phát triển số dòng tế bào ung th methyl caffeat 1,2-Di-O-(9Z,12Z-octadecatrienoyl)-3-O--Dgalactopyranosylglycerol Tuy nhiên thông báo cho biết khả gây độc cho dòng ung th bạch cầu, ung th mô đại thực bào, kết nghiên cứu luận án đà chứng minh hợp chất có tác dụng dòng tế bào ung th gan, ung th màng tim ung th phổi Tuy sơ nhng thông báo tác dụng sinh häc cđa Lơc th¶o hoa th−a ë ViƯt Nam, đặc biệt tác dụng số hợp chất đà phân lập dạng tinh khiết + 10 chất lần đợc phân lập từ Chlorophytum laxum R Br lµ: Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid; Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid; Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid; Cirsiumaldehyd hay bis(5-formylfurfuryl) ether; 5-hydroxymethyl-2furancarboxaldehyd; Acid chrysophanic; 1,5-dihydroxy-3hydroxymethylanthraquinon hay ω-hydroxyziganein; Stigmast-5-en-3β-ol; Methyl caffeat vµ 1,2-Di-O-(9Z,12Z-octadecatrienoyl)-3-O-β-Dgalactopyranosylglycerol - Đà xác định hàm lợng 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd phân đoạn chiÕt b»ng cloroform ë rƠ lµ 14,88% vµ rƠ khô 0,17% 4.3 Về tác dụng sinh học: Thử độc tính cấp rễ Lục thảo hoa tha liều 120g dợc liệu/kg t.t.chuột không thấy biểu ngộ độc Cao nớc rễ Lục thảo hoa tha liều 10-20g dợc liệu/kg t.t.chuột tác dụng tăng lực nghiệm pháp chuột bơi cỡng Ba hợp chất tinh khiết phân lập từ Lơc th¶o hoa th−a øc chÕ 6-9 chđng vi khn thư nghiƯm Mét dÉn chÊt flavonoid (hỵp chÊt 2) cã khả chống oxy hoá hệ DPPH Hai hợp chất (hợp chất 10) có khả ức chế 2-3 dòng tế bào ung th thực nghiệm giá trị IC50 thấp Những kết thông báo tác dụng sinh học Lục thảo hoa tha, đặc biệt tác dụng số hợp chất đà phân lập dạng tinh khiÕt Bè cơc cđa ln ¸n: Ln ¸n cã 122 trang, gồm chơng, 26 bảng, 34 hình, 120 tài liệu tham khảo 15 phụ lục Các phần luận án: đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (31 trang), nguyên vật liệu phơng pháp nghiên cứu (9 trang), kết thực nghiệm (61 trang), bàn luận (16 trang), kết luận đề nghị (3 trang) B Nội dung luận án Chơng 1: Tổng quan Tập hợp trình bày cách hệ thống kết nghiên cứu từ trớc đến thực vật, thành phần hoá học tác dụng sinh học chi Chlorophytum Ker-Gawl giới Việt nam 4 Chơng 2: Nguyên vật liệu v phơng pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu: Lá rễ Lục thảo hoa tha, thu hái huyện A Lới - tỉnh Thừa Thiên Huế vào tháng 9-10 năm 2004-2006, rửa sạch, sấy khô nhiệt độ 600C Chuột nhắt trắng chủng Swiss, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ơng cung cấp Giống vi sinh vật kiểm định Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Trờng Đại học Dợc Hà Nội cung cấp Các dòng tế bào ung th Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học Công nghệ cung cấp 2.2 Phơng pháp nghiên cứu: - Thẩm định tên khoa học nghiên cứu sở phân tích đặc điểm hình thái thực vật, so sánh với mẫu chuẩn lu trữ tài liệu phân loại thực vật - Xác định đặc điểm rễ, đặc điểm bột dợc liệu phơng pháp hiển vi - Định tính nhóm chất phản ứng hoá học - Định tính định lợng nguyên tố vô theo phơng pháp khối phổ plasma cảm ứng - Phân lập hợp chất sắc ký cét dïng silicagel pha th−êng (0,0400,063mm, Merck), silicagel pha ®¶o YMC (30-50 μm, FuJisilisa Chemical Ltd.), Dianion HP-20, Sephadex LH20 SKLM điều chế Theo dõi phân đoạn SKLM - Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đợc dựa thông số vật lý phơng pháp phổ: điểm chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối lợng, phổ cộng hởng từ hạt nhân chiều hai chiều - Định lợng thành phần sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), tách cột Inertsilđ ODS-3 (cột silicagel pha đảo RP18) - Thử độc tính cấp theo quy định 371 Bộ Y tế phơng pháp cải tiến Litchfield Wilcoxon 21 gây độc cho dòng tế bào ung th hợp chất 10 [1,2-Di-O(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-O--D-galactopyranosylglycerol] có khả gây độc cho dòng tế bào ung th gan ung th màng tim Trong hợp chất gây độc mạnh dòng tế bào ung th gan giá trị IC50 thấp (0,19g/ml), giá trị IC50 dòng tế bào ung th mµng tim vµ ung th− phỉi lµ 0,55 vµ 2,6μg/ml, mức độ độc tế bào vừa phải so sánh với chất đối chứng ellipticin Chơng 4: Bn ln vỊ kÕt qu¶ 4.1 VỊ thùc vËt: - ViƯc mô tả chi tiết đặc điểm thực vật đặc điểm vi học dợc liệu đà góp phần nhận biết tiêu chuẩn hoá dợc liệu - Việc xác định tên khoa học nghiên cứu đà giúp cho kết nghiên cứu thành phần hoá học tác dụng sinh học đợc khẳng định nguồn gốc nguyên liệu 4.2 Về thành phần hoá học: - Kết luận án đà xác định 10 nhóm chất hữu có lá, nhóm chất có rễ Lục thảo hoa tha 15 nguyên tố vô đợc xác định hàm lợng, kim loại nặng cã ®éc tÝnh nh− As, Pb ®Ịu n»m giíi hạn cho phép theo tiêu chuẩn WHO Sự có mặt Se đáng quan tâm - 14 hợp chất đà đợc phân lập lần từ Lục thảo hoa tha bao gồm: chất từ lá, chÊt tõ rƠ, chÊt cã ë c¶ rƠ Trong có hợp chất chất 4, chất 12 lần đợc phân lập từ tự nhiên, đề nghị gọi tên hợp chất {7-C-[-D-glucopyranosyl-(12)--D-glucopyranosyl]6-O--D-glucopyranosyloxy-4',8-dihydroxyflavon} Laxuminosid, hợp chất [5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd] Chlorophaldehyd hợp chất 12 [-sitosterol-3-O-(6'-O-hexadecanoyl)--D-galactopyranosid] Laxosid Các hợp chất phân lập đà đợc chứng minh có hoạt tính sinh học - Đà xác định hàm lợng 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd phân đoạn chiết cloroform rễ rễ khô góp phần xây dựng tiêu chuẩn dợc liệu sau 20 định Gr(-), hợp chất ức chÕ 4, hỵp chÊt øc chÕ 2, hỵp chÊt ức chế chủng Cả hợp chất 5, 6, tác dụng vi khn Pseudomonas aeruginosa vµ chđng nÊm Candida albicans, Aspergilus niger - Thư t¸c dơng kh¸ng khn, kh¸ng nÊm b»ng phơng pháp khuếch tán, đo vòng vô khuẩn đĩa thạch - Thử tác dụng tăng lực nghiệm pháp bơi cỡng bức, áp dụng phơng pháp Brekhman - Thử tác dụng chống oxy hoá invitro hệ DPPH - Thử tác dụng gây độc tế bào đợc tiến hành theo phơng pháp Likhitwitayawuid - Các số liệu thực nghiệm đợc xử lý theo phơng pháp thống kê sinh häc, sư dơng c«ng Data analysis cđa Microsoft Excel 3.3.3 Thử tác dụng tăng lực: Mẫu thử cao nớc 1:1 rễ Lục thảo hoa th−a Sau ngµy ng ë liỊu 10g vµ 20g dợc liệu/kg t.t.c đà làm tăng cân chuột thí nghiệm (8,3-12,0%), nh−ng sù kh¸c so víi chøng ch−a cã ý nghĩa thống kê (p>0,05) Cũng điều kiện thuốc tác dụng tăng lực mô hình chuột bơi cỡng Berkman Cả bốn mẫu thử giảm thời gian bơi so với lô chứng Khi dïng cao n−íc rƠ ë liỊu 10g d−ỵc liƯu/kg t.t.c cao nớc liều 20g dợc liệu/kg t.t.c giảm thời gian bơi không thực khác so với lô chứng (p>0,05) Tuy nhiên dùng cao nớc rễ liều 20g dợc liệu/kg t.t.c cao nớc liều 10g dợc liệu/kg t.t.c việc giảm thời gian bơi so với lô chứng có ý nghĩa thống kê (p