NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật, THÀNH PHẦN hóa học và THỬ độc TÍNH cấp của cây NGÓT NGHẺO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VÕ VĂN SỸ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÂY NGÓT NGHẺO (GLORIOSA SUPERBA L.), HỌ NGÓT NGHẺO (COLCHICACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI, 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VÕ VĂN SỸ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÂY NGÓT NGHẺO (GLORIOSA SUPERBA L.), HỌ NGÓT NGHẺO (COLCHICACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DHCT MÃ SỐ: 60.72.04.06 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Viết Thân HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Lời với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS NGUYỄN VIẾT THÂN trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình làm luận văn Tôi xin bày tỏ cảm ơn tới: - PGS.TS ĐÀO THỊ VUI- Bộ môn Dược Lực - Đại học Dược Hà Nội - DS Nguyễn Văn Hòa NCS Nguyễn Thanh Tùng- Bộ môn Dược liệuTrường Đại học Dược Hà Nội Cùng toàn thể thầy cô môn Dược liệu môn Dược lực giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trình làm luận văn Tiếp đến muốn gửi lời cảm ơn tới thầy cô trường Đại học Kỹ Thuật Y Dược Đà Nẵng tạo điều kiện cho suốt thời gian qua Cuối muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè động viên, giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2016 Học viên Võ Văn Sỹ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN .2 1.1 Thực vật 1.1.1 Vị trí phân loại chi 1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Ngót nghẻo 1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Gloriosa L 1.1.4 Đặc điểm thực vật phân bố loài Gloriosa superba L 1.2 Thành phần hóa học Ngót nghẻo 1.3 Tác dụng dược lý Ngót nghẻo 10 1.3.1 Tác dụng giảm sinh tinh trùng 10 1.3.2 Tác dụng kháng khuẩn 10 1.3.3 Tác dụng hạ thân nhiệt chuột nhắt trắng 10 1.3.4 Tác dụng tăng thời gian ngủ phenobarbital 10 1.3.5 Tác dụng giảm acid uric 10 1.3.6 Tác dụng giảm độc tính paracetamol 10 3.1.7 Độc tính 11 1.4 Công dụng Ngót nghẻo 11 1.4.1 Thúc đẻ, gây sẩy thai làm cho thai chóng 11 1.4.2 Tẩy giun cho gia súc, trâu bò 11 1.4.3 Chữa rắn, bọ cạp cắn, côn trùng đốt, trĩ, bệnh da kí sinh trùng, hủi 12 1.4.4 Một số công dụng khác 12 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Phương tiện nghiên cứu 13 2.2.1 Hoá chất dụng cụ 13 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 14 2.2.3 Động vật thí nghiệm 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 15 2.3.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 15 2.3.3 Nghiên cứu độc tính cấp 17 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 18 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 19 3.1 Về thực vật 19 3.1.1 Đặc điểm thực vật loài Ngót nghẻo 19 3.1.2 Định tên khoa học 22 3.1.3 Đặc điểm hiển vi Ngót nghẻo 23 3.2 Về hóa học 27 3.2.1 Xác định sơ thành phần hóa học thân rễ Ngót nghẻo 27 3.2.2 Phân lập xác định cấu trúc thành phần hóa học 34 3.3 Về độc tính cấp 44 3.3.1 Chuẩn bị mẫu 44 3.3.2 Thử nghiệm thăm dò 44 3.3.3 Thử nghiệm thức 44 CHƢƠNG BÀN LUẬN 51 4.1 Về phương pháp 51 4.2 Về thực vật 52 4.3 Về hóa học 52 4.4 Về độc tính cấp 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 Kết luận 55 1.1 Về thực vật 55 1.2 Về hóa học 55 1.3 Về độc tính cấp 55 Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Dc Dịch chiết DD Dung dịch EtOH Ethanol H Hạt Ho Hoa TR Thân rễ L Lá IR Infrared refrence MS Mass spectrum (Phổ khối lượng) MeOH Methanol NMR Nuclear magnetic resonance spectrometry (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) UV Ultra violet H- NMR Proton nuclear magnetic resonance spectrometry (Phổ cộng hưởng từ proton) 13 C- NMR 13 C- NMR: Carbon (13) nuclear magnetic resonance spectrometry (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13) DEPT Detortionless enhancement by polarization transfer HMBC Heteronuclear multiple Bond Connectivity HSQC Heteronuclear Single- Quantum Coherence LD50 Lethal Dose 50% Danh mục bảng TT Tên Số trang Bảng 1.1 Một số chất có khung 1.1.A phân lập từ Ngót nghẻo Bảng 1.2 Một số chất có khung 1.1.B phân lập từ Ngót nghẻo Bảng 1.3 Một số chất có khung 1.1.C phân lập từ Ngót nghẻo Bảng 1.4 Một số chất có khung 1.1.D phân lập từ Ngót nghẻo Bảng 3.1: Kết định tính nhóm chất hữu thân rễ 33 Ngót nghẻo Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR hợp chất CS1 40 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR CS2 42 Bảng 3.4 Xác định độ ẩm dược liệu 44 Bảng 3.5 Số chuột chết lô vòng 72 45 10 Bảng 3.6 Mô tả tình trạng chuột lô sau dùng mẫu thử 45 Danh mục hình TT Tên Số trang Hình 1.1 Khung 1.1 A Hình 1.2 Khung 1.1 B Hình 1.3 Khung 1.1 C Hình 1.4 Khung 1.1 D Hình 2.1 Thân rễ Ngót nghẻo 13 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất dự kiến 16 Hình 3.1 Cây Ngót nghẻo thực địa 20 Hình 3.2: Đặc điểm phận Ngót nghẻo 21 Hình 3.3 Mẫu tiêu khô lưu Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam 22 10 Hình 3.4 Vi phẫu Ngót nghẻo 23 11 Hình 3.5 Một số đặc điểm bột Ngót nghẻo 24 12 Hình 3.6 Vi phẫu phần thân mặt đất Ngót nghẻo 25 13 Hình 3.7 Một số đặc điểm bột thân mặt đất Ngót nghẻo 25 14 Hình 3.8 Vi phẫu thân rễ Ngót nghẻo 26 15 Hình 3.9 Một số đặc điểm bột thân rễ Ngót nghẻo 26 16 Hình 3.10 Sắc kí lớp mỏng dịch chiết toàn phần thân rễ Ngót nghẻo 35 17 Hình 3.11 Sắc kí lớp mỏng phần cắn alcaloid 35 18 Hình 3.12 Chất CS1 CS2 phân lập từ Ngót nghẻo 37 19 Hình 3.13 Sắc kí dịch chiết toàn phần Ngót nghẻo chất CS1, CS2 37 20 Hình 3.14 Sắc kí đồ HPLC mẫu CS1 38 21 Hình 3.15 Sắc kí đồ HPLC mẫu CS2 39 22 Hình 3.16 Cấu trúc hóa học hợp chất CS1 40 23 Hình 3.17 Các tương tác HMBC hợp chất CS1 41 24 Hình 3.18 Cấu trúc hóa học hợp chất CS2 42 25 Hình 3.19 Các tương tác HMBC hợp chất CS2 43 26 Hình 3.20 Đồ thị tương quan liều độc tính cao chiết Ngót nghẻo 50 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có hệ sinh thái thực vật đa dạng phong phú Trải qua nhiều năm nghiên cứu tính đến có nhiều loài thực vật bậc cao thực vật bậc thấp dùng làm thuốc Tuy nhiên, có nhiều thuốc sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, nhiều chưa nghiên cứu đầy đủ Cây Ngót nghẻo (Gloriosa superba L.) có tên gọi khác Vinh quang rực rỡ, Ngọt nghẽo, Huệ lồng đèn, Gia lan, Hoa kèn đỏ nhện Loài mọc phổ biến từ Quảng Trị tới Bình Thuận, trồng làm cảnh Theo số nghiên cứu nước dùng y học cổ truyền phổ biến, nguồn nguyên liệu để chiết xuất colchicin để trị bệnh gút Thực tế thị trường có nhiều chế phẩm có thành phần colchicin chiết từ Tỏi độc (Colchicum autumnale L.) sử dụng Hiện nay, Việt Nam Ngót nghẻo chưa sử dụng y học cổ truyền Với mục tiêu xây dựng sở liệu khoa học góp phần đưa Ngót nghẻo vào sử dụng cách hợp lý an toàn, có hiệu tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học thử độc tính cấp Ngót nghẻo (Gloriosa superba L.), họ Ngót nghẻo (Colchicaceae)” Đề tài thực số nội dung sau: - Về thực vật: Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật Nghiên cứu đặc điểm hiển vi mẫu nghiên cứu để làm lý lịch mẫu góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu - Về thành phần hóa học: Sơ xác định nhóm chất thân rễ Chiết xuất phân lập 1-2 chất thân rễ Ngót nghẻo xác định cấu trúc hóa học chất phân lập - Về độc tính: Khảo sát độc tính cấp dịch chiết toàn phần thân rễ Ngót nghẻo CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Thực vật 1.1.1 Vị trí phân loại chi Theo tài liệu Thực vật chí Việt Nam, Ngót nghẻo thuộc chi Gloriosa L., họ Ngót nghẻo (Colchicaceae) [9] Vị trí chi Gloriosa L.,trong hệ thống phân loại thực vật dược tóm tắt sau: Plantae (Giới Thực vật) Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan) Liliopsida (Lớp Hành) Lilidae (Phân lớp Hành) Lilianae (Liên Hành) Liliales (Bộ Hành) Colchicaceae (Họ Ngót nghẻo) Gloriosa (Chi Gloriosa) 1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Ngót nghẻo Cỏ nhiều năm, có thân rễ thân hành củ đất, số thân hóa gỗ, thân thẳng, đơn độc phân cành, bò rút ngắn thành phần đất Lá mọc tập trung gốc mọc cách, mọc đối, mọc vòng thân, phiến hình dải, hình mũi giáo, hình trứng, hình dùi, chóp dài có tua cuốn, gân song song thường rõ giữa, số gân mạng lưới, cuống dạng bẹ không cuống Cụm hoa chùm, chùy, dạng đầu dạng ngù, ngù giả, mọc đỉnh, trục hoa thẳng đứng, đặc rỗng Hoa đều, số không đều, lưỡng tính, nhiều màu sắc, có đốm nhiều màu, thẳng đứng, nằm ngang rũ xuống Bao hoa mảnh, rời dính nhiều, xếp vòng không Tuyến mật gốc bao hoa Nhị 6, nhị dạng sợi, rời đính gốc mảnh bao hoa, bao phấn đính lưng, ô, hình tròn, hình thận, hướng ngoài, mở khe dọc Bầu thượng bán hạ, ô (có 4), dính hoàn toàn phần, ô ít-nhiều noãn; vòi nhụy dài, mảnh; 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.605 3.920 4.022 4.4 3.8 3.7 3.6 3.11 4.5 3.26 4.6 1.41 4.7 3.31 4.558 4.545 4.534 4.521 CS2-MeOD-1H 3.5 ppm 2.8 2.7 2.6 1.21 2.5 2.557 2.544 2.530 2.518 2.3 2.2 1.49 2.1 1.9 1.67 2.0 2.97 2.214 2.202 2.189 2.176 2.164 2.151 2.139 2.014 1.948 1.935 1.924 1.911 1.900 1.885 CS2-MeOD-1H 2.4 1.27 2.344 2.330 2.318 2.304 2.291 2.277 1.8 1.7 1.6 ppm 61.583 61.553 56.977 53.810 49.515 49.344 49.176 49.004 48.835 48.663 48.494 37.334 30.290 22.397 91.059 115.202 112.336 154.514 152.709 152.239 141.335 139.024 137.630 136.021 131.176 125.442 165.338 172.684 180.880 CS2-MeOD-C13CPD Current Data Parameters NAME SY_CS2 EXPNO PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20151106 Time 18.55 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 512 DS SWH 29761.904 Hz FIDRES 0.454131 Hz AQ 1.1010048 sec RG 198.57 DW 16.800 usec DE 6.50 usec TE 302.8 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 125.7879670 MHz NUC1 13C P1 10.00 usec PLW1 88.00000000 W ======== CHANNEL f2 ======== SFO2 500.2020008 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 22.00000000 W PLW12 0.34375000 W PLW13 0.22000000 W F2 - Processing parameters SI 32768 SF 125.7752129 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm 180 180.880 175 172.684 170 165 165.338 160 150 145 140 141.335 135 139.024 137.630 136.021 130 131.176 125 125.442 120 115 115.202 112.336 110 105 100 95 91.059 CS2-MeOD-C13CPD 155 154.514 152.709 152.239 ppm 61.583 61.553 60 56.977 55 53.810 45 40 37.334 35 30 30.290 25 22.397 CS2-MeOD-C13CPD 50 49.515 49.344 49.176 49.004 48.835 48.663 48.494 ppm CS2-MeOD-C13CPD&DEPT DEPT90 190 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm 180 DEPT135 CH&CH3 CH2 190 C13CPD 190 CS2-MeOD-C13CPD&DEPT DEPT90 140 135 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 ppm 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 ppm 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 ppm 130 DEPT135 CH&CH3 CH2 140 135 C13CPD 140 135 CS2-MeOD-HMBC ppm 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 ppm CS2-MeOD-HMBC ppm 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 ppm CS2-MeOD-HMBC ppm 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 ppm CS2-MeOD-HMBC ppm 25 30 35 40 45 50 55 60 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 ppm CS2-MeOD-HMBC ppm 20 25 30 35 40 45 50 55 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 ppm CS2-MeOD-HSQC ppm 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 ppm CS2-MeOD-HSQC ppm 110 112 114 116 118 120 122 124 126 128 130 132 134 136 138 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 ppm CS2-MeOD-HSQC ppm 25 30 35 40 45 50 55 60 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 ppm [...]... rễ cây Ngót nghẻo Chú thích: 1,2 Mảnh biểu bì; 3 Mảnh mạch; 4 Mảnh mô mềm mang tinh bột; 5 Hạt tinh bột 26 Với định hướng đưa phần thân rễ vào thực tế sử dụng trong y học cổ truyền và chiết xuất colchicin, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và độc tính cấp của thân rễ cây Ngót nghẻo 3.2 Về hóa học 3.2.1 Xác định sơ bộ thành phần hóa học trong thân rễ cây Ngót nghẻo Định tính alcaloid:... khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật * Đặc điểm hình thái : Lấy mẫu có hoa, quả, phân tích các đặc điểm về: cây, rễ, lá, hoa, quả, hạt và đối chiếu với khóa phân loại, tham khảo ý kiến của các chuyên gia thực vật Sau đó xác định tên khoa học mẫu nghiên. .. bột mịn, bột dược liệu được quan sát dưới kính hiển vi và được chụp ảnh các đặc điểm bột bằng máy ảnh chuyên dụng [2], [3] 2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học Định tính sơ bộ các nhóm chất hóa học theo phương pháp thường quy thường dùng trong tài liệu “Dược liệu học tập II”, Thực tập dược liệu phần hóa học và “Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc” 15 Quy trình chiết xuất theo sơ đồ sau [11]:... Một phần được ngâm trong hỗn hợp nước - ethanol (1:1) để tiến hành nghiên cứu vi phẫu - Một phần thái thành lát mỏng rồi sấy ở nhiệt độ 55-600C trong tủ sấy có quạt thông gió Sau khi sấy khô, dược liệu được bảo quản trong túi ni lông kín để nơi khô ráo, thoáng mát để làm nguyên liệu nghiên cứu đặc điểm bột, nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính cấp Hình 2.1 Thân rễ cây Ngót nghẻo 2.2 Phƣơng tiện nghiên. .. Hình 3.1 Cây Ngót nghẻo ở thực địa 20 Hình 3.2: Đặc điểm các bộ phận của cây Ngót nghẻo Chú thích : a Cành mang hoa và lá b Mặt trước hoa c Mặt sau hoa d Hoa được tách rời nhau e Nụ hoa g Tua cuốn của lá h Mặt cắt ngang của quả i Quả k Vòi nhụy l Hoa, quả, lá m Quả và mặt cắt dọc của quả n Bao phấn o Thân rễ p,q Mặt cắt ngang và dọc của thân rễ 21 r Phần lá mọc đối s,t Lá 3.1.2 Định tên khoa học Sau... thân rễ Ngót nghẻo được dùng để trị hen suyễn, vô kinh, các chứng viêm như viêm khớp [30] 12 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu cây có hoa được giám định tên khoa học và ép tiêu bản, lưu trữ tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam Phần thân rễ của cây Ngót nghẻo thu hái tại Tam Kỳ, Quảng Nam vào tháng 5/2015 Dược liệu sau khi thu hái, rửa sạch được chia thành 2 phần: ... những đặc điểm: vị đắng, phản ứng Mayer âm tính, với acid clohydric và acid sulfuric cho màu vàng đậm, với acid sulfuric và kali nitrat tinh thể cho màu tím rồi đỏ, với acid nitric đặc cho màu tím đậm với viền màu vàng, với dung dịch Feling chỉ hơi có tác dụng khử, tiêm vào ếch thì ếch chết [12] Nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học của loài Gloriosa superba L rất ít Cho đến nay có nghiên cứu về... Cho đến nay có nghiên cứu về khảo sát thành phần hóa học của cây Ngót nghẻo (Gloriosa superba L.) của Nguyễn Trần Nhật Uyên [14], nghiên cứu cây mọc hoang ở Dốc Lếch, huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa Nghiên cứu đã phân lập được các chất colchicin, O3-demethylcolchicin trong phân đoạn diclorometan và colchicosid ở phân đoạn butanol Nghiên cứu cũng cho biết colchicin và O3-demethylcolchicin có trong cả thân... trường hợp ngộ độc khi sử dụng nhầm thân rễ của cây Ngót nghẻo có các triệu chứng suy đa phủ tạng, xuất huyết toàn thân [34] Theo tài liệu Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, chiết toàn cây Ngót nghẻo bằng cồn 50o, sau đó cô dưới áp suất giảm để được cao khô Tiêm phúc mạc cho chuột nhắt trắng thấy LD50 = 125 mg/kg [1] 1.4 Công dụng của cây Ngót nghẻo Ngót nghẻo có vị rất đắng, độc, có tác dụng... phương pháp sắc kí điều chế theo tài liệu “Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc” [8] 16 Nhận dạng các chất phân lập được dựa trên các thông số lý hóa như nhiệt độ chảy, số liệu các phổ UV, IR, MS, 1H- NMR, 13 C- NMR, DEPT, HMBC, HSQC 2.3.3 Nghiên cứu độc tính cấp Phương pháp thử độc tính cấp theo hướng dẫn của Bộ Y tế kết hợp với hướng dẫn của OECD [5],[7],[24],[25],[26] a Thiết kế thí nghiệm -