tóm tắt nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây gạo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HỒ THỊ THANH HUYỀN GẠO (Bombax malabaricum DC CHUYÊN NGÀNH: Dƣợc học cổ truyền MÃ SỐ: 62.72.04.06 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2014 CƠNG TRÌNH ĐÃ HỒN THÀNH TẠI: Trường Đại học Dược Hà Nội Trường Đại học Y Hà Nội Viện Hàn Lâm Khoa học-Công nghệ Việt Nam Trung tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thái An PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án cấp Trường tổ chức trường Đại học Dược Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2014 Có thể tìm đọc luận án tại: - Thư viện Quốc gia Hà Nội - Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Cây Gạo dân gian thường gọi với tên khác Mộc miên, vùng nông thôn miền Bắc Trên giới, số nước Trung Quốc, Ấn Độ, Pakisxtan, Ai Cập, Australia, Thái Lan, Srilanka, Nepal dùng phận hoa, vỏ thân rễ để phòng chữa bệnh Tại Ấn Độ, rễ, vỏ thân loài Bombax malabaricum DC dùng để trị tiêu chảy, kiết lỵ, bỏng, bệnh tiểu đường Hoa sử dụng để trị rắn cắn Theo tác giả Võ Văn Chi (1997) Đỗ Tất Lợi (2003), vỏ thân Gạo thường dùng bó gãy xương, vàng sắc đặc uống làm thuốc cầm máu Tuy nhiên, nghiên cứu lồi cịn ít, đặc biệt chưa tìm thấy nhiều nghiên cứu thành phần hóa học Nhằm mục đích chứng minh kinh nghiệm sử dụng Gạo dân gian, hướng đến việc tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học, xây dựng phương pháp phân tích hợp chất có dược liệu với bước đầu thực Gạo góp phần nâng cao giá trị tiềm Gạo kho tàng thuốc Việt Nam, luận án “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học Gạo Bombax malabaricum DC., họ Gạo Bombacaceae” thực Mục tiêu luận án Nghiên cứu đặc điểm thực vật loài Bombax malabaricum DC thu hái Hà Nội Nghiên cứu thành phần hóa học mẫu nghiên cứu Đánh giá độc tính cấp thăm dò số tác dụng sinh học mẫu nghiên cứu Để đạt mục tiêu đề ra, luận án tiến hành với nội dung sau:  Về thực vật: - Mơ tả đặc điểm hình thái giám định tên khoa học loài nghiên cứu thu hái Hương Sơn, Mỹ Đức, Hà Nội - Tiến hành giải phẫu, mô tả đặc điểm cấu tạo lá, hoa, vỏ thân đặc điểm vi học bột lá, hoa, vỏ thân mẫu nghiên cứu  Về hóa học: - Định tính có mặt hợp chất thường gặp dược liệu hoa, vỏ thân mẫu nghiên cứu - Chiết xuất, phân lập nhận dạng số hợp chất tinh khiết từ vỏ thân mẫu nghiên cứu - Xây dựng phương pháp phân tích để xác định hàm lượng số hợp chất phân lập  Về tác dụng sinh học: - Đánh giá độc tính cấp cao nước vỏ thân, hoa mẫu nghiên cứu - Thử tác dụng giảm đau, chống viêm, cầm máu tác dụng bảo vệ gan cao nước phận loài nghiên cứu cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân Những đóng góp luận án 3.1 Về thực vật - Đã giám định tên khoa học loài nghiên cứu thu hái Hương Sơn, Mỹ Đức, Hà Nội; mô tả chi tiết đặc điểm thực vật; đặc điểm vi học lá, vỏ thân, hoa 3.2 Về thành phần hóa học - Đã xác định nhóm chất có vỏ thân, hoa lồi B malabaricum DC gồm: glycosid tim, alcaloid, saponin, flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, sterol Ngoài ra, hoa có thêm: acid amin caroten - Đã chiết xuất, phân lập nhận dạng cấu trúc hóa học hợp chất từ vỏ thân hợp chất từ lồi nghiên cứu Trong có hợp chất lần phân lập từ họ Gạo (Bombacaceae) bao gồm: Momor cerebroside I, 7-hydroxysitosterol hợp chất lần phân lập từ chi Bombax L gồm: Friedelin, Epicatechin, Catechin - Đã xây dựng phương pháp cho phép định lượng đồng thời hợp chất dạng tinh thể phân lập từ phận Gạo sắc ký lỏng hiệu cao với cột pha đảo Zorbax C18, bước sóng phát 280nm, sử dụng chế độ gradient dung môi acetonitril methanol - Đã sơ xác định hàm lượng hợp chất 100g mẫu vỏ thân khô Gạo là: epicatechin (12,3mg); catechin (6,7mg); daucosterol (1,8mg); lupeol (9,5mg); stigmasterol (1,9mg) friedelin (7,6mg) hàm lượng hợp chất 100g mẫu Gạo khô là: mangiferin (8,1mg), daucosterol (1,1mg), 7α-hydroxysitosterol (0,9mg), lupeol (5,7mg), taraxeryl acetat (4,1mg), stigmasterol (0,9mg) taraxerol (5,1mg) 3.3 Về tác dụng sinh học - Thử độc tính cấp vỏ thân Gạo mức liều 100 – 300 g dược liệu/kg chuột không thấy biểu ngộ độc Ở liều 220g/kg, bắt đầu xuất chuột chết thử với cao nước hoa Xác định LD50 = 500,71 ± 28,28 g/kg hoa Gạo - Đã xác định vỏ thân cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân Gạo với liều 6g 12g dược liệu/kg có tác dụng làm giảm đau theo chế ngoại vi khơng có tác dụng giảm đau theo chế trung ương chuột nhắt trắng Với liều 8g dược liệu/kg cân nặng chuột cống trắng, cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân có tác dụng chống viêm cấp Với liều 12g dược liệu/kg chuột nhắt trắng, cao nước vỏ thân cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân có tác dụng chống viêm mạn tính Cao nước vỏ thân Gạo với liều 12g dược liệu/kg chuột nhắt trắng có tác dụng làm giảm thời gian chảy máu Lá Gạo 6g 12g dược liệu/kg chuột nhắt trắng có tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng paracetamol thông qua tác dụng hạn chế tăng hoạt độ ASAT, ALAT hạn chế tổn thương cấu trúc đại thể vi thể gan Với liều 6g 12g dược liệu/kg chuột nhắt trắng, cao nước Gạo có tác dụng làm giảm trọng lượng gan tác dụng chống oxy hóa thơng qua làm giảm nồng độ MDA dịch đồng thể gan Ý nghĩa luận án - Giám định tên khoa học mẫu dược liệu giúp cho kết nghiên cứu hóa học tác dụng sinh học khẳng định rõ nguồn gốc - Xác định đặc điểm vi học góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu - Kết nghiên cứu thành phần hóa học phát hợp chất lần phân lập từ họ Bombacaceae, từ chi Bombax L Là sở khoa học tiếp tục cho hướng nghiên cứu tác dụng sinh học dựa thành phần hoạt chất có dược liệu - Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng số hoạt chất phân lập từ dược liệu góp phần định tính tiêu chuẩn hóa dược liệu - Kết nghiên cứu độc tính thử tác dụng sinh học chứng minh dược liệu không gây độc mức liều nghiên cứu (phù hợp với mức liều thường dùng) góp phần giải thích kinh nghiệm sử dụng dân gian Là sở khoa học để ứng dụng rộng rãi việc sử dụng dược liệu điều trị bệnh mức liều phù hợp, cho hiệu điều trị tốt Bố cục luận án Luận án gồm chương, 40 bảng, 54 hình, 228 tài liệu tham khảo, 18 phụ lục Luận án có 148 trang gồm phần chính: Đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (37 trang), nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu (13 trang), kết nghiên cứu (68 trang), bàn luận (25 trang), kết luận kiến nghị (3 trang) B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƢƠNG TỔNG QUAN Đã tập hợp trình bày có hệ thống kết nghiên cứu từ trước tới thực vật học, thành phần hóa học tác dụng sinh học loài Bombax malabaricum DC giới Việt Nam CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu - Nguyên liệu nghiên cứu lá, vỏ thân Gạo Bombax malabaricum DC (BB) thu hái vào tháng 10/2010 xã Hương Sơn, huyện Mỹ Đức (Hà Nội), hoa mẫu cành tươi mang hoa thu hái vào tháng 4/2011 Lá, hoa vỏ thân rửa sạch, sấy khô 50oC làm mẫu nghiên cứu đặc điểm vi học hóa học Lá, vỏ thân chiết thành cao lỏng 4:1 để thử tác dụng sinh học - Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, hai giống, khỏe mạnh, khối lượng 20 ± 2g Chuột cống trắng, hai giống, khỏe mạnh, khối lượng 120 ± 20g, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu - Quan sát mơ tả đặc điểm hình thái thực vật thực địa - Giám định tên khoa học sở phân tích đặc điểm hình thái, đặc điểm phận sinh sản, so sánh với tiêu lưu trữ tài liệu phân loại thực vật với giúp đỡ chuyên gia thực vật học - Nghiên cứu đặc điểm vi học: cắt làm tiêu vi phẫu, soi bột lá, hoa vỏ thân loài nghiên cứu, quan sát đặc điểm, mô tả chụp ảnh tiêu - Định tính nhóm chất hữu dịch chiết toàn phần phản ứng đặc trưng Định tính sắc ký lớp mỏng với mỏng Silica gel GF254 (Merck) - Chiết xuất methanol tách thành phần chiết lỏng lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần - Phân lập hợp chất phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ Silica gel (0,0400,063mm, Merck) chất hấp phụ pha đảo YMC (30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.) - Xác định độ tinh khiết hợp chất SKLM, HPLC hàm lượng sơ xác định phương pháp HPLC - Nhận dạng hợp chất phân lập dựa vào liệu phổ MS, NMR, độ chảy, so sánh với liệu phổ có thư viện phổ tài liệu thu thập - Đánh giá độc tính cấp theo hướng dẫn 371 Bộ Y tế ban hành xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon - Đánh giá tác dụng giảm đau chuột nhắt trắng gây quặn đau acid acetic (phương pháp Koster) gây đau mâm nóng - Đánh giá tác dụng chống viêm cấp carragenin mơ hình gây phù chân chuột mơ hình gây viêm màng bụng - Đánh giá tác dụng chống viêm mạn theo mơ hình gây u hạt thực nghiệm chuột amiant - Đánh giá tác dụng cầm máu thông qua đánh giá thời gian máu chảy, máu đông - Đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm paracetamol - Các số liệu thực nghiệm xử lý theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng cơng cụ phân tích số liệu (Data analysis) Microsoft Excel CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ MẶT THỰC VẬT 3.1.1 Đặc điểm thực vật giám định tên khoa học Mô tả chi tiết đầy đủ phận quan dinh dưỡng (thân, lá), quan sinh sản (hoa, đài, cánh hoa, nhị, nhụy) loài nghiên cứu, so sánh với tiêu lưu trữ phòng Tiêu Quốc gia Việt Nam, viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, đối chiếu với khóa phân loại tham khảo tài liệu, giám định tên khoa học loài nghiên cứu thu hái Hương Sơn, Mỹ Đức, Hà Nội Bombax malabaricum DC., họ Gạo (Bombacaceae) Tên đồng nghĩa: Bombax ceiba 3.1.2 Đặc điểm vi học 3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu * Cấu tạo giải phẫu lá: - Phần gân lá: hình dạng mặt lồi, mặt lồi nhiều Biểu bì trên: lớp tế bào hình trịn nhỏ, xếp sít nhau, phủ bên ngồi lớp cu tin bắt màu xanh Mô dày gồm 4-5 hàng tế bào hình trịn, bắt màu hồng đậm Mơ mềm khuyết: 1-2 lớp tế bào hình trịn, bầu dục hay đa giác thành mỏng Các đám sợi libe bao bọc bên ngồi vịng libe- gỗ khép thành vịng trịn kín, bề dày lớp gỗ gấp khoảng lần so với bề dày lớp libe Túi tiết nằm phiến Bó libe gỗ hình cung, gồm cung libe bao quanh cung gỗ bắt màu xanh giữa.Mô dày gồm 4-5 hàng tế bào mơ dày trịn Biểu bì lớp tế bào hình trịn Giữa gân lá, mơ khuyết, mơ dày có tinh thể calci oxalat hình cầu gai Phần phiến lá: Biểu bì giống phần gân lá, mô giậu gồm hàng tế bào hình chữ nhật xếp vng góc với hàng tế bào biểu bì * Cấu tạo giải phẫu cành - Lát cắt hình trịn, ngồi lớp biểu bì Mơ dày tròn gồm 4-5 lớp tế bào, liên tục quanh thân Mơ mềm vỏ gồm tế bào hình bầu dục nằm ngang xếp lộn xộn, mạch dẫn hình trịn hay bầu dục có kích thước lớn nằm rải rác Mơ cứng bắt màu xanh đậm Có bó sợi libe nằm ngồi bó libe-gỗ Libe cấp hai cấu tạo tế bào nhỏ, xếp thành vòng tròn liên tục khơng đều, phía ngồi Các mạch gỗ xếp thành hàng bên libe Tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm mô mềm vỏ, mô mềm ruột Mơ mềm ruột cấu tạo tế bào hình trứng đa giác, có màng mỏng Lõi gỗ bắt màu xanh 3.1.2.2 Đặc điểm bột dược liệu * Bột hoa: Bột màu đỏ nâu, vị nhạt, không mùi Soi kính hiển vi có đặc điểm sau: Hạt phấn, lơng che chở, tinh thể calci oxalat hình cầu gai, mảnh cánh hoa, bó sợi mang mảnh mạch xoắn, mảnh cánh hoa mang mạch xoắn * Bột lá: Bột màu xanh sáng, vị nhạt, không mùi Soi kính hiển vi có đặc điểm sau: Lỗ khí mảnh biểu bì mang lỗ khí, lơng tiết, tinh thể calci oxalat hình cầu gai, mảnh mơ giậu, túi tiết, bó sợi mang mạch xoắn mảnh mạch xoắn, mảnh phiến * Bột vỏ thân: Bột màu vàng nâu, nhiều xơ Soi kính hiển vi có đặc điểm sau: Mảnh bần, tinh thể calci oxalat hình cầu gai, tế bào cứng, mảnh mô cứng, mảnh mô mềm, mảnh mang màu, mảnh mạch vạch 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC 3.2.1 Định tính nhóm chất hữu - Trong vỏ thân Gạo có nhóm chất: glycosid tim, alcaloid, saponin, flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, sterol - Trong hoa gạo có chứa 11 nhóm chất: glycosid tim, alcaloid, saponin, flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, sterol, acid amin caroten 3.2.2 Phân lập nhận dạng hợp chất phân lập từ vỏ thân 3.2.2.1 Nhận dạng hợp chất phân lập từ vỏ thân  BBV1 Tính chất: BBV1 chất kết tinh dạng tinh thể hình kim, nhiệt độ nóng chảy: 188189oC Tan ether, ethanol, methanol; khơng tan nước Phổ khối lượng ESI-MS xuất pic ion phân tử m/z 427 [M+H]+ kết hợp với phổ 1H-NMR 13C-NMR dự đốn cơng thức phân tử C30H50O (M= 426) Phổ NMR hợp chất hợp chất triterpenoid có khung lup-20(29)-en Phổ 1HNMR cho thấy tín hiệu nhóm methyl CH3 cộng hưởng vùng trường mạnh, có nhóm methyl bậc ba CH3 giá trị δH 1,68 (3H, br s, H-29) thuộc nhánh isopropenyl Tín hiệu proton thuộc nhánh isopropenyl δ H 4,68 (1H, d, J = 1,0 Hz, Ha-30) 4,56 (1H, d, J = 1,0 Hz, Hb-30) Ngoài ra, tín hiệu 3,38 (1H, dd, J = 11,5; 5,0 Hz, H-3) khẳng định có mặt nhóm oximethin (CH-O) Phổ 13C-NMR BBV1 bao gồm tín hiệu 30 nguyên tử carbon Phân tích tín hiệu phổ DEPT xác nhận gồm carbon methyl (CH3), 11 carbon methylen (CH2), carbon methin (CH) carbon bậc bốn (C) Nhánh isopropenyl xác nhận tín hiệu carbon methylen  109,33 (C-29) với tín hiệu carbon bậc bốn  150,96 (C-20) carbon methyl 19,33 (C-29) Ngồi ra, tín hiệu carbon oximethin  79,03 (C-3) cho phép xác nhận có nhóm hydroxyl phân tử hợp chất So sánh số liệu phổ NMR hợp chất BBV1 với số liệu hợp chất triterpen khung lup-20(29)-en biết lupeol (3β-hydroxylup-20(29)-ene) nhận phù hợp hoàn toàn tất vị trí tương ứng Nhận định khẳng định thêm xem xét đến số tương tác J proton H-3 Proton H-3 cộng hưởng  3,19 (dd, J = 11,5; 5,0 Hz), tín hiệu doublet cho thấy số tương tác J lớn H-3 vị trí axial (a) hay alpha () dẫn tới OH C-3 equatorial (e) Từ phân tích nêu hợp chất BBV1 xác định 3β-hydroxylup-20(29)-ene hay lupeol  BBV2 Tính chất: Hợp chất BBV2 thu dạng chất kết tinh màu trắng, lăng trụ o 263-263,5 C Phổ khối lượng ESI+ MS xuất pic ion phân tử m/z 427 [M+H] kết hợp với phổ 1H-NMR 13C-NMR dự đốn cơng thức phân tử C30H50O (M= 426) Phổ 1H-NMR xuất tín hiệu nhóm methyl có nhóm methyl bậc  0,73; 0,87; 1,01; 1,05; 1,18; 0,95 1,00 ppm dạng singlet nhóm methyl bậc  0,88 ppm dạng tín hiệu doublet (J=7,0 Hz) Nhìn chung, phổ 1H-NMR có dạng phổ hợp chất triterpen Phổ 13C-NMR xuất tín hiệu 30 carbon, dựa vào kết phổ DEPT cho thấy hợp chất BBV2 có carbon bậc bốn  212,82 (C-3); 42,59 (C-5); 37,21 (C-9); 39,46 (C-13); 38,07 (C-14); 29,75 (C-17); 27,92 (C-20); carbon methin  59,21 (C-4); 52,84 (C-8); 59,21 (C-10); 30,25 (C-12); 42,59 (C-18); 10 carbon methylen  22,03 (C-1); 41,88 (C-2); 41,27 (C-6); 18,00 (C-7); 35,78 (C-11); 32,56 (C-15); 36,37 (C-16); 35,10 (C-19); 32,18 (C-21); 39,00 (C-22); carbon methyl  6,57 (C-23); 14,41 (C-24); 17,69 (C-25); 18,40 (C-26); 20,00 (C-27); 32,56 (C-28); 34,78 (C-29); 31,86 (C-30) Trong đó, tín hiệu nhóm carbonyl (C=O) xác định  212,82 (C-3), tín hiệu nhóm methyl bậc C 6,57/H 0,88 (dd, J=7,0 Hz) đặc trưng cho nhóm methyl liên kết với carbon C-4 khung friedelan Từ kiện phổ nêu cho phép dự đoán hợp chất BBV2 friedelan-3-one So sánh thêm kiện phổ BBV2 với hợp chất friedelan-3-one đặc biệt giá trị C số tương tác J proton ta thấy hoàn toàn trùng khớp Như vậy, hợp chất BBV2 khẳng định friedelan-3-one với công thức phân tử C30H50O (M= 426)  BBV3 Tính chất: Hợp chất BBV3 217-218oC Phổ khối lượng ESI-MS xuất pic ion phân tử m/z 291 [M+H]+ kết hợp với phổ 1H-NMR 13C-NMR dự đốn cơng thức phân tử C15H1406 (M=290) H-NMR (500 MHz, CD3OD) ppm: 4,83 (1H, d, J=2,5 Hz, H-2); 4,19 (1H, m, H-3); 2,74 (1H, dd, J=16,0; 2,0 Hz, Ha-4); 2,88 (1H, dd, J=16,0; 4,5 Hz, Hb-4); 5,96 (1H, d, J=1,5 Hz, H-6); 5,96 (1H, d, J=1,5 Hz, H-8); 6,99 (1H, d, J=1,5 Hz, H-2′); 6,78 (d, J=8,5 Hz, H-5′); 6,82 (1H, dd, J=8,5; 1,5 Hz, H-6′); 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) ppm: 79,85 (C-2); 67,46 (C-3); 29,22 (C-4); 157,93 (C-5); 95,90 (C-6); 157,30 (C-7); 96,41 (C-8); 157,57 (C-9); 100,09 (C-10); 132,26 (C-1′); 115,32 (C2′); 145,74 (C-3′); 145,90 (C-4′); 115,91 (C-5′); 119,41 (C-6′) Những liệu phổ với phân tích so sánh giá trị số tương tác J với giá trị tương ứng epicatechin cho thấy hợp chất BBV3 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavan (epicatechin) với công thức phân tử C15H14O6 Kết so sánh kiện phổ 13C-NMR BBV3 với epicatechin hoàn toàn phù hợp Phổ HMBC thực tương tác HMBC nhận hoàn toàn khẳng định cấu trúc BBV3 epicatechin Đây lần epicatechin phân lập từ vỏ thân Gạo  BBV4 Tính chất: Hợp chất BBV4 thu chất kết tinh màu vàng nhạt, o tan methanol, ethanol Nhiệt độ nóng chảy: 175 – 177 C Phổ khối lượng ESI-MS xuất pic ion phân tử m/z 289 [M-H]- kết hợp với phổ 1H-NMR 13C-NMR dự đốn cơng thức phân tử C15H14O6 (M=290) Phổ 1H-NMR xuất tín hiệu hai proton vị trí meta với  5,87 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6); 5,94 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8), đồng thời phổ 1H-NMR xác định xuất vòng thơm kiểu 1, 3, tín hiệu  6,86 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2'); 6,77 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5'); 6,74 (1H, dd, J = 8,0; 1,5 Hz, H-6') Ngồi cịn xuất tín hiệu nhóm methin  4,57 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2), proton  3,99 (1H, m, H-3) hai proton nhóm methylen  2,53 (1H, dd, J = 16,0; 8,5 Hz, Ha-4); 2,88 (1H, dd, J = 16,0; 5,5 Hz, Hb-4) Phổ 13C-NMR xuất tín hiệu 15 ngun tử carbon tín hiệu hai nhóm methin  82,88 68,83 phù hợp với vị trí C-2 C-3 khung 3-hydroxyflavan So sánh kiện phổ hợp chất BBV4 với kiện phổ chất (+)-catechin thấy có phù hợp hồn tồn Như BBV4 (+)-catechin (C15H14O6)  BBV5 Hợp chất BBV5 chất bột màu trắng, dạng vơ định hình Nhiệt độ nóng chảy: 203-205oC Tan methanol, ethanol, ethyl acetat, không tan nước Trên phổ ESI-MS xuất pic ion m/z 845,3 [M+H]+ kết hợp với phổ 1H-NMR 13C-NMR dự đốn cơng thức phân tử C48H93NO10 (M=844) Trên phổ 1H-NMR 13C-NMR BBV5 xuất tín hiệu đặc trưng cho có mặt phân tử đường H 4,12 (1H, d, J = 7,5 Hz, proton anome) C 103,43 (carbon anome); nhóm amid nhận diện H 7,55 (1H, d, J = 9,5 Hz, NH) C 173,75 (-NHC=O); proton methylen mạch dài H 1,23 -1,28 (32H, br s) C 22,0 - 31,22 ppm, nhóm methyl H 0,84 (6H, t, J = 7,0 Hz) C 13,85 (×2) tín hiệu proton nhóm methyl dạng triplet chứng tỏ liên kết trực tiếp với nhóm CH2 hay vị trí liên kết cuối mạch dài Ngoài ra, proton olefin xác định H 5,30 (1H, dd, J = 15,5; 6,5 Hz) 5,36 (1H, dd, J = 15,5; 6,5 Hz), C 129,63 130,20 ppm nối đơi xác định trans có số J = 15,5 Hz; nhóm methin gắn với nguyên tử oxy H 3,83 (1H, m); 3,84 (1H, m) 4,17 (1H, t, J = 5,5 Hz) Các kiện phổ gợi ý hợp chất BBV5 cerebroside Tất vị trí BBV5 gán theo liệu phổ NMR hai chiều HSQC HMBC, với số liệu phổ khối lượng ESI-MS cho phép khẳng định hợp chất BBV5 cerebroside có cơng thức phân tử C48H93NO10 có tên gọi momor-cerebroside I  BBV6 Tính chất: Hợp chất BBV6 dạng bột màu trắ lăng o trụ dài Nhiệt độ nóng chảy: 283-284 Phổ khối + lượng ESI-MS cho pic ion mảnh m/z 397,3 [M+H-C6H12O6] pic ion phân tử 575,3 [MH]- tương ứng với công thức phân tử C35H60O6 H-NMR (500 MHz, DMSO) δppm: 3,43 (1H, m, H-3); 5,32 (1H, br s, H-6); 0,68 (3H, s, H-18); 0,96 (3H, s, H-19); 0,91 (3H, d, J=6,5 Hz, H-21); 0,84 (3H, t, J = 7,6 Hz, H-26); 0,81 (3H, d, J=6,8 Hz, H-27); 0,83 (3H, d, J=7,3 Hz, H-29); 4,22 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1); 2,90 (m, H-2); 3,12 (m, H-3); 3,02 (m, H4); 3,07 (m, H-5); 3,40 (m, H-6a); 3,64 (dd, J = 6,0; 10,0 Hz, H6b) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO) δppm: 36,79 (C-1); 29,22 (C-2); 76,94 (C-3); 38,29 (C-4); 140,42 (C-5); 121,11 (C-6); 31,33 (C-7); 31,38 (C-8); 49,58 (C-9); 36,16 (C-10); 20,55 (C-11); 39,33 (C-12); 41,81 (C13); 56,14 (C-14); 23,80 (C-15); 27,73 (C-16); 55,42 (C-17); 11,61 (C-18); 18,90 (C-19); 35,43 (C-20); 18,56 (C-21); 33,33 (C-22); 25,47 (C-23); 45,13 (C-24); 28,70 (C-25); 19,63 (C-26); 22,59 (C-27); 19,03 (C-28); 11,73 (C-29); 100,79 (C-1); 73,42 (C-2); 76,67 (C-3); 70,08 (C-4); 76,67 (C-5); 61,07 (C-6) Từ kiện phổ kết hợp với so sánh số liệu phổ 13C-NMR hợp chất daucosterol nêu tài liệu ta thấy hoàn toàn phù hợp Như vậy, BBV6 xác định daucosterol, hợp chất phổ biến loài thực vật  BBV7 Hợp chất BBV7 thu dạng tinh thể hình kim, có điểm nóng chảy 170-172oC Phổ khối lượng ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 395,3 [M+H-H2O]+ tương ứng với công thức phân tử C29H48O (M=412) H-NMR (500 MHz, CDCl3) δppm: 3,53 (m, H-3); 5,35 (br d, J=3,5 Hz, H-6); 0,84 (3H, s, H-18); 1,03 (3H, s, H-19); 0,91 (3H, d, J=6,5 Hz, H-21); 5,15 (1H, dd, J=8,5; 15,0 Hz, H-22); 5,02 (1H, dd, J = 8,5; 15,0 Hz, H-23); 0,84 (3H, t, J = 8,5 Hz, H-26); 0,81 (3H, d, J = 6,8 Hz, H-28); 0,68 (3H, d, J = 9,5 Hz, H-29) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 37,26 (C-1); 31,66 (C-2); 71,82 (C-3); 42,30 (C-4); 140,76 (C-5); 121,73 (C-6); 31,90 (C-7); 31,90 (C-8); 50,16 (C-9); 36,52 (C-10); 21,09 (C-11); 39,78 (C-12); 42,30 (C13); 56,87 (C-14); 24,37 (C-15); 28,93 (C-16); 56,05 (C-17); 11,99 (C-18); 19,41 (C-19); 40,51 (C-20); 21,22 (C-21); 138,33 (C-22); 129,27 (C-23); 51,24 (C-24); 31,90 (C-25); 21,22 (C-26); 25,42 (C-27); 19,04 (C-28); 12,26 (C-29) Dựa vào số liệu phổ NMR ESI-MS, BBV7 xác định stigmasterol Kết hợp so sánh phổ 13C-NMR BBV7 stigmasterol thấy hoàn toàn phù hợp vị trí tương ứng Như vậy, BBV7 xác định stigmasterol  BBV8 Hợp chất BBV8 nhận dạng chất dầu không màu Phổ khối lượng ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 371 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C22H42O4 (M=370) Phổ 1H-NMR xuất tín hiệu doublet δH 4,03 (J=5,5 Hz) đặc trưng cho proton gắn vào carbon nối với nguyên tử oxy Tín hiệu doublet cho thấy bên cạnh nguyên tử C nhóm CH Ngồi ra, phổ cịn xuất tín hiệu hai nhóm methyl δH 0,93 (6H), proton nhóm methylen δH 1,60, cịn lại tín hiệu nhóm CH2 có độ dịch chuyển hóa học khoảng từ δ 1,31 đến 1,67 Phổ 13C-NMR xuất tín hiệu 11 nguyên tử C tín hiệu δC 175,26 đặc trưng cho nhóm carboxylat, tín hiệu nhóm oxymethylen δC 67,72; tín hiệu carbon CH δC 40,24; nhóm methyl δC 44,38 11,38 tín hiệu CH2 khác δC 34,78; 31,62; 30,11; 25,56; 24,03 24,94 Các tín hiệu xác định thơng qua phổ DEPT 90 DEPT 135 Từ kết phân tích phổ trên, BBV8 xác định Bis (2-ethyl hexyl) adipat hay gọi diethylhexyl adipat, gọi FlexolA26 Đây lần hợp chất phát từ vỏ Gạo 3.2.2.2 Nhận dạng hợp chất phân lập từ Có hợp chất phân lập từ BBL1, BBL2 BBL4 xác định lupeol, daucosterol stigmasterol phân lập nhận dạng vỏ thân Sau chất lại (BBL3, BBL5, BBL6 BBL7):  BBL3 Hợp chất BBL3 phân lập dạng tinh thể màu vàng Tan methanol, ethanol nóng; khơng tan n-hexan Phổ khối lượng ESI-MS xuất pic ion phân tử m/z 423 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C19H18O11 (M = 422) Phổ NMR hợp chất có cấu trúc dạng xanthone C-glucoside Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu nhóm methin (CH) vịng benzen cộng hưởng vùng trường yếu δH 6,35 (s, H-8); 6,79 (s, H-11) 7,33 (s, H-14) Tín hiệu proton δH 13,85 nhóm hydroxyl đặc trưng đính vào C-5 Ngồi ra, tín hiệu proton anome phân tử đường xác định H 4,58 (1H, dd, J = 9,5 Hz, H-1′), số tương tác J=9,5 Hz gợi ý đường nối C-C Phổ 13C-NMR BBL3 bao gồm tín hiệu 19 nguyên tử carbon Phân tích tín hiệu phổ DEPT xác nhận gồm 10 carbon bậc (C), carbon methylen (CH2) carbon methin (CH) Trong có carbon methin vịng thơm; 10 carbon bậc khung xanthone Nhánh đường xác nhận tín hiệu carbon anome với tín hiệu carbon methin tín hiệu nhóm methylen đặc trưng cho phân tử đường glucose Từ kiện phổ cho phép dự đoán hợp chất BBL3 mangiferin thành phần Gạo  BBL5 Sau thử nghiệm với số chương trình dung mơi khác nhau, tốc độ dịng thể tích tiêm mẫu khác nhau, chúng tơi chọn lựa chương trình tương đối phù hợp đủ để tách chất nghiên cứu pic khác mẫu nghiên cứu chuẩn bị từ vỏ thân Gạo  Với dịch chiết vỏ thân Gạo: Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A acid formic 0,1% acetonitril kênh B acid formic 0,1% methanol (B) Tỷ lệ kênh A-B ban đầu (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (40:60) phút thứ 6, thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (50:50) phút thứ 23 Thay đổi tuyến tính lại A–B (40:60) phút thứ 27 cuối pha động thay đổi tuyến tính tỷ lệ A–B (30:70) ban đầu phút thứ 30 Tốc độ dòng 0,7 ml/phút thể tích tiêm mẫu 10μl Bước sóng detector chọn 280nm để dung hòa tương đối khả hấp thụ chất Chương trình sắc ký với điều kiện sắc ký gọi CTSK1 Với CTSK1, chất nghiên cứu tách hoàn toàn, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý Tiến hành sắc ký với hợp chất nghiên cứu so sánh với sắc ký đồ thu hỗn hợp hợp chất epicatechin, catechin, daucosterol, lupeol, stigmasterol friedelin để xác định thời gian lưu chất Thời gian lưu chất 4,38; 5,41; 7,88; 11,36; 17,94 21,35 phút Sắc ký đồ dịch chiết vỏ thân thu hình 3.37 Hình 3.37 Sắc ký đồ mẫu thử chuẩn bị từ vỏ thân Gạo  Với dịch chiết Gạo: Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A B tương tự với tỷ lệ thời gian thay đổi khác Tốc độ dòng 1,0ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 μl bước sóng detector chọn 280nm Chương trình sắc ký gọi CTSK2 Với CTSK2, hợp chất mangiferin, daucosterol, 7-hydroxysitosterol, lupeol, taraxeryl acetat, stigmasterol taraxerol tách hồn tồn, pic cân đối, thời gian lưu trung bình chất 4,42; 7,12; 9,51; 12,14; 15,17; 18,03 25,05 phút 3.2.3.2 Xác định độ tinh khiết số hợp chất phân lập Tiến hành sắc ký hợp chất phân lập từ vỏ thân hay Gạo thu sắc ký đồ có pic thời gian 30 phút Điều lần khẳng định chất phân lập có độ tinh khiết cao nên sử dụng hợp chất làm nguyên liệu để thiết lập chất đối chiếu Tuy nhiên lượng hợp chất phân lập cịn chưa đủ thời gian cho phép thiết lập chất chuẩn, tạm dùng chúng chất đối chiếu để khảo sát phương pháp định lượng chúng vỏ thân Gạo 3.2.3.3 Định tính hợp chất sắc ký đồ dịch chiết toàn phần Định tính phương pháp so sánh phổ khối lượng pic có thời gian lưu mẫu thử hỗn hợp chất đối chiếu Để khẳng định thêm, phổ khối lượng thu từ pic tương ứng với hợp chất sắc ký đồ mẫu thử so sánh với phổ khối lượng dùng để phân tích cấu trúc Phổ khối lượng nhận dạng pic đo chế độ: ESI+ với tốc độ khí phun l/phút, tốc độ khí làm khơ 15l/phút, nhiệt độ mao quản 250oC, nhiệt độ heat block 400oC, vùng quét m/z 100-1000 Thế phá mảnh +4,5kV 11 Kết hoàn toàn phù hợp phổ khối lượng pic ứng với chất sắc ký đồ mẫu thử dịch chiết toàn phần chuẩn bị từ vỏ thân hay Gạo với phổ khối lượng hợp chất phân lập Ngoài pic hợp chất nghiên cứu, sắc ký đồ mẫu thử chuẩn bị từ vỏ thân hay Gạo xuất thêm pic khác tách hồn tồn khỏi chất phân tích 3.2.3.4 Thẩm định phương pháp áp dụng để xác định hàm lượng chất  Thẩm định phương pháp Phương pháp xây dựng kiểm tra phù hợp hệ thống sắc ký, tính đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính Độ kiểm tra phương pháp thêm Kết khảo sát cho thấy phương pháp phân tích lựa chọn cho tỷ lệ thu hồi cao, có độ tốt Kết khảo sát cho thấy phương pháp HPLC xây dựng có độ nhạy cao, giới hạn định lượng LOQ thấp nồng độ định lượng nhiều lần hợp chất (nằm khoảng 0,8-4,07μg/ml) Những kết thẩm định tính đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại phương pháp định lượng thành phần vỏ thân Gạo chứng tỏ sử dụng phương pháp để sơ xác định hàm lượng thành phần vỏ thân Gạo  Xác định hàm lượng số hợp chất có vỏ thân Gạo Tiến hành cân xác khoảng 500,0mg cắn hịa tan định mức thành 25ml, lọc qua qua màng lọc Tiến hành sắc ký song song mẫu thử với mẫu hỗn hợp chất đối chiếu Tính kết theo phương pháp chuẩn hóa điểm Lượng cắn cân cho lần định lượng khoảng 502,2mg; 503,2mg 503,4mg Tính tốn lượng chất có mẫu thử qui tương đương với 500mg cắn Tính giá trị trung bình lần thử Từ lượng dược liệu hàm ẩm đem chiết tổng lượng cắn thu tính hàm lượng chất có 100g dược liệu khô Kết định lượng sơ số hợp chất thu có 100g vỏ thân Gạo: epicatechin (12,3mg); catechin (6,7mg); daucosterol (1,8mg); lupeol (9,5mg); stigmasterol (1,9mg) friedelin (7,6mg)  Xác định hàm lượng hợp chất có Gạo Tiến hành tương tự với vỏ thân Lượng cắn cân cho lần định lượng là: 506,4mg; 503,2mg 502,2mg Tiến hành song song mẫu thử với mẫu hỗn hợp chất đối chiếu Tính tốn lượng chất có mẫu thử tương đương với 500mg cắn Tính giá trị trung bình lần thử Hàm lượng hợp chất 100g mẫu Gạo khô là: mangiferin (8,1mg), daucosterol (1,1mg), 7α-hydroxysitosterol (0,9mg), lupeol (5,7mg), taraxeryl acetat (4,1mg), stigmasterol (0,9mg) taraxerol (5,1mg) 3.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC 3.3.1 Đánh giá độc tính cấp 3.3.1.1 Đánh giá độc tính cấp cao nước vỏ thân Gạo Chuột uống cao nước vỏ thân Gạo với mức liều 100-300g dl/kg chuột Trong suốt ngày theo dõi chuột tất lô hoạt động, ăn uống, tiết bình thường, khơng thấy biểu bất thường kèm theo không gây chết chuột tất lơ thí nghiệm 3.3.1.2 Đánh giá độc tính cấp cao nước Gạo Sau uống cao nước Gạo với mức liều 100-300g dl/kg chuột, chuột khơng có tượng đặc biệt: ăn uống, vận động bình thường, chuột khơng bị khó thở Tuy nhiên chuột bị tiêu chảy liều từ 240g - 300g dược liệu/kg thể trọng chuột Quan sát thấy khơng xuất chuột chết vịng 72 sau uống thuốc thử 3.3.1.3 Đánh giá độc tính cấp cao nước hoa Gạo 12 Sau uống cao nước toàn phần hoa Gạo liều thấp 220g dược liệu/kg chuột, khơng có tượng đặc biệt: ăn uống, vận động bình thường, chuột khơng bị khó thở, khơng bị tiêu chảy Các liều cao, chuột có tượng khó thở sau uống thuốc thử giờ, khó thở co giật chủ yếu xảy 24 đầu sau uống thuốc thử, xuất chuột chết Tính phương trình tương quan tuyến tính liều dùng tỷ lệ chuột chết: y = 0,3381x – 119,29 Vậy LD50 = 500,71 ± 28,28 (g dược liệu/kg) 3.3.2 Tác dụng giảm đau Phương pháp gây quặn đau acid acetic Cao lỏng VG với liều 6g/kg/ngày có số quặn đau tất thời điểm nghiên cứu giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p0,05 *: p 0,05 18,05 ± 2,71 > 0,05 > 0,05 18,06 ± 1,73 > 0,05 > 0,05 17,74 ± 2,30 > 0,05 > 0,05 Kết bảng 3.21 cho thấy: - Codein 10mg/kg/ngày có tác dụng kéo dài thời gian phản ứng với nhiệt độ chuột so với trước uống thuốc so với chuột lô chứng (p0,05) 3.3.3 Tác dụng chống viêm cấp Mô hình gây phù chân chuột carragenin Bảng 3.22 Tác dụng cao nước cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân Gạo mơ hình gây phù chân chuột Sau (V1) Lô chuột nghiên cứu Lô 1: Chứng sinh học Lô 2: Aspirin (150 mg/kg) p 2-1 Lô 3: VG (4g/kg) p 3-1 Lô 4: VG (8g/kg) p 4-1 Lô 5: VGE 4g/kg p 5-1 Lô 6: VGE 8g/kg p 6-1 Ghi chú: Độ phù (%) giảm phù so với chứng(%) 60,62 ±15,15 25,06 ± 10,87 *** 58,33 ± 15,66 (o) 57,85 ± 15,72 (o) 39,06 ± 19,18 * 38,83 ± 9,07 * Sau (V2) giảm phù Độ phù so với (%) chứng (%) 66,33 ± 14,32 58,66 3,78 4,57 35,57 35,90 35,41 ± 13,66 *** 56,37 ± 10,81 (o) 55,87 ± 13,91 (o) 44,05 ± 15,87 ** 46,60 ± 11,09 ** (o): p>0,05 *: p0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Bảng 3.25 Tác dụng cao nước cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân Gạo lên số lượng bạch cầu dịch rỉ viêm Lô chuột nghiên cứu Lô 1: Chứng sinh học Lô 2: Aspirin 150 mg/kg Lô 3: VG 4g/kg Lô 4: VG 8g/kg Lô 5: VGE 4g/kg Lô 6: VGE 8g/kg Số lƣợng bạch cầu ( X ± SD, g/l) 6,86 ± 3,45 4,83 ± 2,17 6,26 ± 2,27 5,91 ± 1,23 6,20 ± 3,40 6,04 ± 2,25 p so lô p so lô 0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Kết bảng 3.25 cho thấy: Cao nước vỏ thân Gạo cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân Gạo (VGE) liều 6g/kg 12g dược liệu/kg thể trọng chuột cống trắng có xu hướng làm giảm số lượng bạch cầu dịch rỉ viêm so với lô chứng khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05) 3.3.4 Tác dụng chống viêm mạn Kết thí nghiệm tác dụng ức chế viêm mạn cao nước vỏ thân Gạo cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân gạo (VGE) trình bày bảng 3.26 Bảng 3.26 Tác dụng cao nước cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân Gạo lên trọng lượng u hạt Lô chuột nghiên cứu Lô 1: Chứng sinh học Lô 2: Prednisolon mg/kg Lô 3: VG 6g/kg Lô 4: VG 12g/kg Lô 5: VGE 6g/kg Lô 6: VGE 12g/kg Trọng lƣợng u hạt ( X ± SD, mg) 35,90 ± 17,26 15,10 ± 3,81 30,11 ±18,75 18,45 ±8,88 24,73 ± 5,68 15,56 ± 4,85 p so với lô p so với lô 0,05 0,05 0,05 >0,05 Kết bảng 3.26 cho thấy: Cao nước cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân Gạo liều cao 12g dược liệu/kg thể trọng chuột làm giảm trọng lượng khối u hạt so với lô chứng, liều cao nước cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân Gạo có tác dụng chống viêm mạn tính (p0,05) Liều 6g dược liệu/kg/ngày: cao nước cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân Gạo không làm giảm trọng lượng khối u hạt 3.3.5 Tác dụng cầm máu qua đánh giá thời gian chảy máu, đông máu T Bảng 3.27 Tác dụng VG lên thời gian chảy máu Lô Lô 1: nước cất Lô 2: VG 6g dl/kg Lô 3: VG 12g dl/kg Trước uống thuốc 50,70 ± 18,49 50,70 ± 9,90 53,40 ± 18,29 16 Sau uống thuốc 54,80 ± 25,60 49,70 ± 12,90 37,70 ± 7,26 p trƣớc -sau >0,05 >0,05 0,05 >0,05 Kết bảng 3.28 cho thấy: tác dụng Bảng 3.29 Tác dụng VG lên số lượng tiểu cầu máu ngoại vi Lô Lô 1: nước cất Lô 2: VG liều 6g dl/kg Lô 3: VG liều 12g dl/kg Số lƣợng tiểu cầu (G/l) 483,80 ± 159,62 446,70 ± 103,45 465,40 ± 143,65 p so với chứng >0,05 >0,05 VG liều thử nghiệm sau ngày uống không ảnh hưởng đến số lượng tiểu cầu máu ngoại vi chuột nhắt so với lô chứng (p>0,05) 3.3.6 Tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa Tác dụng LG lên khối lượng gan chuột nhắt trắng Bảng 3.30 Tác dụng LG lên khối lượng gan chuột bị gây độc PAR Khối lƣợng gan trung bình (g) 1,3073  0,1967 i Lô chuột Chứng sinh học Mơ hình (p2-1=0,0020) Silymarin 70mg/kg 1,6870  0,2552 1,6513  0,1604 0,7272 LG 6g dl/kg 1,2203  0,1453 1×10-4 1×10-5 LG 12g dl/kg 1,2997  0,1104 1×10-4 2×10-5 p2-i p3-i Ở lơ uống thuốc (cả lô thử thuốc thuốc chứng dương) khối lượng gan giảm so với lơ mơ hình Tuy nhiên khác biệt có ý nghĩa thống kê lô chuột uống LG liều 6g dl/kg 12g dl/kg (p