Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng diệt sâu của cây dây mật thu hái ở hà giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT SÂU CỦA CÂY DÂY MẬT THU HÁI Ở HÀ GIANG Chuyên ngành: Dược l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN TRỌNG ĐƯỜNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT SÂU CỦA CÂY

DÂY MẬT THU HÁI Ở HÀ GIANG

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT SÂU CỦA CÂY

DÂY MẬT THU HÁI Ở HÀ GIANG

Chuyên ngành: Dược liệu – Dược cổ truyền

Mã số: 60 73 10

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS.,TS Phạm Thanh Kỳ

2 TS Nguyễn Hoành Côi

Hà Nội - 2006

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tôi xin chân thành cám ơn: GS.,

TS Phạm Thanh Kỳ, TS Nguyễn Hoành Côi đã tận tình trực tiếp hướng dẫn

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:

GS., TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn – Chủ tịch hội đồng ngành Sinh học - Đại học quốc gia Hà Nội

PGS., TS Chu Đình Kính – Viện hoá học – Viện khoa học công nghệ Việt Nam

PGS., TS Vũ Xuân Phương - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

TS Hoàng Công Minh – Phó giám đốc Trung tâm phòng chống nhiễm độc – Học viện Quân y

TS Nguyễn Trường Thành – Trưởng bộ môn Thuốc, Cỏ dại và Môi trường – Viện bảo vệ thực vật

TS Dương Đức Huyến – Trưởng phòng thực vật – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

ThS Nguyễn Thế Cường – Cán bộ nghiên cứu – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Cnh Sa Nhật Tâm – Cán bộ nghiên cứu – Sở công nghệ và môi trường

Hà Giang

Đã đóng góp ý kiến quí báu cho tôi thực hiện luận văn này Nhân dịp này, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Thực vật, Bộ môn Dược học cổ truyền, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hoá học - Viện KH và

CN Việt Nam, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện bảo vệ thực vật,

Sở công nghệ và môi trường Hà Giang, Trung tâm phòng chống nhiễm độc – Học viện Quân y và đặc biệt tới Ban giám đốc, các đồng nghiệp khoa NCKN Dược liệu, các khoa, ban thuộc Trung tâm KNNC Dược Quân đội, Cục Quân

y đã luôn luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học và làm luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2007

DS Nguyễn Trọng Đường

MỤC LỤC

1.1 Vị trí phân loại và phân bố của phân họ Đậu 3

1.1.2 Vị trí phân loại và phân bố của chi Milletia và chi Derris 4

1.2 Cây Milletia pachyloba Drake var pachyloba , họ Đậu - Fabaceae 7

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

3.1.1 Mô tả đặc điểm cây và xác định tên khoa học mẫu nghiên cứu 20

3.2 Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 27

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hoá học 27

3.2.4 Xác định sơ bộ các flavonoid trong rễ bằng phương pháp LC-MS 38

3.3 Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học 47

3.3.1 Kết quả nghiên cứu độc tính đối với chuột 47

3.3.3 Kết quả nghiên cứu về tác dụng diệt sâu 52 Chương 4: BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60

H - NMR : Proton Nuclear magnetic resonance

HMQC : Heteronuclea multiple Quantum Corelation

HPLC : High-performance liquid chromatograph

KH và CN : Khoa học và công nghệ

LC-MS : Liquid chromatograph - Mass spetrum

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Millettia ở Việt Nam 4

2 Bảng 1.2: Một số loài thuộc chi Derris ở Việt Nam 6

3 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ 33

4 Bảng 3.2: Kết quả định tính flavonoid bằng SKLM 35

5 Bảng 3.3: Kết quả định tính flavonoid bằng P/ư Cyanidin 38

6 Bảng 3.4: Kết quả phân tích bằng phương pháp LC-MS 39

7 Bảng 3.5: Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 44

8 Bảng 3.6: Kết quả độc tính cấp trên chuột 48

9 Bảng 3.7: Kết quả thử độc tính trên cá Vàng 49

10 Bảng 3.8: Kết quả thử độc tính trên cá Cờ 50

11 Bảng 3.9: Kết quả thử độc tính trên cá Rô 50

13 Bảng 3.11: Mật độ sâu Khoang trước và sau sử lý 52

14 Bảng 3.12: Hiệu lực của thuốc đối với sâu Khoang 53

15 Bảng 3.13: Hiệu lực của thuốc đối với sâu Đục quả 53

16 Bảng 4.1: So sánh đặc điểm thực vật Millitia và Derris 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

2 Hình 3.1: Hình ảnh cây Dây mật tại Hà Giang 21

3 Hình 3.2: Hình ảnh cụm hoa Dây mật tại Hà Giang 21

4 Hình 3.3: Hình ảnh hoa bổ đôi Dây mật tại Hà Giang 21

5 Hình 3.4: Hình ảnh chùm hoa Dây mật tại Hà Giang 22

6 Hình 3.5: Hình ảnh hoa Dây mật tại Hà Giang 22

7 Hình 3.6: Hình ảnh cánh hoa Dây mật tại Hà Giang 22

8 Hình 3.7: Hình ảnh cánh hoa Dây mật tại Hà Giang 22

9 Hình 3.8: Hình ảnh nhị hoa Dây mật tại Hà Giang 22

10 Hình 3.9: Hình ảnh nhuỵ hoa Dây mật tại Hà Giang 22

11 Hình 3.10: Mẫu tiêu bản lưu viện Sinh thái – Tài nguyên 23

12 Hình 3.11: Tiêu bản nghiên cứu lưu Trường Dược HN 23

13 Hình 3.12: Hình ảnh vi phẫu lá Dây mật tại Hà Giang 25

14 Hình 3.13: Hình ảnh vi phẫu thân Dây mật tại Hà Giang 25

15 Hình 3.14: Hình ảnh vi phẫu rễ Dây mật tại Hà Giang 26

16 Hình 3.15: Hình ảnh bột rễ Dây mật tại Hà Giang 26

17 Hình 3.16: Hình ảnh SKLM nhóm flavonoid 41

18 Hình 3.17: Công thức Rotenon theo thư viện phổ 42

19 Hình 3.18: Cấu trúc và dữ liệu Rotenon nghiên cứu 46

20 Hình 3.19: Biểu đồ so sánh nồng độ gây cá chết 51

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đã từ lâu nhân dân các nước châu Á thường dùng cây Dây mật (Derris

elliptica (Roxb.)Benth.- Fabaceae) để duốc cá Nhân dân các nước Trung Quốc, Ấn Độ còn dùng diệt trừ sâu, bọ [17][21][26] Đến khoảng những năm

30 của thế kỷ XX, các nhà khoa học ở châu Âu và châu Mỹ mới nghiên cứu tác dụng diệt, trừ sâu, bọ Ở Việt Nam, tại một số vùng người dân cũng lấy rễ cây Dây mật để duốc cá và trừ dòi hay ký sinh trùng ở trâu, bò Gần đây, năm

2005, Chi cục bảo vệ thực vật tỉnh Hà Giang nghiên cứu thí điểm dùng rễ cây Dây mật mọc tại Hà Giang diệt trừ sâu trên một số loài rau, đã thu được một

số kết quả đáng khích lệ [8] Mặt khác, qua khảo sát bước đầu tại Hà Giang, chúng tôi thấy cây Dây mật mọc trên Hà Giang có một số đặc điểm thực vật khác biệt so với một số tài liệu chúng tôi biết Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng diệt sâu của cây Dây mật thu hái ở Hà Giang” Đề tài có 3 mục tiêu:

1 Xác định đặc điểm thực vật, định tên khoa học mẫu cây

nghiên cứu tại Hà Giang

2 Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học

3 Xác định độc tính cấp trên chuột, trên một số loài cá và đánh

giá tác dụng trên sâu

Để đạt được 3 mục tiêu trên, đề tài thực hiện những nội dung nghiên cứu sau:

Về thực vật

- Mô tả đặc điểm thực vật, xác định tên khoa học mẫu cây nghiên cứu

- Xác định đặc điểm vi phẫu lá, thân và rễ

- Xác định đặc điểm bột dược liệu

Về thành phần hóa học

- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá, thân và rễ

- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng nhóm chất chính có trong dược liệu

- Chiết xuất và phân lập chất chính trong dược liệu

- Nhận dạng chất phân lập được

Về tác dụng sinh học

- Thử độc tính cấp trên chuột và một số loài cá

- Thử tác dụng trên sâu Khoang và sâu Đục quả

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI VÀ PHÂN BỐ CỦA PHÂN HỌ ĐẬU

1.1.1 Vị trí phân loại phân họ Đậu [1][2]

* Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

* Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

* Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)

* Liên bộ Đậu (Fabanae)

- Phân họ Đậu (Faboideae = Papillionoideae): Gồm 400 - 500 chi và 10

000 – 12 000 loài, phân bố khắp thế giới Việt Nam có 90 chi với khoảng trên

450 loài

Theo Phạm Hoàng Hộ [14] chi Milletia có 28 loài và chi Derris có 21

loài

1.1.2 Vị trí phân loại và phân bố chi Milletia và chi Derris [2][35][36]

Chi Milletia thuộc họ Đậu (Fabaceae) phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới

Chi Desris thuộc họ Đậu (Fabaceae) phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới

1.1.2.1 Một số loài thuộc chi Milletia ở Việt Nam [14]

Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Milletia ở Việt Nam

S ố

1 Milletia auriculata Bakerex

Brandis

2 Milletia brandisiana Kurz Mát Brandis Công Tum

3 Milletia cauliflora Gagn Mát hoa ở thân

4 Milletia cinerea Benth Mát tro Sơn Tây

5 Milletia cochinchinensis Gagn Mát Nam Bộ Biên Hoà

6 Milletia coerulea Bak Mát lam Thanh Hoá

7 Milletia diesiana Harms ex

Oliv

Kê huyết đằng, Máu gà núi

dọc sông Hồng

8 Milletia diptera Gagn Mát hai cánh Biên Hoà

9 Milletia eberhardtti Gagn Cổ giải Thừa thiên, Đà

Nẵng

10 Milletia eriobotrya Drake Mát Sơn Trà, Lăng Sơn Tây

11 Milletia erythrocalyx Gagn Mát đài đỏ Đắc Lắc,

Krôngpha

12 Milletia ichthyochtona Drake Thàn mát, mát đánh

cá

Bắc Thái, Hà Sơn Bình,

Thanh Hoá, Nghệ Tĩnh

13 Milletia latifolia Dunn Mát lá rộng

14 Milletia nigrescens Gagn Mát đen Sài Gòn

15 Milletia oosperma Dunn Mát hột tròn Hoàng Liên Sơn

16 Milletia pachyloba Drake var

pachyloba Drake Drake

Mát thuỳ dài, Dây mật

Bạch Mã, Buôn

Mê Thuột

17 Milletia penduliformis Gagn Mát quả lắc

18 Milletia penicillata Gagn Mát cọ

19 Milletia principis Gagn Mát chính

20 Milletia piscidia (Roxb) W &

Arn

Mát giết cá Phan Rang

21 Milletia pubinervis Kurs Mát gân có lông Châu Đốc

22 Milletia pulchra Kurz Mát đẹp, Mát rừng Hà Bắc, Vĩnh

Phú

23 Milletia reticulata Benth Máu gà, Mát mạng

24 Milletia sericea Gagn Mát tơ

25 Milletia setigera Dunn Mát lông tơ Ba Vì

26 Milletia speciosa Champ Mát to

27 Milletia cf spireana Gagn Mát spire Ngọc Lĩnh

1.1.2.2 Một số loài thuộc chi Derris ở Việt Nam [14]

Bảng 1.2: Một số loài thuộc chi Derris ở Việt Nam

Số

1 Derris indica Benn Nim, Dây nim,

Bánh giầy, Pongam

Rừng gần biển

2 Derris trifolia Lour Cóc kèn, Cóc

kèn nước

Sông rạch nước mặn, nước lợ

3 Derris brevipes (Benth) Baker Cóc kèn chân

nước

Phú Khánh

4 Derris alborubra Hemsl Cóc kèn trắng,

đỏ

5 Derris tonkinensis Gagn Cóc kèn Bắc Bộ

6 Derris laotica Gagn Cóc kèn Lào Biển hồ

7 Derris ferruginea Benth Cóc kèn sét Tây Ninh, Đồng

Nai

8 Derris marginata Benth Cóc kèn bìa Côn Sơn, Cần

Thơ

9 Derris elliptica (Sw.) Benth Cổ rùa, Dây mật Đồng Nai

10 Derris thyriflora (Benth.) Benth Cóc kèn dài Rừng bình

nguyên

11 Derris balasae Gagn Cóc kèn Balasa

12 Derris malaccensis (Benth.)

Prain

Cóc kèn MãLai Ven rừng

13 Derris acumilata (Grah.) Benth Cóc kèn mũi Quảng Trị

14 Derris robusta (DC.) Benth Cóc kèn mạnh Buôn Mê Thuật

15 Derris polyphylla (Miq) Benth Cóc kèn nhiều lá Đồng Nai

16 Derris scandens Benth Cóc kèn leo Nam Bộ

17 Derris lancifolia Thuần Cóc kèn lá thon Vùng núi cao,

SaPa

18 Derris heptaphila (L.) Merr Cóc kèn bảy lá Cửa sông

19 Derris gemmifera Thuần Cóc kèn có chồi Lào Cai

20 Derris Microphylla (Miq.) Val Cóc kèn lá nhỏ Rừng dưới 900m

Là dây leo khỏe thân dài 7 – 10m, nhánh mềm, cành non có lông mịn mầu hung đỏ, cành già sần sùi, màu nâu đen, nhẵn không có lông Lá kép gồm

9 – 11 lá chét, cuống lá dài 15 – 20cm, không có rãnh, không có lông, mọc so le; phiến lá chét hình trứng hoặc hình mác ngược, cỡ 6 – 20(25) x 3 – 8(10)cm, gốc lá tù hoặc tròn, chóp lá nhọn, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông mềm; gân bên có 9 – 15 đôi, dẹt ở mặt trên, nổi ở mặt dưới; cuống lá chét dài

2 – 5mm nhẵn hay có lông mịn; lá kèm và lá kèm của lá chét rụng sớm

Cụm hoa mọc ở kẽ lá dài 5 – 25cm, thường tập trung thành 2 – 9 chùm trên một nhánh dài, có lông mịn màu hung; nhánh cụm hoa dài 3 – 5mm,

mang 3 – 5 hoa; cuống hoa dài 4 – 5mm, có lông mịn; lá bắc cụm hoa và lá bắc của hoa hình thuôn nhọn cỡ 1 – 1,5mm, có lông ở mặt ngoài Hoa nhỏ màu trắng hoặc tím, dài 14 – 18mm; đài hoa hình ống cỡ 4 – 5mm, có lông mịn ở mặt ngoài, mép có răng cưa, hình tam giác cỡ 1 – 1,5mm; cánh hoa 5,

có lông mịn mặt ngoài, màu trắng hoặc tím; cánh cờ hình tròn cỡ 10 – 12mm, đỉnh có 2 thuỳ, gốc cụt hoặc hình tim; cánh bên hình thuôn; nhị ngắn hơn cánh bên, chỉ nhị có lông; bầu hình thuôn, không cuống, có lông mịn; vòi nhuỵ dài bằng bầu, không lông; noãn 4 – 6

Quả loại quả đậu, hình dài hoặc bầu dục cỡ 5 – 10 x 2.5 -3 x 2 – 2.5mm, phủ lông nhung bên ngoài, đỉnh có mũi ngắn, gốc tròn hoặc thuôn

Hạt (1)2 – 3(5) hình thuôn

Cây phân bố chủ yếu ở các vùng ven rừng, đồi núi thấp, tái sinh khắp

cả nước Việt Nam

1.3 CÂY DERRIS ELLIPTICA (ROXB.)BENTH., HỌ ĐẬU -

FABACEAE [6][14][36]

1.3.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Cây Derris elliptica (Roxb.)Benth., họ Đậu - Fabaceae Cây còn có tên khác: Cây Dây mật, cây Thuốc cá, dây Duốc cá, dây Cóc, dây Cát, Lầu tía, Tuba root (Anh), Derris (Pháp)

Là một loại dây leo khỏe thân dài 7 – 10m, cành non có lông mịn, cành già sần sùi, màu nâu đen Lá kép gồm 9 – 13 lá chét, mọc so le, dài 25 – 35cm, cuống chung có lông, lá chét lúc đầu mỏng sau dai dày, hình mác, đầu nhọn, phía dưới tròn, dài 7.5 – 15cm, rộng 2,5 – 4cm, có lông mịn ở dưới, gân nổi rõ

Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành chùm dài 15 – 20cm Hoa nhỏ màu trắng hoặc hồng Đài hoa hình phễu, có lông dày dạng mi, răng rất ngắn, cánh hoa

có lông mịn mặt ngoài, cánh có hình mắt chim, có 2 tai ở gốc, nhị 10, bầu có lông, 3 – 4 noãn

Quả loại quả đậu, dẹt, dài 4 – 8cm, rộng 1,5 – 2cm, hạt 1 – 4 Cây con mọc khoảng tháng 4 – 6 trong năm

Cây mọc hoang dại ở các nước Malaixia, Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam và một số nước châu Phi Có thể còn được trồng ở các nước nói trên

1.3.2 Thành phần hóa học

Rễ cây Dây mật chứa 10 – 12% nước, 2 – 3% chất vô cơ, rất nhiều glucid (đường, tinh bột), tanin, chất nhựa

Hoạt chất chính là Rotenon Hàm lượng Rotenon thay đổi từ 0,3 – 12%

có thể lên tới 13% Ngoài ra còn có Sumatrol, deguelin, tephrosin, toxicarol, mackin, eliptiol, acid tubaic, ở lá còn chứa alcaloid có nhân pyrolidin

1.3.3 Tác dụng và công dụng

Dùng duốc cá: Lấy rễ, giã nhỏ, thả bột thô vào vùng nước có cá, ít giờ sau các bị ngạt thở nổi lên trên mặt nước Bắt các con cá đó thả vào nước sạch, cá có thể sống lại

Dùng trừ dòi, ký sinh trùng: Lấy cây tươi làm thành vòng treo lên sừng trâu bò, dòi và ký sinh trùng tự đi

Trừ côn trùng và sâu có hại: Đây là dạng hay dùng nhất Trộn bột rễ với đất sét, thạch cao, bột talc hay dùng bột rễ ngâm trong nước rắc hay phun lên cây, rau có thể diệt được ruồi, muỗi, mối, mọt, sâu có hại

Trong dân gian, người dân còn dùng tẩy giun cho súc vật, chữa ỉa chảy

1.4 ROTENON [2][26][28]

Rotenol (tubotoxin, derrin) được Nagai chiết từ rễ cây Derris chinensis

Benth năm 1902 đến năm 1911 W Lenz phân lập được từ rễ cây Derriss

elliptica Benth.[37]có công thức thô C23H22O6 Công thức khai triển (hình 1.1) được Butenandt xác định từ năm 1928 gồm 5 vòng: 2 vòng benzen (A) và (D), 1 vòng pyran (B), 1 vòng pyron (C) và 1 vòng furan (E), ngoài ra còn có

2 nhóm methoxy [9][17] Hiện nay, người ta xếp Rotenon vào nhóm isoflavonoid Rotenon là tinh thể hình lăng trụ, không màu, tả tuyền, hầu như không tan trong nước (1/1 000 000), hơi tan trong ethanol và ether, rất tan trong aceton và chloroform (73%) [21] Những dung dịch Rotenon khi ra ánh sáng chuyển từ màu vàng sang màu đỏ để thành chất dehydroRotenon bền vững và có độ độc bền vững Trong dung môi kiềm Rotenon không bền [26][38]

CH2

Hình 1.1: Công thức Rotenon

Độc tính của Rotenon thể hiện trên động vật máu lạnh bằng đường uống hay do tiếp xúc với nồng độ 1 phần triệu Rotenon ức chế trung khu hô hấp làm rối loạn chuyển hoá điện tử giữa NADH – dehydrogenase của coenzym Q dẫn đến giảm chuyển hoá vật chất để tạo ra năng lượng, giảm nghiêm trọng tiêu thụ oxy gây ức chế chuỗi hô hấp trong ty thể, làm tê liệt trung khu hô hấp, tăng các gốc tự do chứa oxy, superoxid, hydrogen peroxid làm tổn thương AND và gây oxy hoá lipid kết hợp thiếu năng lượng, nhiễm toan do tăng acid lactic từ đó gây chết tế bào [29][30][34]

Khi sâu tiếp xúc với Rotenon sẽ yếu đi rồi chết không dãy dụa, tuy nhiên không phải loại sâu nào Rotenon cũng có tác dụng Rotenon có khả năng diệt trừ sâu miệng hút như rệp, rầy, bọ nhẩy, bọ trĩ, bọ xít, nhện đỏ và diệt trừ sâu miệng nhai như sâu tơ hại rau thập tự, bọ cánh cứng.[30][32]

Rotenon có tác dụng diệt côn trùng và sâu mạnh hơn gấp 4 – 10 lần so với Nicotin có trong thuốc lá, thuốc lào.[14][29]

Đối với người và động vật máu nóng Rotenon hầu như không có độc tính qua đường tiêu hóa, nhưng nếu tiêm mạch máu và qua đường hô hấp có thể gây liệt hô hấp và chết do ngạt thở Có thể gây kích thích, viêm khi da, niêm mạc mắt tiếp xúc với Rotenon Các trường hợp ngộ độc Rotenon thường xảy ra trong quá trình sản xuất, hoặc nhầm Chưa thấy tài liệu công bố gây nhiễm độc mãn ở người Các thí nghiệm gây nhiễm độc mãn cho chuột cống trong vòng 2 năm không thấy có dấu hiệu tổn thương ở các cơ quan.[14][26]

Gần đây có một số công trình nghiên cứu thực nghiệm tiến hành trên tế bào ung thư phổi, fibrosarcom, ung thư ruột, ung thư vú thấy có tác dụng tốt

Trên thị trường có các chế phẩm có chứa Rotenon làm thuốc trừ sâu, diệt cá tạp mang tên thương phẩm như Derril, Tubatoxin, Extrax, Mexide…

Rotenon được chiết xuất từ cây cỏ thiên nhiên, nó có mặt chủ yếu ở

Derris spp, Lonchocarpus spp, Millettia spp, Tephrosia spp, Amorpha fruticosa, Antheroporum pierrei, Crotalaria burhia,….[18]

1.5 VÀI NÉT VỀ SÂU VÀ PHÒNG TRỪ SÂU

1.5.1 Sâu có hại [4][5]

Ở Việt Nam côn trùng và sâu có trên 1 triệu loài, chiếm khoảng 2/3 số côn trùng và sâu đã biết trên thế giới [3] Trong các loài sâu, ngoài các loài có lợi cho con người, còn có nhiều loài có hại, như chúng phá hoại mùa màng, các loại cây trồng Theo Đường Hồng Dật có khoảng 123 loài sâu bệnh chủ yếu có hại trên 24 loại cây trồng phổ biến ở Việt Nam.[10]

Năm 2004 diện tích trồng rau xanh trên cả nước khoảng 614,5 nghìn ha tương đương với 7% đất sử dụng trong nông nghiệp Năm 2003 kim ngạch xuất khẩu rau xanh đạt 182,554 triệu USD Theo tính toán của bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn lượng rau xanh bị sâu bọ hại chiếm từ 10 – 40% sản lượng [18]

Để đảm bảo chất lượng rau, ngày 28/4/1998 Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã ra quyết định số 67 – 1998/QĐ/BNN – PTNT” Qui định tạm thời về sản xuất rau an toàn”.[5][23]

1.5.1.1 Sâu Khoang (Spodorptera liture họ Noctiudace)[18]

Là loại sâu chuyên ăn gặm biểu bì của lá, phần thịt mặt dưới lá Khi sâu

ở tuổi trưởng thành có thể ăn cả khuyết lá làm lá chỉ còn lại gân lá hoặc làm trụi cả lá cây Là loại đa thực gây hại 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật

Trứng hình bán cầu đường kính 0,4 – 0,5mm, màu trắng ngà, sau chuyển xang màu tro, có khi màu tro tối, xếp thành ổ, có lông màu vàng phủ bên ngoài

Sâu non hình ống tròn, dài 38 – 51mm, màu nâu đen hay tối, có vạch ở bụng, phủ lông màu vàng

Nhộng dài 18 – 21mm, màu nâu tươi hay nâu đậm, cuối bụng có một đôi gai, có nhúm lông ở đốt thứ 5 và thứ 7

Bướm dài 16 – 21mm, sải cánh 37 – 42mm, cánh trước màu nâu vàng, cánh sau màu trắng óng có phản quang tím

Vòng đời 20 – 64 ngày Sinh trưởng từ tháng 6 – 10

1.5.1.2 Sâu Đục quả (Manuca testulalis bộ Lepidoptere) [18]

Là loại sâu có thể nhả, kết tơ, ở tuổi thứ 3 đục vào quả sống, ăn thịt quả đến khi đẫy sức Vòng đời 19,5 – 50,8 ngày

Trứng hình bầu dục đường kính 0,3 – 0,5mm, màu trắng trong hơi ngà Sâu non mới nở trắng đục, đầu màu tối 5 tuổi có kích thước 15 – 30mm, hình trụ 2 đầu thon nhọn, đầu vàng, thân màu ngà đốt thứ 5 và thứ 8

có vết nâu sẫm hình chữ thập

Nhộng dài 15 – 25mm, đầu tiên xanh nhạt sau chuyển sang màu vàng

Có gai cong về phía bụng

Bướm dài 11 – 12mm, sải cánh 24 - 25mm, thân màu xám hay màu đồng hụ, đầu nhọn, mắt kép màu gụ, râu sợi chỉ, cánh có vệt sáng

Sinh trưởng quanh năm

- Áp dụng các biện pháp kỹ thuật như kiểm dịch, sinh học, hoá học,…

Sử dụng thuốc trừ sâu là một trong các biện pháp kỹ thuật để phòng trừ sâu bệnh có hại cây cối, hoa màu Tuy nhiên, độ độc của thuốc trừ sâu là một

vấn để được toàn thế giới rất quan tâm [33] Hội nghị lần thứ 8 năm 1975 WHO dựa vào liều LD50 để phân loại độ độc của thuốc trừ sâu Nhóm 1a rất độc, nhóm 1b độc cao, nhóm 2 độc vừa và nhóm 3 ít độc Rotenon thuộc nhóm độc 2 Xu hướng hiện nay trên thế giới là thay thế các loại thuốc trừ sâu

ít an toàn có nguồn gốc từ hoá học bằng cách sử dụng các biện pháp khác an toàn hơn, trong đó có khuyến khích sử dụng các loại thuốc trừ sâu nguồn gốc sinh học.[3][23][28]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Dược liệu chúng tôi nghiên cứu thu hái tại Hà Giang cũng được nhân dân địa phương gọi tên là Dây mật Chúng tôi đã thu hái được cây có hoa và quả dùng để xác định tên khoa học và thu hái toàn bộ cây Dây mật mọc ở Hà Giang làm nguyên liệu nghiên cứu vào tháng 5 năm 2007

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

Chúng tôi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tại khoa nghiên cứu, kiểm nghiệm Dược liệu - Trung tâm KNNC Dược – Quân đội, phòng dược lý

- Trung tâm phòng chống độc – Học viện Quân y, phòng thí nghiệm Thuốc,

cỏ dại và môi trường - Viện bảo vệ thực vật Việt Nam

2.2.1 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

- Cân phân tích METTLER PM 200

- Cân xác định độ ẩm PRECISA HA 60

- Kính hiển vi KRUSS

- Máy cất quay IKA

- Máy đo điểm chảy Electrothemal IA 9000

- Máy quang phổ UV – VIS Hitachi U - 2010

- Máy đo hồng ngoại Nicolet Avatar 370 DTGS

- Máy HPLC ghép MS AGILENT1100 SERIER (Viện hóa học-Viện

KH và CN Việt Nam)

- Máy phổ khối 5989 – MS (Viện hóa học-Viện KH và CN Việt Nam)

- Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR – BRUKER – 500MHz (Viện hóa học-Viện KH và CN Việt Nam)

- Tủ sấy SHELLAB

- Các dụng cụ thuỷ tinh như: Phễu, đũa pipet, bình nón…

2.2.2 Hoá chất

- Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

- Hoá chất: Ethanol, chloroform, n – hexan, ethylacetat, methanol…

Cá Vàng Carassius auratus (Linnaeus) var gold – fish - Họ cá chép

Cyprinidae, cá Cờ Macropodus opercularis (Linnaeus) - Họ cá Rô Arabantidae, cá Rô Siniperca chuatsi (Basilewky)- Họ cá Mú Serranidae đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Trung tâm phòng chống độc – Học viện Quân y cung cấp

Sâu Khoang Spodoptera litura F , Sâu đục quả Manuca testulalis đạt

tiêu chuẩn thí nghiệm do viện Bảo vệ thực vật cung cấp

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật

Mô tả đặc điểm cây, hoa, quả, hạt đối chiếu với khóa phân loại [2][36], chụp ảnh, đối chiếu tiêu bản với các mẫu lưu tại phòng tiêu bản Viện sinh thái – tài nguyên – Viện KH và CN Việt Nam; Khoa sinh – Trường đại học khoa học tự nhiên Đại học quốc gia Hà Nội; Phòng tiêu bản Viện dược liệu; Bộ môn thực vật - Trường đại học dược Hà Nội; Tham khảo các ý kiến các nhà thực vật học để thẩm định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu rễ, thân, lá và đặc điểm bột dược liệu theo tài liệu thực tập dược liệu [16][19][24] và tài liệu kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi [15][22]

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

Dùng các dung môi thích hợp để chiết xuất các nhóm chất và định tính bằng các phản ứng hóa học trong tài liệu thực tập dược liệu [20] và Phương

pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc [13]

Tiến hành SKLM trên các hệ dung môi, chọn hệ dung môi tách tốt nhất Định tính nhóm chất chính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với chất hấp phụ là Silicagel GF 254 (Merck) theo tài liệu Nghiên cứu hóa học cây thuốc [13]

Chiết xuất các chất trong dược liệu bằng methanol Phân lập các chất bằng sắc ký cột với chất nhồi là silicagel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm

Kiểm tra độ tinh khiết của mẫu phân lập được bằng SKLM, triển khai với 3 hệ dung môi khác nhau, SK đồ chỉ xuất hiện 1 vết thì được coi là tinh khiết để xác định cấu trúc

Nhận dạng chất phân lập được:

+ Đo nhiệt độ nóng chảy + Đo phổ UV

+ Đo phổ IR + Đo phổ khối ( MS) + Đo sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) + Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều + Đo phổ mô phỏng

2.3.3 Nghiên cứu độc tính

Thử độc tính theo tài liệu Phương pháp xác định độc tính cấp.[12]

2.3.4 Nghiên cứu tác dụng diệt sâu

2.3.4.1 Phương pháp bố trí trong phòng thí nghiệm

Đối với sâu Khoang (Spodoptera litura F): Dùng hộp petri có lắp đậy,

đưòng kính 10cm, đáy hộp có lót một lớp giấy bản thấm nước Sau đó cắt lá Thầu dầu đặt lên trên giấy bản, thả 15 con sâu vào mỗi hộp Sau mỗi ngày thay lá và làm sạch 1 lần

Đối với sâu Đục quả (Manuca testulalis): Dùng hộp petri có lắp đậy,

đưòng kính 10cm, đáy hộp có lót một lớp giấy bản thấm nước Sau đó cắt 1 đoạn quả Đậu đũa dài khoảng 3 – 4cm, đặt lên trên giấy bản, thả 1 con sâu vào mỗi hộp, làm với 9 hộp Ngày hôm sau khi sâu đã đục vào quả Đậu đũa thì gom đủ 09 con sâu đục ở 9 đoạn quả chuyển vào cùng 1 hộp khác

2.3.4.2 Phương pháp xử lý thuốc

*) Thuốc phun lên sâu:

Dung dịch phun là dung dịch có nồng độ 0,5% và 1,0% dịch chiết dược liệu bằng nước

*) Thời điểm và số lần sử lý:

Đối với sâu Khoang (Spodoptera litura F): Thuốc được sử lý 1 lần

ngay sau khi cho sâu vào hộp petri (sâu ở 2-3 tuổi)

Đối với sâu Đục quả (Manuca testulalis): Thuốc được sử lý 1 lần, 1

ngày sau khi cho sâu vào hộp petri (sâu ở 1-2 tuổi)

*) Phương pháp xử lý và lượng thuốc:

Mỗi hộp Petri được dùng máy Poster Tower để phun 2 lần liên tiếp, mỗi lần 1ml các dung dịch thí nghiệm trên Sau khi phun thuốc lần 1, đảo lá Thầu dầu và quả Đậu đũa tiếp tục phun thuốc lần 2 để toàn bộ 2 mặt lá và toàn quả đều được thấm dung dịch thí nghiệm

2.3.4.3 C hỉ tiêu và phương pháp đánh giá

*) Chỉ tiêu:

Số lượng sâu Khoang (Spodoptera litura F) tại thời điểm trước và sau

1, 2, 3 ngày sau phun và số lượng sâu Đục quả (Manuca testulalis): ở 3 ngày

sau khi phun (sâu Đục quả chỉ điều tra 1 lần vì khi điều tra phải phá tổ của chúng nên sau khi điều tra sâu sẽ chết)

Tính hiệu lực của thuốc đối với sâu hại ở ngày thứ nhất, ngày thứ 2 và ngày thứ 3 sau xử lý đối với sâu Khoang và sau 3 ngày đối với sâu Đục quả

*) Phương pháp đánh giá:

Điều tra toàn bộ hộp petri

Hiệu lực của thuốc được điều chỉnh theo công thức Abbott

Số liệu về mật độ sâu ở các thời điểm quan sát được xử lý theo phương pháp đa biên độ của Ducan với độ tin cậy 95% bằng phần mềm thống kê sinh học IRISTAT

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT

3.1.1 Mô tả đặc điểm cây và kiểm định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Cây thu hái tại tỉnh Hà Giang (hình 3.1) Là một loại dây leo khỏe thân dài 7 – 15m, nhánh mềm, cành non có lông mịn mầu hung đỏ, cành già sần sùi, màu nâu đen, nhẵn không có lông Lá kép gồm 9 – 11 lá chét, cuống lá dài 15 – 18cm, không có lông, mọc so le; phiến lá chét hình mác ngược, cỡ 6 – 20 x 3 – 8cm, gốc lá tù hoặc tròn, chóp lá nhọn, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông mềm; gân bên có 9 – 15 đôi, dẹt ở mặt trên, nổi ở mặt dưới; cuống lá chét dài 2 – 5mm nhẵn hay có lông mịn; lá kèm rụng sớm (Hình 3.1)

Cụm hoa mọc ở kẽ lá dài 5 – 20cm (hình 3.2), thường tập trung thành 2 – 7 chùm trên một nhánh dài, có lông mịn màu hung; nhánh cụm hoa dài 3 – 5mm, mang 3 – 5 hoa; cuống hoa dài 4 – 5mm, có lông mịn; lá bắc cụm hoa

và lá bắc của hoa hình thuôn nhọn cỡ 1,2 mm, có lông ở mặt ngoài Hoa nhỏ màu trắng phớt tím (hình 3.3), dài 14 – 18mm; đài hoa hình ống cỡ 4 – 5mm,

có lông mịn ở mặt ngoài, mép có răng cưa, hình tam giác cỡ 1 – 1.5mm; cánh hoa 5, có lông mịn mặt ngoài, màu trắng phớt tím; cánh cờ hình tròn cỡ 10 – 12mm, đỉnh có 2 thuỳ, hình tim; cánh bên hình thuôn; nhị ngắn hơn cánh bên, chỉ nhị có lông; bầu hình thuôn, không cuống, có lông mịn; vòi nhuỵ dài bằng bầu, không lông; noãn 4 – 6 (từ hình 3.3 đến hình 3.9)

Quả loại quả đậu, hình bầu dục cỡ 5 – 10 x 2,5 -3 x 2 – 2,5, phủ lông nhung bên ngoài, gốc thuôn tròn

Hạt 2 – 3 hình thuôn Rễ ít rễ phụ, vỏ màu nâu vàng hoặc nâu đen, có nhiều vạch dọc theo chiều dài

Hình 3.1: Cây Dây mật tại Hà Giang

Hình 3.2: Cụm hoa Hình 3.3: Hoa bổ đôi

Hình 3.4: Chùm hoa Hình 3.5: Hoa

Hình 3.6: Cánh hoa Hình 3.7: Cánh hoa

Hình 3.8: Nhị hoa Hình 3.9: Nhuỵ hoa

Sau khi quan sát, phân tích các đặc điểm hình thái của mẫu cây nghiên cứu theo khóa phân loại và đối chiếu tiêu bản với các mẫu lưu tại phòng tiêu bản Viện Sinh thái – Tài nguyên (hình 3.10); Bách thảo thực vật trường đại học khoa học tự nhiên đại học quốc gia Hà Nội; Được GS., TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn, PGS., TS Vũ Xuân Phương, TS Dương Đức Huyến, THS

Nguyễn Thế Cường đều xác định mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Milletia pachyloba Drake var pachyloba – họ Đậu (Fabaceae) (hình 3.11)

Hình 3.10: Mẫu tiêu bản Milletia

pachyloba Drake var pachyloba lưu tại

Viện Sinh thái – Tài nguyên

Hình 3.11: Tiêu bản Dây mật Milletia pachyloba Drake var pachyloba chúng tôi thu hái tại Hà Giang lưu tại Bộ môn Thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá

Quan sát tiêu bản vi phẫu lá (hình 3.12)

- Phần gân lá: Phía trên lồi ít, phía dưới lồi nhiều Biểu bì trên và dưới (1) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật đều đặn Sát biểu bì trên và dưới là mô dày (2) gồm những tế bào hình trứng, thành dày, xếp lộn xộn Mô mềm (3) là

những tế bào thành mỏng hình tròn hoặc hình đa giác không đều nhau Bó libe-gỗ (4) tạo thành vòng cung lớn nằm giữa gân lá Libe tạo vòng liên tục bao quanh gỗ Phần gỗ gồm các mạch gỗ nối tiếp nhau thành từng dãy, mỗi dãy cách nhau bởi 2-3 hàng tế bào mô mềm gỗ Ngoài ra còn tinh thể calci oxalat hình khối

- Phần phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới giống phần gân lá Mô giậu trên và mô giậu dưới (5) gồm 2 hàng tế bào chữ nhật dài xếp đứng chiếm khoảng 4/5 chiều dày phiến lá, các tế bào này xếp vuông góc với biểu bì Mô khuyết (6) Ngoài ra, rải rác còn có tinh thể calci oxalat hình khối

3.1.3 Đặc điểm vi phẫu thân (hình 3.13)

Ngoài cùng là lớp biểu bì (1) gồm 2-3 hàng tế bào nhỏ xếp đều đặn có lông che chở đơn bào Mô mềm vỏ (2) là 7-8 lớp tế bào hình trứng hay đa giác, thành mỏng xếp đều đặn Tiếp theo là tầng phát sinh gỗ – libe (3), kế tiếp là cung gỗ xếp thành vòng liên tục Bó gỗ (4) xếp rải rác xen kẽ với phần libe xếp toả tròn Trong cùng là mô mềm ruột (5) gồm các tế bào to, thành mỏng hình trứng hay đa giác

3.1.4 Đặc điểm vi phẫu rễ (hình 3.14)

Từ ngoài vào trong Ngoài cùng là lớp bần (1) gồm 4 – 5 lớp tế bào thành dày xếp đều đặn Tiếp theo là mô mềm (2) gồm những tế bào thành mỏng, hình đa giác không đều Sau mô mềm là tầng phát sinh libe – gỗ (3)

Mạch gỗ tập trung thành dãy hướng tâm (4) Trong cùng là mô mềm ruột (5)

3.1.5 Đặc điểm bột rễ (hình 3.15)

Rễ được phơi, sấy khô, tán nhỏ thành bột mịn Bột màu vàng, nâu nhạt Soi dưới kính hiển vi thấy: Mảnh bần (1) Mảnh mạch mạng (2) Mảnh mô mềm (3) Tế bào cứng (4) Hạt tinh bột (5) riêng lẻ hoặc tụ thành từng đám

có hình tròn nhỏ hay hình mũ Tinh thể calci oxalat hình khối (6) Sợi gỗ (7)

Hình 3.12: Vi phẫu l á

Hình 3.13: Vi phẫu thân

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hoá học

Tách riêng từng bộ phận (rễ, thân, lá) thái nhỏ, sấy ở 60oC đến độ ẩm khoảng 10 – 12%, tán thành bột 1 – 2mm để tiến hành định tính từng nhóm hoạt chất hữu cơ có trong từng bộ phận của cây

3.2.1.1 Định tính alcaloid

Cân 10 g bột dược liệu đem thấm ẩm bằng amoniac đặc, để 45 phút, sau

đó cho vào bình Soxhlet chiết bằng chloroform trong 3 h Cất thu hồi dung môi còn dạng cao đặc, đem lắc với dd acid sulfuric 5% hai lần, mỗi lần 5 ml, gạn lấy phần dịch chiết acid, lắc với ether ethylic 3 lần, mỗi lần 5 ml, để loại tạp, đun cách thuỷ đuổi hết ether, kiềm hoá trở lại bằng amoniac, chiết lại bằng chlorofom, cất thu hồi dung môi được cắn đem hoà trong 10ml dd acid sulfuric 5% Dịch chiết acid này dùng để định tính alcaloid: Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết acid nói trên:

+) Ống số 1 thêm vào ba giọt TT Mayer: Dược liệu là lá, thân, rễ đều không thấy xuất hiện tủa trắng

+) Ống số 2 thêm vào ba giọt TT Dragendorff: Dược liệu là lá, thân, rễ đều không thấy xuất hiện tủa da cam

+) Ống số 3 thêm vào ba giọt TT Bouchardat: Dược liệu là lá, thân, rễ đều không thấy xuất hiện màu nâu

+) Ống số 4 thêm vào ba giọt dd acid picric 10%: Dược liệu là lá, thân,

rễ đều không thấy xuất hiện tinh thể màu vàng cam

Nhận xét: Trong cả 3 bộ phận lá, thân, rễ của cây không có alcaloid

3.2.1.2 Định tính glycosid tim

Cho 10 g bột dược liệu cho vào bình nón có nút mài, thêm 50 ml ethanol

250, lắc kỹ, để qua đêm, lọc lấy dịch lọc, thêm vào dịch lọc dd chì acetat 20% cho đến khi tủa hết, lọc lấy dịch lọc, loại chì acetat dư bằng dd natri sulfat

30%, để lắng, lọc, cho dịch lọc vào bình gạn, thêm vào đó cùng một thể tích hỗn hợp ethanol 900

- chloroform (1:3), lắc kỹ, để phân lớp, gạn lấy phần chloroform, loại nước bằng Na2SO4 khan, lọc, bốc hơi dung môi tới khô Cắn hoà tan trong 4 ml ethanol 900 để làm các phản ứng định tính sau:

+) Phản ứng Liebermann: Lấy 1 ml dịch chiết ethanol, thêm 0,5 ml alhydric acetic Lắc đều, sau đó thêm từ từ 0,5 ml dd acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm: Dược liệu là lá, thân, rễ đều không thấy có vòng tím đỏ xuất hiện

+) Phản ứng Legal: Lấy 1 ml dịch chiết ethanol, thêm 3 giọt TT natri nitro prusiat 0,5%, thêm 2 giọt dd natri hydroxyd 10%: Dược liệu là lá, thân,

rễ đều không thấy xuất hiện màu đỏ

+) Phản ứng Baljet: Lấy 1 ml dịch chiết ethanol, thêm 0,5 ml TT mới pha gồm: 9,5 ml acid picric, 0,5 ml dd natri hydroxyd 10%: Dược liệu là lá, thân, rễ đều không thấy xuất hiện màu đỏ cam

Nhận xét: Trong cả 3 bộ phận lá, thân, rễ không có glycosid tim

3.2.1.3 Định tính anthranoid

+) Phản ứng Borntrager: Cho 2 g bột dược liệu vào bình nón, thêm 10 ml

dd acid sulfuric 10% Đun sôi cách thuỷ trong 15 phút, lọc, để nguội, cho dịch lọc vào bình gạn lắc với 5 ml ether etylic trong 2 phút, để yên cho phân lớp, gạn lấy lớp ether ethylic và thêm vào đó 8 ml dd natri hydroxyd 10%, lắc: Dược liệu là lá, thân, rễ đều không thấy xuất hiện màu hồng

+) Vi thăng hoa: Cho khoảng 0,1 g bột dược liệu vào một nút nhôm, đậy bằng một phiến kính trên đặt một miếng bông có thấm nước Dùng ngọn lửa đèn ethanol hơ dưới đáy nút nhôm sau đó lấy phiến kính đem soi dưới kính hiển vi: Dược liệu là lá, thân, rễ đều không thấy xuất hiện tinh thể hình kim

Nhận xét: Trong cả 3 bộ phận lá, thân, rễ không có anthranoid

Nhận xét: Trong cả 3 bộ phận lá, thân, rễ không có coumarin

3.2.1.5 Định tính tanin

Cho 1 g bột dược liệu vào bình nón, đun sôi với 20 ml nước cất trong 10 phút, để nguội, lọc Lấy dịch lọc, lắc với ether ethylic nhiều lần để loại tạp, bỏ lớp ether Đun nóng dịch chiết đuổi hết ether Dùng dịch chiết làm phản ứng: +) Phản ứng với dd gelatin 2%: Lấy 1 ml dịch chiết, thêm 3 giọt dd gelatin 2% mới pha: Dược liệu là lá, thân, rễ đều thấy xuất hiện tủa bông trắng

+ Phản ứng với dd sắt (III) clorid 5%: Lấy 1 ml dịch chiết, thêm 3 giọt

dd sắt (III) clorid 5%, lắc đều: Dược liệu là lá, thân, rễ đều thấy xuất hiện màu xanh đen

+ Phản ứng với dd chì acetat 10%: Lấy 1 ml dịch chiết, thêm 3 giọt dd chì acetat 10%: Dược liệu là lá, thân, rễ đều thấy xuất hiện kết tủa trắng

Nhận xét: Trong cả 3 bộ phận lá, thân rễ đều có tanin

3.2.1.6 Định tính acid hữu cơ

Cho 2 g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước cất, đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội, lọc, thêm vào dịch lọc một ít tinh thể natri carbonat: Dược liệu là lá, thân, rễ đều thấy xuất hiện bọt khí bay lên

Nhận xét: Trong cả 3 bộ phận lá, thân, rễ có acid hữu cơ

3.2.1.7 Định tính flavonoid

Cho 2 g bột dược liệu vào bình nón thêm 30 ml ethanol 900 và đun sôi cách thuỷ trong 15 phút, lọc nóng, cô dịch lọc còn khoảng 5 ml làm phản ứng: +) Phản ứng cyanidin: Lấy 1ml dịch chiết, thêm một ít bột magie, 3 giọt acid clorhydric đặc, đun nóng nhẹ

Dược liệu là lá: Xuất hiện màu hồng hơi rõ

Dược liệu là thân: Xuất hiện màu hồng rõ

Dược liệu là rễ: Xuất hiện màu hồng rất rõ

+) Phản ứng với amoniac đặc: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, để

khô, hơ lên miệng lọ amoniac đặc: Dược liệu là lá, thân, rễ đều thấy màu hơi đậm lên

+) Phản ứng diazo hoá: Lấy 1 ml dịch chiết, thêm 3 giọt TT diazo: Dược liệu là lá, thân, rễ đều thấy xuất hiện màu da cam

Nhận xét: Trong cả 3 bộ phận lá, thân, rễ có flavonoid

3.2.1.8 Định tính iridoid

Cho 5 g bột dược liệu vào bình nón, thêm 10 ml ethanol 900, đun hồi lưu trong 10 phút, lọc bỏ bã, thêm một lượng nước cất tương đương vào dịch lọc, thêm 5 ml dd chì acetat 2% để loại tạp Lọc loại bỏ tạp Phần dịch lọc cho thêm dd acid sulfuric 5% để loại chì acetat dư Lọc bỏ tủa, cô đặc dịch lọc, hoà vào một ít ethanol 900để làm phản ứng định tính với TT Trim -Hill (gồm

10 ml CH3COOH + 1 ml dd CuSO4 0,2% + 0,5 ml acid HCl đặc): Cho 1ml