Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài stephania lour ở việt nam tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Hoàng Văn Thủy NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC HAI LOÀI STEPHANIA LOUR Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền Mã số: 62.72.04.06 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2020 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Dược Hà Nội; Sở y tế tỉnh Yên Bái; Viện Hàn lâm khoa học – công nghệ Việt Nam; Người hướng dẫn khoa học: Hướng dẫn 1: GS TS Phạm Thanh Kỳ; Hướng dẫn 2: PGS TS Nguyễn Quốc Huy Phản biện :……………………………………………… ……………………………………………… Phản biện :……………………………………………… ……………………………………………… Phản biện :……………………………………………… ……………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: ……………………………………………………………… Vào hồi ……… …… ngày …… tháng …… năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện trường ĐH Dược Hà Nội A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Chi Stephania Lour thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) chi lớn, giới có khoảng 100 lồi phân bố tập trung nhiều vùng nhiệt đới, nhiệt đới Ở Việt Nam có 22 lồi thuộc chi Stephania Lour., với tên thường gọi Bình vơi Đã có nhiều nghiên cứu trước lồi thuộc chi Stephania Lour Việt Nam, nay, chưa có nghiên cứu đầy đủ lồi Bình vơi thu Bà Rịa - Vũng Tàu lồi Bình vơi thu Văn Chấn – n Bái Trong lồi có trữ lượng lớn địa phương người dân sử dụng phổ biến làm thuốc chữa bệnh Nhằm mục đích xác minh sở khoa học việc sử dụng hai lồi Bình vơi Bà Rịa – Vũng Tàu Văn Chấn – Yên Bái, hướng đến việc tiêu chuẩn hóa dược liệu, tìm kiếm hợp chất đánh giá hoạt tính sinh học, để từ góp phần nâng cao giá trị sử dụng hai lồi Bình vôi Việt Nam, luận án "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour Việt Nam", thực Mục tiêu luận án Mơ tả đặc điểm hình thái thực vật, giám định tên khoa học xác định đặc điểm vi học hai lồi bình vơi thu hái Bà Rịa – Vũng Tàu Yên Bái Nghiên cứu thành phần hóa học hai lồi xác định tên khoa học Thử độc tính cấp đánh giá số tác dụng sinh học Để thực mục tiêu trên, đề tài thực nội dung sau: Về mặt thực vật: - Thu hái mẫu có đủ hoa đực, hoa cái, phân tích đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học hai mẫu nghiên cứu - Xác định đặc điểm vi phẫu thân, cuống lá, lá, đặc điểm bột củ hai loài nghiên cứu Về thành phần hóa học: - Định tính nhóm chất củ hai lồi nghiên cứu - Định lượng alcaloid toàn phần rotundin củ hai loài - Chiết xuất, phân lập hợp chất củ hai lồi - Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập Về độc tính tác dụng sinh học: - Thử độc tính cấp cao chiết ethanol 70% hai loài nghiên cứu - Đánh giá tác dụng giảm đau cao chiết ethanol 70% hai loài nghiên cứu - Đánh giá tác dụng chống viêm cấp mạn cao chiết ethanol 70% hai loài nghiên cứu - Đánh giá tác dụng gây độc số dòng tế bào ung thư tác dụng chống oxy hóa chất phân lập cao chiết tồn phần Những đóng góp luận án 3.1 Về thực vật - Đã mô tả chi tiết quan dinh dưỡng sinh sản loài nghiên cứu giám định tên khoa học loài thu hái Bà Rịa, Vũng Tàu Stephania venosa (Bl.) Spreng, loài thu hái Văn Chấn, Yên Bái Stephania viridiflavens H S Lo & M Yang Trong đó, lồi S viridiflavens lần mơ tả đầy đủ đặc điểm quả, hạt Đã xác định đặc điểm vi phẫu thân, cuống lá, lá, bột bột củ loài nghiên cứu, góp phần nhận biết tiêu chuẩn hóa dược liệu 3.2 Về thành phần hóa học - Đã xác định củ lồi bình vơi S venosa S viridiflavens có nhóm chất: alcaloid, tanin, flavonoid, đường khử, sterol, tinh bột; riêng chất béo có lồi S venosa - Đã định tính củ lồi nghiên cứu phương pháp TLC, sử dụng hệ dung môi Toluen - aceton - ethanol - amoniac [45 : 45 : : 3], với hai chất đối chiếu oxostephanin L-tetrahydropalmatin, hình ảnh sắc ký đồ quan sát bước sóng 254 366nm phân biệt hai lồi, góp phần nhận biết tiêu chuẩn hóa hai dược liệu S venosa S viridiflavens - Đã phân lập xác định cấu trúc hóa học 20 hợp chất (12 hợp chất từ S venosa hợp chất từ S viridiflavens), có 14 alcaloid, glycosid, sterol chất béo Trong có: alcaloid (Jatrorrhizin), chất béo (thành phần là: acid linoleic, acid vaccenic, acid palmitic); sterol (β-sitosterol, β-sitosterol glucosid) lần đầu phân lập từ loài S venosa thu hái từ Bà Rịa – Vũng Tàu (Việt Nam); có alcaloid (Roemerin, Thaicanin, Liriodenin, Capaurin), glycosid (Roseosid) lần đầu phân lập từ loài S viridiflavens thu hái Văn Chấn – Yên Bái (Việt Nam) Hợp chất Roseosid lần đầu công bố phân lập từ chi Stephania - Bằng phương pháp chuẩn độ acid-base xác định hàm lượng alcaloid tồn phần (tính theo L-tetrahydropalmatin) củ loài S venosa 3,29 ± 0,09%, củ loài S viridiflavens 3,06 ± 0,07% - Bằng phương pháp HPLC, xác định hàm lượng Ltetrahydropalmatin (rotundin) dược liệu khơ tuyệt đối củ lồi S venosa S viridiflavens 0,49% 1,46% 3.3 Về tác dụng sinh học - Đã xác định độc tính cấp theo đường uống chuột nhắt trắng: cao chiết ethanol 70% củ S viridiflavens có LD50 4875 mg/kg (CI 95%: 4258 mg/kg – 5709 mg/kg) tương đương 27,07g dược liệu/kg, S venosa 5711 mg/kg (CI 95%: 4971 mg/kg – 6674 mg/kg) tương đương 26,01 g dược liệu/kg - Đã đánh giá tác dụng giảm đau hai lồi Bình vơi nghiên cứu: Trên mơ hình đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi, ba mức liều 260 mg/kg, 520 mg/kg, 1040 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S viridiflavens, ba mức liều 290 mg/kg, 580 mg/kg, 1160 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S venosa có tác dụng giảm đau quặn suốt 30 phút thử nghiệm chuột nhắt trắng Trên mô hình đánh giá tác dụng giảm đau trung ương, hai mức liều 520 mg/kg, 1040 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S viridiflavens, hai mức liều 580 mg/kg, 1160 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S venosa có tác dụng kéo dài thời gian đáp ứng đau chuột nhắt trắng mâm nóng - Đã đánh giá tác dụng chống viêm hai lồi Bình vơi nghiên cứu: Trên mơ hình gây phù chân chuột carragenan, liều 340 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S venosa có tác dụng giảm phù bàn chân chuột cống trắng gây carragenan thời điểm với tỉ lệ ức chế phù tương ứng 34,12% 40,58% Cao chiết ethanol 70% củ S viridiflavens tác dụng ức chế phù chân chuột mức liều 150 mg/kg 300 mg/kg Trên mơ hình gây u hạt viên tẩm carragenan 1%: hai mức liều 150 mg/kg, 300 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S viridiflavens liều 170 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S venosa có tác dụng làm giảm khối lượng u hạt tươi u hạt khô - Đã đánh giá tác dụng gây độc dòng tế bào ung thư dày (AGS), ung thư tiền liệt tuyến (Hela), ung thư gan (HepG2) ung thư vú (MCF7) loài nghiên cứu số chất phân lập từ hai loài: Roemerin (SVB7), Stepharin (SVB12), Stephanin (SE3) O3 Methylbulbocapnin (SE6) thể hoạt tính với IC50 = 7,75-19,46 µg/ml; cao chiết ethanol 70% từ củ lồi S viridiflavens (BV1), Thaicanin (SVB6.1), Palmatin (SuB2), Crebanin (SE5) thể hoạt tính với IC50 khoảng 43,06 đến 74,89 µg/ml; cao chiết ethanol 70% từ củ loài S venosa (BV2), L-tetrahydropalmatin (SVB4), Liriodenin (SVB13.1), Dehydrocrebanin (SE1), Jatrorrhirin (SB2) hoạt tính nồng độ nghiên cứu Đây công bố tác dụng gây độc số dòng tế bào ung thư hợp chất Việt Nam - Đã xác định tác dụng chống oxi hóa thơng qua việc ức chế q trình peroxy hoá lipid màng tế bào (MDA), cho thấy hợp chất Roemerin (SVB7), Thaicanin (SVB6.1), Stephanin(SE3) Crebanin (SE5) có tác dụng với IC50 34,30 – 73,06 µg/ml Các mẫu cao chiết ethanol 70% từ củ loài S venosa S viridiflavens khơng có tác dụng chống oxy hóa mơ hình thử nghiệm (MDA dọn gốc tự DPPH) Ý nghĩa luận án - Giám định tên khoa học hai mẫu dược liệu giúp cho kết nghiên cứu hóa học tác dụng sinh học khẳng định rõ nguồn gốc - Xác định đặc điểm vi học góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu - Kết nghiên cứu định tính TLC, định lượng alcaloid tồn phần L-tetrahydropalmatin sở cho nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn hai dược liệu sau này, từ kiểm sốt nâng cao chất lượng dược liệu - Kết nghiên cứu phân lập phát hợp chất lần phân lập từ chi Stephania Lour, hai loài S.venosa, S.viridiflavens, bổ sung thêm hiểu biết thành phần hóa học hai lồi nghiên cứu góp phần định hướng cho nghiên cứu tác dụng sinh học sau - Kết nghiên cứu độc tính cấp thử tác dụng sinh học góp phần giải thích phần kinh nghiệm sử dụng hai lồi Bình vơi dân gian Là sở khoa học để ứng dụng rộng rãi việc sử dụng hai dược liệu điều trị bệnh nghiên cứu phát triển thuốc mới, góp phần nâng cao hiệu sử dụng dược liệu Bố cục luận án Luận án gồm chương, 42 bảng, 48 hình, 213 tài liệu tham khảo, phụ lục Luận án có 138 trang gồm phần chính: đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (26 trang), nguyên vật liệu, trang thiết bị, nội dung phương pháp nghiên cứu (14 trang), kết nghiên cứu (68 trang), bàn luận (25 trang), kết luận kiến nghị (3 trang) B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN Đã tập hợp trình bày có hệ thống kết nghiên cứu từ trước tới thực vật học, thành phần hóa học tác dụng sinh học chi Stephania Lour., hai loài S.venosa, S.viridiflavens giới Việt Nam CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu Nguyên liệu nghiên cứu củ, thân, lá, hoa, quả, hạt Bình vơi thu hái địa điểm: Bà Rịa – Vũng Tàu (mẫu M1) Văn Chấn - Yên Bái (mẫu M2), trồng Vườn thực vật Trường ĐH Dược Hà Nội vườn nghiên cứu Ba Trại - Ba Vì (12 cá thể M1 37 cá thể mẫu M2), để theo dõi, thu hoa, quả, hạt đồng điều kiện sinh trưởng, phân tích đặc điểm thực vật (từ năm 2014 đến 2019) Mẫu thân, lá, củ rửa sạch, nghiên cứu đặc điểm vi học hóa học Củ sấy khô 55oC, nghiền thành bột, ngâm với dung môi ethanol 70%, cô thành cao đặc (cao BV1 từ lồi Bình vơi thu n Bái cao BV2 từ lồi Bình vơi thu Bà Rịa - Vũng Tàu) để thử tác dụng sinh học Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, hai giống, trọng lượng 20±2g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột cống trắng chủng Wistar, giống đực, trọng lượng 120±20g, 8-10 tuần tuổi, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Học Viện Quân Y cung cấp Các dòng tế bào ung thư AGS (ung thư dày người), Hela (ung thư tiền liệt tuyến người), HepG2 (ung thư gan người), MCF7 (ung thư vú người) GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Tiến hành quan sát mô tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng phát triển thực địa; làm tiêu mẫu cây; phân tích, chụp ảnh mơ tả lại đặc điểm thực vật - Giám định tên khoa học sở phân tích đặc điểm hình thái, đặc điểm phận sinh sản, so sánh với tài liệu phân loại thực vật, khóa phân loại chi Stephania, công bố gốc, tiêu lưu trữ với giúp đỡ chuyên gia thực vật học - Nghiên cứu đặc điểm vi học: cắt làm tiêu vi phẫu thân, lá, cuống lá, soi bột lá, củ hai loài nghiên cứu, quan sát đặc điểm, mô tả chụp ảnh tiêu - Định tính nhóm chất hữu củ hai lồi nghiên cứu phản ứng hóa học Định tính sắc ký lớp mỏng với mỏng Silica gel GF254 - Chiết xuất hợp chất từ dược liệu phương pháp ngâm chiết với hỗn hợp methanol : nước [85:15], sau chiết phân đoạn với dung mơi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dichloromethan, n-butanol - Phân lập chất phân đoạn cột sắc ký silicagel pha thường pha đảo sephadex LH 20, kiểm tra sơ độ sắc ký lớp mỏng, quan sát ánh sáng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm 366 nm, dùng thuốc thử Dragendorff để màu sắc ký lớp mỏng - Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập dựa vào điểm chảy, [αD], phổ khối (MS), GC-MS, phổ khối phân giải cao (HR-MS), cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều, đối chiếu với tài liệu cơng bố - Định lượng alcaloid tồn phần phương pháp acid – base theo Dược điển Việt Nam III - Định lượng L-tetrahydropalmatin (rotundin) phương pháp HPLC theo Dược điển Việt Nam V - Đánh giá độc tính cấp xác định LD50 chuột nhắt trắng theo đường uống phương pháp Litchfield – Wilcoxon theo hướng dẫn WHO - Đánh giá tác dụng giảm đau chuột nhắt trắng phương pháp gây quặn đau acid acetic (phương pháp Koster, chất đối chiếu indomethacin) phương pháp đo đau mâm nóng (chất đối chiếu codein) - Đánh giá tác dụng chống viêm cấp chuột cống trắng mơ hình gây phù chân chuột carragenin - Đánh giá tác dụng chống viêm mạn phương pháp gây u hạt thực cách cấy hạt tiệt trùng tẩm carragenan 1% vào da lưng chuột cống trắng - Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư in vitro theo phương pháp Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) - Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa phương pháp chống oxi hóa thơng qua ức chế q trình peroxidation lipid màng tế bào (thử nghiệm MDA) phương pháp dọn gốc tự DPPH - Các số liệu thực nghiệm xử lý theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng cơng cụ phân tích số liệu (Data analysis) Microsoft Excel CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết nghiên cứu thực vật 3.1.1 Đặc điểm thực vật Đã mô tả chi tiết, đầy đủ, kèm theo ảnh chụp ảnh vẽ phận quan dinh dưỡng (củ, thân, lá), quan sinh sản (cụm hoa, hoa, đài, tràng, nhị, nhụy, quả, hạt) loài nghiên cứu 3.1.2 Kết giám định tên khoa học Trên sở phân tích đặc điểm thực vật đối chiếu với khóa phân loại, so sánh với tài liệu tham khảo, tiêu lưu trữ với giúp đỡ chuyên gia thực vật học, hai mẫu nghiên cứu thẩm định là: Stephania.venosa (Bl.) Spreng (thu hái Bà Rịa Vũng Tàu), Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang (thu hái huyện Văn Chấn, Yên Bái), họ Tiết dê (Menispermaceae) 3.1.3 Đặc điểm vi học lồi nghiên cứu Đã mơ tả chi tiết, đầy đủ, kèm theo ảnh chụp đặc điểm vi học gồm: vi phẫu thân, cuống và số đặc điểm soi bột lá, bột củ hai loài nghiên cứu 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC 3.2.1 Kết định tính lồi nghiên cứu (M1 M2) - Định tính phản ứng hóa học đặc trưng cho thấy củ lồi Bình vơi nghiên cứu có nhóm chất: alcaloid, tanin, flavonoid, đường khử, sterol, tinh bột, riêng chất béo có lồi S venosa - Định tính sắc ký lớp mỏng: sử dụng dung môi toluen - aceton - ethanol - amoniac [45 : 45 : : 3], mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck) sơ phân biệt hai loài nghiên cứu 3.2.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ hai loài nghiên cứu 3.2.2.1 Chiết xuất, phân lập hợp chất từ củ loài Stephania venosa Mẫu củ S venosa sau thu hái rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô nhiệt độ 45-50oC, sau nghiền thành bột thơ 1,5 kg bột thô ngâm chiết với methanol – nước [85 : 15] nhiệt độ phòng (3 lần, 24h/lần) Sau cất loại dung môi áp suất giảm, thu dịch đậm đặc, thêm 100 mL nước, lắc chiết phân bố với ethyl acetat butanol Cất loại dung môi áp suất giảm thu 40,5 g 66,0 g cặn chiết tương ứng Lấy 66,0 g cặn chiết BuOH phân lập cột silicagel, rửa giải hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH với lượng MeOH tăng dần từ 5-100% thu 10 phân đoạn Phân đoạn tinh chế qua cột Sephadex LH20, dung môi rửa giải MeOH thu hợp chất ký hiệu SB3 (17mg) Phân đoạn phân lập qua cột Sephadex LH20, dung môi rửa giải methanol thu chất ký hiệu SB1 (8mg) SB4 (10mg) Phân đoạn tinh chế qua cột Sephadex LH20 với dung môi MeOH thu chất SB2 (7mg) Lấy 40,5g cặn chiết EtOAc phân lập qua cột Silicagel, rửa giải hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH với lượng MeOH tăng dần – 30% thu 20 phân đoạn Phân đoạn bốc tự nhiên xuất tủa, lọc, rửa tủa với MeOH lạnh thu chất SE1 (173mg) Phân đoạn phân lập tiếp cột silicagel thu chất SE2 (138mg) Phân đoạn bốc tự nhiên xuất tủa, lọc lấy tủa, rửa nhiều lần MeOH thu chất SE8 (52mg) Tinh chế phân đoạn (210mg) cột Sephadex LH20, dùng dung môi MeOH rửa giải thu chất SE7 (100mg) Tinh chế phân đoạn 10 (710mg) cột silicagel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 : aceton [10:1  4:1] thu hợp chất SE3 (65mg) Phân đoạn 12 (1,24g) phân lập cột silicagel dùng hệ dung môi CH2Cl2 : aceton [4 : 0,7] rửa giải thu SE5 (120mg) SE6 (SDLE1.1) (70mg) Phân đoạn 16 để bốc tự nhiên xuất tủa, lọc, kết tinh lại nhiều lần MeOH thu SE9 (21mg) 3.2.2.2 Chiết xuất, phân lập hợp chất từ củ loài Stephania viridiflavens 2,0 kg bột củ S viridiflavens ngâm chiết với hỗn hợp MeOH : H2O (85 : 15, v/v) nhiệt độ phịng (3 lần, 24h/lần) Cất loại dung mơi áp suất giảm thu cặn MeOH Cặn hòa 100 ml nước chiết phân bố với dung mơi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dichloromethan n-butanol, sau cất loại dung môi thu 12,1 g, 83,2 g 52,0 g cặn chiết tương ứng Lấy 52,0 g cặn chiết butanol phân lập cột silicagel, rửa giải hệ dung mơi CH2Cl2 : phía trường thấp với δH có giá trị khoảng 6,51- 7,87 ppm cho tín hiệu proton thơm có dạng pic độ chuyển dịch hóa học tương tự tín hiệu H-3, H-9, H-10 H-11 chất SB1 SB2 Ngoài ra, phổ 1H-NMR SB3 xuất doublet có số tương tác J = 3,0 Hz δH 5,40 5,44; vùng trường cao khơng xuất tín hiệu doublet kép proton C-7 khung aporphin alcaloid (thường xuất δH ~ 2,30 3,30 ppm) Điều cho phép dự đoán SB3 hỗn hợp aporphin alcaloid bị hydroxyl hóa vị trí C-7 Phổ khối ESI-MS SB3 cho pic ion phân tử m/z = 326,0 [M+H]+ 356,0 [M+H]+ So sánh liệu phổ 1H- 13C-NMR SB3 so với tài liệu tham khảo cho phép xác định có chất SB3 ayuthianin sukhodianin * Hợp chất SB4: Stepharin (C18H19NO3): bột màu vàng Phổ H-NMR chất SB4 cho tín hiệu proton thơm δH 7,02 (1H, dd, J = 10,0, 2,5 Hz, H-12), 6,89 (1H, dd, J = 10,0, 2,0 Hz, H-8), 6,41 (1H, dd, J = 10,0, 2,0 Hz, H-9), 6,29 (1H, dd, J = 10,0, 2,0 Hz, H-11); nhóm methoxy δH 3,81 (3H, s, 2-OMe), 3,60 (3H, s, 1-OMe) proton aliphatic δH 4,31 (1H, dd, J = 10,5, 6,5 Hz, H-6a), 3,46 (1H, dd, J = 12,5, 6,5 Hz, H-5α), 3,19-3,13 (1H, m, H-5β), 2,85-2,79-2,71 (2H, H-4), 2,41 (1H, dd, J = 12,0, 6,5 Hz, H-7β), 2,22 (1H, dd, J = 11,5, 6,0 Hz, H-7α) Phổ 13C-NMR cho tín hiệu nhóm carbonyl δC 186.18, 10 tín hiệu carbon vòng A D δC 153,52 - 112,34 Ngồi ra, cịn có tín hiệu nhóm methylen δC 48,27 (C-7), 44,95 (C-5), 26,15 (C-4); nhóm methoxy δC 61,04 (1-OMe), 56,36 (2-OMe), carbon methin (δC 57,70) carbon bậc (δC 51,19) Các liệu phổ cho thấy chất SB4 aporphin alcaloid có chứa nhân dienon phân tử So sánh liệu phổ NMR chất SB4 với liệu phổ tài liệu tham khảo, cho phép kết luận chất SB4 stepharin - Hợp chất SE1: Dehydrocrebanin (C20H19NO4): bột màu vàng nâu Phổ ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z 338,0 [M+H]+, tương ứng với công thức C20H19NO4 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8,64 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-11), 7,00 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-10), 6,86 (1H, s, H-3), 6,84 (1H, s, H-7), 6,17 (2H, s, H-12), 3,98 (3H, s, 9-OCH3), 3,97 (3H, s, 8OCH3), 3,35 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-5), 3,19 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-4), 3,11 (3H, s, N-CH3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 150,21 (C-9), 145,18 (C-2), 144,10 (C-1), 141,63 (C-6a), 141,59 (C-8), 129,49 (C-7a), 127,53 11 (C-3a), 123,38 (C-11), 118,67 (C-6b), 118,31 (C-11a), 117,48 (C-11b), 108,63 (C-10) Kết hợp phổ 13C-NMR, phổ DEPT 90 DEPT 135 cho thấy phẩn tử SE1 có 20 nguyên tử carbon, có 10 carbon khơng liên kết với hydro, carbon CH, carbon CH2 carbon CH3 Phổ 1HNMR vùng trường thấp có singulet δH 6.86 6,84 ứng với H-3 H-7, doublet δH 8,64 (J = 9,0 Hz) 7,00 ppm (J= 9,0 Hz) đặc trưng cho hai proton vị trí ortho vịng thơm bị vị trí carbon (H11, H-10) Ngồi ra, cịn cho tín hiệu singulet δH 3.11 đặc trưng cho nhóm N-CH3, triplet δH 3,35 ppm 3,19 ppm nhóm CH2 vị trí và tín hiệu hai nhóm OCH3 vị trí C8 C9 δH 3,98 3,97 Kết hợp liệu phổ 1H-, 13C-NMR pic ion giả phân tử m/z 338,0 [M+H]+, công thức phân tử SE1 xác định C20H19NO4 So sánh liệu phổ NMR SE1 với dự liệu phổ dehydrocrebanin công bố thấy hồn tồn phù hợp Vậy SE1 dehydrocrebanin * Hợp chất SE2: chất kết tinh màu trắng ngà Phổ 1H-NMR SE2 cho tín hiệu proton olefin δH 5,39-5,32 (6H, m), proton bis-allylic δH 2,77 (4H, t, J=6,5 Hz) Ngồi cịn cho thấy có mặt nhóm methylen liên kết với nhóm carbonyl δH 2,34 (4H, t, J=7,5 Hz), nhóm methyl gắn với nhóm –CH2 với tín hiệu triplet δH 0,89, 0,88 (2хt, J=7,0 Hz, 6H) Phổ 13C-NMR SE2 cho tín hiệu nhóm carboxylic acid δC 180,25, carbon olefin δC 130,26- 127,94 Phân tích SE2 phương pháp GC-MS cho thấy SE2 hỗn hợp acid béo, có thành phần xác định là: acid linoleic (37,49%), acid vaccenic (37,31%) acid palmitic (16,39%) * Hợp chất SE3: Stephanin (C19H19NO3): bột màu vàng Phổ HRESI-MS m/z: 310,1441 [M+H]+ cho biết công thức phân tử C19H19NO3 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ, ppm, J/Hz): δ 7,71 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-11), 7,26 (1H, dd, J = 8,0, 8,0 Hz, H-10), 6,83 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-9), 6,55 (1H, s, H-3), 6,05 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-12a), 5,91 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-12b), 3,87 (3H, s, 8-OCH3), 3,68 (1H, dd, J = 15,0, 4,5 Hz, H-7), 3,14-3,03 (3H, m, H-4a, H-5a & H-6a), 2,62 (1H, dd, J = 16,0, 3,5 Hz, H-4b), 2,57 (3H, s, N-CH3), 2,51 (1H, td, J = 11,5, 3,5 Hz, H-5b), 2,20 (1H, dd, J = 14,5, 14,0 Hz, H-7b) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ, ppm): δ 156,25 (C-8), 146,65 (C-2), 142,72 (C-1), 132,16 (C11a), 127,17 (C-6b), 127,06 (C-10), 126,45 (C-3a), 123,79 (C-7a), 119,47 (C-11), 116,58 (C-11b), 109,69 (C-9), 107,55 (C-3), 100,64 (C12 12), 61,84 (C-6a), 55,59 (8-OCH3), 53,66 (C-5), 43,96 (-NCH3), 29,16 (C-4), 25,96 (C-7) Phổ 13C-NMR DEPT cho tín hiệu 19 nguyên tử carbon gồm nhóm methoxy δC 55,59, nhóm –NCH3 δC 43,96; carbon methylen gồm carbon dioxymethylen δC 100,64, carbon nhóm -NCH2- δC 53,66; carbon methin nhân thơm δC 107,55, 109,69, 119,47, 127,06, carbon NCH- δC 61,84; carbon bậc bốn Các liệu cho phép dự đoán chất SE3 aporphin alcaloid có nhóm -OCH3 vịng D Từ việc phân tích số liệu phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc SE3 xác định stephanin * Hợp chất SE5: Crebanin (C20H21NO4): bột màu nâu HR-ESIMS m/z: 340,1547 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C20H21NO4 H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ, ppm, J/Hz ): δ 7,80 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11), 6,87 (1H, dd, J = 8,5 Hz, H-10), 6,52 (1H, s, H-3), 6,05 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-12a), 5,90 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-12b), 3,90 (3H, s, 9-OCH3), 3,81 (3H, s, 8-OCH3), 3,67 (1H, dd, J = 14,5, 4,5 Hz, H-7), 3,16-3,03 (3H, m, H-4a, H-5a & H-6a), 2,62 (1H, dd, J = 16,0, 3,5 Hz, H-4b), 2,58 (3H, s, NCH3), 2,52 (1H, td, J = 11,5, 3,5 Hz, H-5b), 2,29 (1H, dd, J = 14,5, 14,0 Hz, H-7b) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ, ppm): δ 152,07 (C-8), 146,65 (C-2), 145,90 (C-9), 142,12 (C-1), 129,68 (C-7a), 126,43 (C-6b), 124,61 (C-11a), 123,12 (C-11), 116,54 (C-11b), 110,34 (C-10), 106,83 (C-3), 100,64 (C-12), 61,89 (C-6a), 60,72 (8OCH3), 55,78 (9OCH3), 53,60 (C-5), 43,82 (NCH3), 29,02 (C-4), 26,84 (C-7) * Hợp chất SE6 (SDLE1.1): O-Methylbulbocapnin (C20H21NO4): bột màu trắng HR-ESI-MS m/z: 340,1546 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C20H21NO4 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ, ppm, J/Hz): δ 7,83 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-8), 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-9), 6,65 (1H, s, H-3), 6,11 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-12a), 5,97 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-12b), 4,33-4,31 (1H, m, H-6a), 3,88 (3H, s, 10-OCH3), 3,86 (3H, s, 11-OCH3), 3,81-3,78 (2H, m, H-5a & H-7a), 3,54 (1H, dt, J = 12,5, 4,5 Hz, H-5b), 3,35-3,28 (1H, m, H-4a), 3,18 (3H, s, N-CH3), 2,98 (1H, dd, J = 17,5, 4,0 Hz, H-4b), 2,61 (1H, dd, J = 14,5, 14,0 Hz, H-7b) 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ, ppm): δ 153,88 (C-10), 150,01 (C-2), 147,13 (C-11), 144,61 (C-1), 126,76 (C-7a), 124,99 (C-6b), 124,73 (C-8), 124,51 (C-11a), 120,69 (C-3a), 117,59 (C-11b), 112,84 (C-9), 107,77 (C-3), 102,77 (C12), 62,99 (C-6a), 61,21 (11-OCH3), 56,40 (10-OMe), 53,84 (C-5), 49,50-48,48 (N-Me), 26,90 (C-4), 25,41 (C-7) 13 * Hợp chất SE7: L- tetrahydropalmatin (C21H25NO4): bột màu trắng ESI-MS: m/z 356,1 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C21H25NO4 tnc = 144-145,0oC, [α]D25 = -123 o (nồng độ 0,5%, CHCl3) H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ, ppm, J/Hz): δ 6,88 (1H, dd, J = 8,5 Hz, H-12), 6,79 (1H, dd, J = 8,5 Hz, H-11), 6,74 (1H, s, H-1), 6,62 (1H, s, H-4), 4,24 (1H, d, J = 15,5, H-8eq,), 3,89 (3H, s, 2-OCH3), 3,87 (3H, s, 9-OCH3), 3,86 (3H, s, 3-OCH3), 3,85 (3H, s, 10-OCH3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ, ppm): δ 150,28 (C-10), 147,56 (C-2), 147,47 (C-3), 145,07 (C-9), 129,44 (C-13b), 128,35 (C-12a), 127,56 (C-8a), 126,65 (C4a), 123,82 (C-12), 111,38 (C-4), 111,05 (C-11), 108,63 (C-1), 60,15 (9OCH3), 59,26 (C-13a), 56,07 (2-OCH3), 55,86 (3-OCH3), 55,82 (10OCH3), 53,87 (C-8), 51,42 (C-6), 36,12 (C-13), 28,91 (C-5) * Hợp chất SE8: β-sitosterol (C29H50O): bột màu trắng 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 5,38 (1H, m, H-6), 3,53 (1H, m, H-3), 1,03 (3H, s, CH3-19), 0,95 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-21), 0,87 (3H, t, J = 7,4, CH3-29), 0,86 (3H, d, J = 6,7, CH3-26), 0,84 (3H, d, J = 6,7, CH3-27), 0,71 (3H, s, CH3-18) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 140,79 (C-5); 121,72 (C-6), 71,83 (C-3); 56,80 (C-14); 56,10 (C-17); 50,18 (C-9); 45,88 (C-24); 42,35 (C-4); 42,34 (C-13); 39,81 (C-12); 37,29 (C-1); 36,53 (C-10); 36,16 (C-20); 33,99 (C-22); 31,94 (C-7, C-8); 31,70 (C-2); 29,20 (C-25); 28,26 (C-16); 26,14 (C-23); 24,32 (C-15); 23,11 (C-28); 21,11 (C-11); 19,83 (C-19); 19,41 (C-27); 19,06 (C-26); 18,80 (C-21); 12,00 (C-29), 11,88 (C-18) * Hợp chất SE9: β-sitosterol glucosid: chất bột màu trắng, H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) J (Hz): 5,33 (1H, br s), 4,60 (3H, m), 4,24 (1H, d, J = 8,0 Hz), 3,67 (1H, d, J = 10,5 Hz), 3,48 (2H, br s), 2,95 (1H, t, J = 7,5 Hz), 2,38-2,36 (1H, m), 2,18-2,15 (1H, m), 1,991,96 (2H, m), 0,98 (3H, s), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,83 (3H, t, J = 7,5 Hz), 0,67 (3H, s) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 140,34 (C-5), 120,71 (C-6), 100,68 (C-1’), 76,89 (C-3’), 76,66 (C-5’), 76,41 (C-2’), 73,31 (C-4’), 70,14 (C-3), 61,06 (C-6’), 55,95 (C-17), 55,32 (C-14), 49,46 (C-9), 45,06 (C-24), 41,64 (C-13), 38,17 (C-4), 36,58 (C-1), 35,97 (C-10), 35,12 (C20), 33,23 (C-22), 31,23 (C-8), 31,09 (C-7), 29,02 (C-2), 28,70 (C-25), 27,35 (C-16), 25,63 (C-23), 23,52 (C-15), 22,47 (C-28), 20,32 (C-11), 19,30 (C-19), 18,71 (C-27), 18,32 (C-21), 11,46 (C-29), 11,35 (C-18) 14 3.2.3.2 Các hợp chất phân lập từ củ loài Stephania viridiflavens Từ củ loài S viridiflavens phân lập hợp chất, ký hiệu SVB7, SVB6.1, SVB12, SuB2, SVB4, SVB13.1, SVB2, SVB8 * Hợp chất SVB7: Roemerin (C18H17NO2): bột màu vàng nâu Phổ H-NMR cho tín hiệu đặc trưng cho khung aporphin alcaloid với tín hiệu nhóm methylen [δH 3,84-3,81 (1H, m, H-5a), 3,59-3,55 (2H, m, H-5b&H-7a), 3,37-3,22 (1H, m, H-4a), 3,07-3,03 (1H, m, H-4b), 2,98 (1H, br s, H-7b); δC 54,13 (C-5), 32,48 (C-7), 27,11 (C-4)]; nhóm methin [δH4,43 (1H, br s, H-6a), δC 63,77 (C-6a)] Ở vùng thơm, xuất tín hiệu nhóm methin vịng thơm [δH 8,15-8,13 (1H, m, H-11), 7,41-7,31 (3H, m, H-8, H-9, H-10), 6,76 (1H, s, H-3); δC 108,48, 129,05, 129,51, 129,58, 128,32 (C-3, C-8, C-9, C-10, C-11)] Ngồi ra, cịn cho tín hiệu nhóm dioxymethylen O-CH2-O [δH 6,19 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-12a), 6,04 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-12b); δC 103,01 (C-12)] nhóm -NCH3 [δH3.22 (3H, br s, N-CH3), δC 42.04)] Phổ HMBC cho tương tác H-3 C-4, H-4b C-3; H-8 C-7; H-12 C-1, C-2; H-11 C-7a, C-11b Từ số liệu phổ phân tích, cấu trúc SVB7 xác định roemerin * Hợp chất SVB6.1: Thaicanin (C21H25NO5): bột màu cam Phổ 13 C-NMR chất SVB6.1 có tín hiệu 21 ngun tử carbon với đặc trưng khung isoquinolin gồm: tín hiệu carbon bậc C 152,72-116,20 (trong có carbon có liên kết với nguyên tử oxy), carbon methin nhân thơm C 125,16, 112,69, 101,50 vùng thơm; carbon methylen, carbon methin carbon methoxy phía trường cao Phù hợp với phổ 13C-NMR, phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton thơm δH 6,92 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-12), 6,88 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11), 6,45 (1H, s, H-1); nhóm methoxy δH 3,84 (3H, s), 3,83 (6H, 2×s), 3,78 (3H, s) proton aliphatic nằm khoảng δH 4,19 - 2,50 ppm Phổ HMBC xuất tương tác H12 C-13, H-8a C-10 cho thấy chất SVB6.1 tetrahydroprotoberberin có nhóm vị trí C-1 C-4 Các tương tác H-1 C-13a; H-5 C-4 khẳng định nhóm OH gắn 15 vị trí C-4 Từ liệu phân tích, cấu trúc hóa học chất SVB6.1 xác định thaicanin * Hợp chất SVB12: Stepharin (C18H19NO3): bột màu nâu đỏ Phổ 13 C-NMR xuất tín hiệu 18 carbon, bao gồm carbon bậc 4, carbon methin, carbon methylen hai carbon methyl Trong đó, 10 tín hiệu carbon vịng thơm có tín hiệu cộng hưởng C(ppm) 112,36 đến 153,53, hai nhóm methoxyl C(ppm) 56,37 (C-14) 61,05 (C13), carbon carbonyl C(ppm) 188,45 (C-10), carbon methylen, carbon methin carbon bậc C 26,66 (C-4), 48,65 (C-5), 45,57 (C-7), 58,47 (C-6a) 52,76 (C-12a) Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) có mặt tín hiệu singlet  3,61 (3H, s, 2OCH3) 3,82 (3H, s, 1-OCH3), tương tứng với nhóm methoxyl, Năm proton vịng thơm gồm singlet  6,79 tín hiệu methylen 7,05 (1H, dd, J = 10,0, 2,5 Hz, H-12), 7,22 (1H, dd, J = 10,0, 3,0 Hz, H-8), proton vòng thơm dẫn xuất oxy hóa vị trí 1,2 proaporphin Từ liệu phân tích, cấu trúc hóa học chất SVB12 xác định stepharin * Hợp chất SVB13.1: Liriodenin (C17H9NO3): bột màu vàng nâu H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ 8,87 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-5), 8,59 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11), 8,56 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8), 7,73 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-4), 7,72-7,70 (1H, m, H-10), 7,56 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-9), 7,15 (1H, s, H-3), 6,36 (2H, s, H-12) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ 182,43 (C-7), 151,75 (C-2), 147,94 (C-1), 145,43 (C-6a), 144,92 (C-5), 135,73 (C-3a), 133,90 (C-10), 132,87 (C-11a), 131,33 (C-7a), 128,80 (C8), 128,57 (C-9), 127,35 (C-11), 124,22 (C-4), 123,26 (C-6b), 108,13 (C11b), 103,25 (C-3), 102,48 (C-12) * Hợp chất SVB2 (SVB2A): Capaurin (C21H25NO5): bột màu trắng ngà Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS chất SVB2 cho pic giả ion phân tử m/z: 372,1804 [M + H]+ (tính theo lý thuyết C21H26NO5+ 372,1805), phù hợp với công thức phân tử C21H25NO5 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 9,30 (1H, s, 1-OH), 7,11 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11), 7,05 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-12), 6,63 (1H, s, H-4), 4,7816 4,75 (1H, m, H-8ª), 4,72-4,70 (1H, m, H-13a), 4,47-4,44 (1H, m, H-8b), 3,97 (1H, m, H-6ª), 3,92-3,89 (1H, m, H-6b), 3,83, 3,82, 3,81, 3,70 (ech 3H, 4×s, 4ìOCH3), 2,97-2,89 (2H, m, H-13b, H-5ê), 2,82-2,77 (1H, m, H-5b) 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 152,10 (C-3), 150,49 (C-10), 147,31 (C-1), 144,40 (C-9), 135,38 (C-2), 127,46 (C-4a), 124,49 (C12a), 124,13 (C-12), 122,28 (C-8a), 113,14 (C-11), 112,70 (C-13b), 100,36 (C-4), 60,32 (OCH3), 60,05 (OCH3), 59,14 (C-13a), 56,00 (OCH3), 55,91 (OCH3), 51,19 (C-8), 50,04 (C-6), 32,03 (C-13), 20,31 (C-5) * Hợp chất SVB8: Roseosid (C19H29O8): bột màu trắng 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ 5,99 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-7), 5,89 (1H, s, H-4), 5,75 (1H, dd, J = 15,5, 7,5 Hz, H-8), 4,57-4,54 (1H, m, H-9), 4,29 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’), 3,87 (1H, dd, J = 12,0, 2,0 Hz, H-6a’), 3,66 (1H, dd, J = 12,0, 6,0 Hz, H-6b’), 3,34-3,15 (4H, m, H-2’-4’), 2,63 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-2a), 2,20 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-2b), 1,96 (3H, d, J =1,0 Hz, H-13), 1,31 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-10), 1,06 (3H, s, H-11), 1,04 (3H, s, H12) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ 201,21 (C-3), 167,06 (C-5), 133,71 (C-7), 133,68 (C-8), 127,10 (C-4), 101,23 (C-1’), 79,97 (C-6), 78,33 (C-3’), 78,14 (C-5’), 74,92 (C-2’), 74,63 (C-9), 71,65 (C-4’), 62,80 (C-6’), 50,72 (C-2), 42,39 (C-1), 24,68 (C-12), 23,47 (C-11), 22,23 (C10), 19,54 (C-13) * Hợp chất SuB2: Palmatin (C21H22NO4+): bột màu vàng Phổ H-NMR 13C-NMR đo hoàn toàn trùng khớp với phổ 1H-NMR 13C-NMR SB1 phân lập từ củ lồi bình vơi S.venosa chất tham khảo palmatin tài liệu tham khảo Do đó, kết luận hợp chất SuB2 palmatin * Hợp chất SVB4: L - tetrahydropalmatin (C21H25NO4): bột màu trắng Đối chiếu phổ 1H-NMR 13C-NMR giá trị góc quay cực SVB4 hồn tồn tương đồng với phổ NMR SE7 phân lập từ củ lồi bình vơi S.venosa chất tham khảo L- tetrahydropalmatin tài liệu tham khảo Do đó, kết luận hợp chất SVB4 L- tetrahydropalmatin 17 HO H3CO H3CO N+ N N+ H3CO H3CO H H3CO OCH3 OCH3 OCH3 Palmatin (SB1, SuB2) OCH3 OCH3 OCH3 Jatrorrhizin (SB2 ) L - tetrahydropalmatin (SE7, SVB4) OH H3CO H3CO H3CO NH N H3CO N H3CO H3CO H H OCH3 OH OCH3 OCH3 OCH3 O O N O CH3 Stepharin (SB4, SVB12) O Capaurin (SVB2) Thaicanin (SVB6.1) O N O CH3 N O H H H H H OH CH3 H H H OCH3 OCH3 OCH3 R SB3: Sukhodianin (R=CH3) & Ayuthianin (R=H) O N Stephanin (SE3) Crebanin (SE5) O O OCH3 O CH3 N O CH3 O NCH3 O N O H3CO O OCH3 H3CO OCH3 Dehydrocrebanin (SE1) Liriodenin (SVB13.1) Roemerin (SVB7) O-Methylbulbocapnin (SE6 (SDLE1.1)) H OH H O HO HO beta-sitosterol (SE8) O H H OH HO beta-sitosterol-3-O- beta -D-glucopyranosid (SE9) O OH 12 Acid linoleic (SE2) O Acid vaccenic (SE2) O OH OGlc OH Roseosid (SVB8) OH O Acid palmitic (SE2) Hình Cấu trúc 20 hợp chất phân lập từ hai loài nghiên cứu: S.venosa S.viridiflavens 3.2.4 Kết định lượng alcaloid toàn phần L- tetrahydropalmatin củ loài nghiên cứu - Hàm lượng alcaloid tồn phần (tính theo L-tetrahydropalmatin) xác định phương pháp chuẩn độ acid-base củ loài S venosa S viridiflavens 3,29 ± 0,09 % 3,06 ± 0,07 % (tính theo dược liệu khô tuyệt đối) 18 - Hàm lượng L-tetrahydropalmatin (rotundin) xác định phương pháp HPLC theo Dược điển Việt Nam V củ loài S venosa S viridiflavens 0,49% 1,46% (tính theo dược liệu khô tuyệt đối) 3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 3.3.1 Độc tính cấp lồi nghiên cứu Dựa vào số chuột chết mức liều thử vòng 72 giờ, tính LD50 cao chiết ethanol 70% từ củ loài S.viridiflavens 4875 mg/ kg (CI 95%: 4258 mg/kg – 5709 mg/kg) tương đương 27,07g dược liệu/kg Giá trị LD50 cao chiết ethanol 70% từ củ loài S.venosa 5711 mg/kg (CI 95%: 4971 mg/kg – 6674 mg/kg), tương đương 26,01g dược liệu/kg 3.3.2 Tác dụng giảm đau loài nghiên cứu 3.3.2.1 Tác dụng giảm đau ngoại vi Qua phân tích số quặn đau lô chuột giai đoạn từ 0-30 phút sau gây đau acid acetic, cho thấy: - Lơ indomethacin (0,1 ml/ 10g) có tác dụng giảm đau tốt so với lô chứng (P0,05) 3.3.3 Tác dụng chống viêm loài nghiên cứu 3.3.3.1 Tác dụng chống viêm cấp Phân tích kết đo mức độ phù bàn chân chuột thời điểm giờ, giờ, giờ, sau gây viêm carragenan, cho thấy: - Indomethacin liều 10 mg/kg thể tác dụng chống viêm tốt thời điểm sau giờ, giờ, giờ; tỷ lệ ức chế 40,33 % (p < 0,05); 45,45 % (p < 0,01) 37,13 % (p < 0,05) - Cao BV1 hai mức liều thử 150 mg/kg 300 mg/kg tác dụng ức chế phù bàn chân chuột thời điểm nghiên cứu (p >0,05) - Cao BV2 liều 170 mg/kg không làm thay đổi mức độ phù bàn chân chuột thời điểm nghiên cứu Trong liều 340 mg/kg có tác dụng ức chế phù bàn chân chuột thời điểm sau gây viêm, tỷ lệ ức chế so với chứng tương ứng 34,12 % (p < 0,05) 40,58 % (p < 0,01) 3.3.3.2 Tác dụng chống viêm mạn Phân tích mức độ tăng khối lượng u hạt tươi khơ thí nghiệm gây viêm mạn, cho thấy: - So với lô chứng, cao BV1 liều 150 mg/kg làm giảm khối lượng u hạt tươi khô 36,7 % 38,8 % (p < 0,01), liều 300 mg/kg làm giảm tương ứng 23,2 % 20,6 % (p < 0,05) Cao BV2 liều 170 mg/kg làm giảm khối lượng u hạt tươi 28,9 % u hạt khô 26,7 % so với chứng (p < 0,05), cịn mức liều 340 mg/kg khơng thể tác dụng chống viêm mạn 20 Trên mơ hình này, prednisolon liều mg/kg thể tác dụng chống viêm mạn rõ rệt, làm giảm 71,4% khối lượng u hạt tươi 80,6% khối lượng u hạt khô so với lô chứng (p < 0,01) 3.3.4 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào số dòng tế bào ung thư cao chiết tổng chất phân lập từ loài nghiên cứu Hai mẫu cao BV1, Cao BV2, 11 hợp chất (SVB4, SVB7, SVB6.1, SVB12, SVB13.1, SuB2, SE1, SE3, SE5, SE6, SB2) phân lập từ củ loài nghiên cứu đánh giá hoạt tính gây độc với dịng tế bào ung thư AGS, Hela, HepG2, MCF7 Kết cho thấy mẫu SVB7 (Roemerin), SVB12 (Stepharin), SE3 (Stephanin) SE6 (OMethylbulbocapnin) thể mức hoạt tính tốt với IC50 = 7,75-19,46 µg/ml dòng tế bào khác nhau; mẫu Cao BV1, SVB6.1 (Thaicanin), SuB2 (Palmatin), SE5 (Crebanin) thể mức hoạt tính trung bình với IC50 = 43,06-74,89 µg/ml dòng tế bào khác Các mẫu lại khơng thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu Chất đối chứng dương Ellipticin có tác dụng ổn định thí nghiệm 3.3.5 Hoạt tính chống oxi hóa lồi nghiên cứu Hai mẫu cao BV2 (S.venosa), BV1 (S.viridiflavens) 11 chất phân lập từ củ lồi nghiên cứu đánh giá hoạt tính chống peroxyl hóa lipid màng tế bào (thử nghiệm MDA) Kết cho thấy: mẫu SVB7, SVB6.1, SE3, SE5 thể hoạt tính chống oxi hố thơng qua việc ức chế q trình peroxy hố lipid màng tế bào (MDA) với IC50 34,30 – 73,06 µg/ml Các mẫu cịn lại chưa thể hoạt tính chống oxi hố thơng qua việc ức chế q trình peroxy hố lipid màng tế bào (MDA) nồng độ nghiên cứu Chất đối chứng Trolox có hoạt tính ổn định thí nghiệm Trong thử nghiệm dọn gốc tự DPPH, giá trị IC50 đối chứng dương quercetin, mẫu cao BV1 BV2 xác định là: 4,23 µg/mL, 458,1 µg/mL 257,0 µg/mL Cả hai cao chiết BV1 BV2 khơng có tác dụng chống oxy hóa CHƯƠNG BÀN LUẬN Đã có số ý kiến bàn luận giá trị khoa học ý nghĩa thực tiễn kết nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học, độc tính tác dụng sinh học loài 21 KẾT LUẬN VỀ THỰC VẬT - Đã mô tả chi tiết quan dinh dưỡng sinh sản loài nghiên cứu giám định tên khoa học loài thu hái Bà Rịa, Vũng Tàu Stephania venosa (Bl.) Spreng, loài thu hái Văn Chấn, Yên Bái Stephania viridiflavens H S Lo & M Yang Trong đó, lồi S viridiflavens lần mơ tả đầy đủ đặc điểm quả, hạt - Đã xác định đặc điểm vi phẫu thân, cuống lá, lá, bột bột củ lồi nghiên cứu, góp phần nhận biết tiêu chuẩn hóa dược liệu VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC - Đã xác định củ lồi bình vơi S venosa S viridiflavens có nhóm chất: alcaloid, tanin, flavonoid, đường khử, sterol, tinh bột; riêng chất béo có lồi S venosa - Đã định tính củ lồi nghiên cứu phương pháp TLC, sử dụng hệ dung môi Toluen - aceton - ethanol - amoniac [45 : 45 : : 3], với hai chất đối chiếu oxostephanin L-tetrahydropalmatin, hình ảnh sắc ký đồ quan sát bước sóng 254 366nm phân biệt hai lồi, góp phần nhận biết tiêu chuẩn hóa hai dược liệu S venosa S viridiflavens - Đã phân lập xác định cấu trúc hóa học 20 hợp chất (12 hợp chất từ S venosa hợp chất từ S viridiflavens), có 16 alcaloid (có alcaloid trùng), glycosid, sterol chất béo Trong có: alcaloid (Jatrorrhizin), chất béo (thành phần là: acid linoleic, acid vaccenic, acid palmitic); sterol (β-sitosterol, β-sitosterol glucosid) lần đầu phân lập từ loài S venosa thu hái từ Bà Rịa – Vũng Tàu; có alcaloid (Roemerin, Thaicanin, Liriodenin, Capaurin), glycosid (Roseosid) lần đầu phân lập từ loài S viridiflavens thu hái Văn Chấn – Yên Bái Hợp chất Roseosid lần đầu công bố phân lập từ chi Stephania - Bằng phương pháp chuẩn độ acid-base xác định hàm lượng alcaloid tồn phần (tính theo L-tetrahydropalmatin) củ lồi S venosa 3,29 ± 0,09%, củ loài S viridiflavens 3,06 ± 0,07% - Bằng phương pháp HPLC, xác định hàm lượng Ltetrahydropalmatin (rotundin) dược liệu khô tuyệt đối củ loài S venosa S viridiflavens 0,49% 1,46% 22 VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC - Đã xác định độc tính cấp theo đường uống chuột nhắt trắng: cao chiết ethanol 70% củ S viridiflavens có LD50 4875 mg/kg (CI 95%: 4258 mg/kg – 5709 mg/kg) tương đương 27,07g dược liệu/kg, S venosa 5711 mg/kg (CI 95%: 4971 mg/kg – 6674 mg/kg) tương đương 26,01 g dược liệu/kg - Đã đánh giá tác dụng giảm đau hai lồi Bình vơi nghiên cứu: + Trên mơ hình đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi, ba mức liều 260 mg/kg, 520 mg/kg, 1040 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S viridiflavens, ba mức liều 290 mg/kg, 580 mg/kg, 1160 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S venosa có tác dụng giảm đau quặn suốt 30 phút thử nghiệm chuột nhắt trắng + Trên mơ hình đánh giá tác dụng giảm đau trung ương, hai mức liều 520 mg/kg, 1040 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S viridiflavens, hai mức liều 580 mg/kg, 1160 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S venosa có tác dụng kéo dài thời gian đáp ứng đau chuột nhắt trắng mâm nóng - Đã đánh giá tác dụng chống viêm cấp viêm mạn hai lồi Bình vơi nghiên cứu: + Trên mơ hình gây phù chân chuột carragenan, liều 340 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S venosa có tác dụng giảm phù bàn chân chuột cống trắng gây carragenan thời điểm với tỉ lệ ức chế phù tương ứng 34,12% 40,58% Cao chiết ethanol 70% củ S viridiflavens tác dụng ức chế phù chân chuột mức liều 150 mg/kg 300 mg/kg + Trên mơ hình gây u hạt viên tẩm carragenan 1%: hai mức liều 150 mg/kg, 300 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S viridiflavens liều 170 mg/kg cao chiết ethanol 70% củ S venosa có tác dụng làm giảm khối lượng u hạt tươi u hạt khô - Đã đánh giá tác dụng gây độc dòng tế bào ung thư dày (AGS), ung thư tiền liệt tuyến (Hela), ung thư gan (HepG2) ung thư vú (MCF7) loài nghiên cứu số chất phân lập từ hai loài: Roemerin (SVB7), Stepharin (SVB12), Stephanin (SE3) OMethylbulbocapnin (SE6) thể hoạt tính với IC50 = 7,75-19,46 µg/ml; cao chiết ethanol 70% từ củ loài S viridiflavens (BV1), Thaicanin (SVB6.1), Palmatin (SuB2), Crebanin (SE5) thể hoạt tính với IC50 23 khoảng 43,06 đến 74,89 µg/ml; cao chiết ethanol 70% từ củ loài S venosa (BV2), L-tetrahydropalmatin (SVB4), Liriodenin (SVB13.1), Dehydrocrebanin (SE1), Jatrorrhirin (SB2) khơng thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu Đây công bố tác dụng gây độc số dòng tế bào ung thư hợp chất Việt Nam - Đã xác định tác dụng chống oxi hóa thơng qua việc ức chế q trình peroxy hố lipid màng tế bào (MDA), cho thấy hợp chất Roemerin (SVB7), Thaicanin (SVB6.1), Stephanin (SE3) Crebanin (SE5) có tác dụng với IC50 34,30 – 73,06 µg/ml Các mẫu cao chiết ethanol 70% từ củ loài S venosa S viridiflavens khơng có tác dụng chống oxy hóa mơ hình thử nghiệm MDA dọn gốc tự DPPH KIẾN NGHỊ Cần có đề tài nghiên cứu sâu đầy đủ nhân giống, trồng thu hái loài Stephania viridiflavens Yên Bái, để phát triển tạo nguyên liệu cho chiết xuất L-tetrahydropalmatin sử dụng y học Khơng nên dùng lồi S venosa để chiết xuất Ltetrahydropalmatin có hàm lượng thấp mà nên dùng lồi S viridiflavens có hàm lượng cao Cần tiếp tục nghiên cứu độc tính bán trường diễn tác dụng dược lý khác để sử dụng có hiệu hợp lý lồi S venosa lồi S viridiflavens 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyễn Quốc Huy, Hồng Văn Thủy (2015), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật loài thuộc chi Stephania Lour thu hái Bà Rịa – Vũng Tàu”, Tạp chí dược học, tập 55, số (2015), tr 43-47 Hoàng Văn Thủy, Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ (2016), “Stephanin crebanin phân lập từ củ loài Stephania venosa (Bl.) Spreng thu hái Bà Rịa – Vũng Tàu”, Tạp chí dược học, tập 56, số (2016), tr 40-42 Hoàng Văn Thủy, Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ (2016), “Hai protoberberin alcaloid phân lập từ lồi Stephania venosa (Bl.) Spreng”, Tạp chí dược học, tập 56, số 12 (2016), tr 71-74 Hoàng Văn Thủy, Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ, Lê Thiên Kim, Bùi Thị Phượng, Phạm Minh Hiền (2018), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật loài thuộc chi Stephania Lour thu hái Văn Chấn - Yên Bái”, Tạp chí dược học, tập 58, số (2018), tr 34-39 Hoàng Văn Thủy, Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ, Lê Thiên Kim (2018), “Phân lập xác định cấu trúc hóa học alkaloid lồi Stephania viridiflavens H.S.Lo et M.Yang mọc Yên Bái”, Tạp chí dược học, tập 58, số (2018), tr 11-16 Hoàng Văn Thủy, Lý Thị Vân Anh, Lê Thiên Kim, Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Quốc Huy, Nguyễn Thùy Dương (2019), “Nghiên cứu tác dụng giảm đau chống viêm hai lồi bình vôi Stephania venosa (Bl.) Spreng Stephania viridiflavens H S Lo & M Yang”, Tạp chí dược học, tập 59, số (2019), tr 24-28 ... tính sinh học, để từ góp phần nâng cao giá trị sử dụng hai lồi Bình vơi Việt Nam, luận án "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour Việt Nam" ,... Stephania Lour, hai loài S.venosa, S.viridiflavens, bổ sung thêm hiểu biết thành phần hóa học hai lồi nghiên cứu góp phần định hướng cho nghiên cứu tác dụng sinh học sau - Kết nghiên cứu độc tính... định tên khoa học hai mẫu nghiên cứu - Xác định đặc điểm vi phẫu thân, cuống lá, lá, đặc điểm bột củ hai lồi nghiên cứu Về thành phần hóa học: - Định tính nhóm chất củ hai lồi nghiên cứu - Định