Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng diệt sâu của cây dây mật thu hái ở hà giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN TRỌNG ĐƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT SÂU CỦA CÂY DÂY MẬT THU HÁI Ở HÀ GIANG LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC Hà Nội – 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT SÂU CỦA CÂY DÂY MẬT THU HÁI Ở HÀ GIANG Chuyên ngành: Dược liệu – Dược cổ truyền Mã số: 60 73 10 LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.,TS Phạm Thanh Kỳ TS Nguyễn Hồnh Cơi Hà Nội - 2006 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc kính trọng xin chân thành cám ơn: GS., TS Phạm Thanh Kỳ, TS Nguyễn Hồnh Cơi tận tình trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ suốt trình thực hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: GS., TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn – Chủ tịch hội đồng ngành Sinh học Đại học quốc gia Hà Nội PGS., TS Chu Đình Kính – Viện hố học – Viện khoa học công nghệ Việt Nam PGS., TS Vũ Xuân Phương - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật TS Hoàng Cơng Minh – Phó giám đốc Trung tâm phòng chống nhiễm độc – Học viện Quân y TS Nguyễn Trường Thành – Trưởng môn Thuốc, Cỏ dại Môi trường – Viện bảo vệ thực vật TS Dương Đức Huyến – Trưởng phòng thực vật – Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật ThS Nguyễn Thế Cường – Cán nghiên cứu – Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Cnh Sa Nhật Tâm – Cán nghiên cứu – Sở công nghệ môi trường Hà Giang Đã đóng góp ý kiến q báu cho tơi thực luận văn Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Thực vật, Bộ mơn Dược học cổ truyền, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hoá học - Viện KH CN Việt Nam, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện bảo vệ thực vật, Sở công nghệ môi trường Hà Giang, Trung tâm phòng chống nhiễm độc – Học viện Quân y đặc biệt tới Ban giám đốc, đồng nghiệp khoa NCKN Dược liệu, khoa, ban thuộc Trung tâm KNNC Dược Quân đội, Cục Quân y luôn tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học làm luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2007 DS Nguyễn Trọng Đường MỤC LỤC NỘI DUNG Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại phân bố phân họ Đậu 1.1.1 Vị trí phân loại phân họ Đậu 1.1.2 Vị trí phân loại phân bố chi Milletia chi Derris 1.2 Cây Milletia pachyloba Drake var pachyloba, họ Đậu - Fabaceae 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.2.2 Thành phần hóa học 1.2.3 Tác dụng công dụng 1.3 Cây Derris elliptica (Roxb.)Benth., họ Đậu - Fabaceae 1.3.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.3.2 Thành phần hóa học 1.3.3 Tác dụng công dụng 1.4 Rotenon 10 1.5 Vài nét sâu phòng trừ sâu 11 1.5.1 Sâu có hại 11 1.5.2 Phòng trừ sâu 12 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Phương tiện nghiên cứu 15 2.2.1 Thiết bị dùng nghiên cứu 15 2.2.2 Hoá chất dùng nghiên cứu 16 2.2.3 Động vật thí nghiệm 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Nghiên cứu thực vật 16 2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 17 2.3.3 Nghiên cứu độc tính 17 2.3.4 Nghiên cứu tác dụng diệt trừ sâu 18 Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1 Kết nghiên cứu thực vật 20 3.1.1 Mô tả đặc điểm xác định tên khoa học mẫu nghiên cứu 20 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 23 3.1.3 Đặc điểm vi phẫu thân 24 3.1.4 Đặc điểm vi phẫu rễ 24 3.1.5 Đặc điểm bột rễ 24 3.2 Kết nghiên cứu thành phần hóa học 27 3.2.1 Định tính nhóm chất hữu phản ứng hố học 27 3.2.2 Định tính flavonoid SKLM 34 3.2.3 Chiết xuất nhóm chất rễ Dây mật 36 3.2.4 Xác định sơ flavonoid rễ phương pháp LC-MS 38 3.2.5 Phân lập flavonoid rễ Dây mật 40 3.2.6 Nhận dạng chất DMI 42 3.3 Kết nghiên cứu tác dụng sinh học 47 3.3.1 Kết nghiên cứu độc tính chuột 47 3.3.2 Kết nghiên cứu độc tính cá 48 3.3.3 Kết nghiên cứu tác dụng diệt sâu 52 Chương 4: BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 54 4.1 Về Thực vật 54 4.2 Về thành phần hoá học 57 4.3 Về tác dụng sinh học 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 Kết luận 60 Đề nghị 61 PHỤ LỤC 62 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CNVN 13 C - NMR : Công nghệ Việt Nam : Carbon (13) Nuclear magnetic resonance CT : Cấu tử DEPT :Distotionless enhancement by polarization transfer Dd : Dung dịch H - NMR : Proton Nuclear magnetic resonance HMQC : Heteronuclea multiple Quantum Corelation HPLC : High-performance liquid chromatograph IR : Inphra Red KH CN : Khoa học công nghệ MDA : Malonyl dialdehyd MS : Mass spetrum LC-MS : Liquid chromatograph - Mass spetrum NBT : Nitro Blue Tetrazolium NMR : Nuclear magnetic resonaance NSP : Ngày sau phun P/ứng : Phản ứng SKLM : Sắc ký lớp mỏng Trung tâm KNNC Dược : Trung tâm kiểm nghiệm nghiên cứu dược TT : Thuốc thử UV : Ultra violete DANH MỤC CÁC BẢNG STT TÊN BẢNG TRANG Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Millettia Việt Nam Bảng 1.2: Một số loài thuộc chi Derris Việt Nam Bảng 3.1: Kết định tính nhóm chất hữu 33 Bảng 3.2: Kết định tính flavonoid SKLM 35 Bảng 3.3: Kết định tính flavonoid P/ư Cyanidin 38 Bảng 3.4: Kết phân tích phương pháp LC-MS 39 Bảng 3.5: Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 44 Bảng 3.6: Kết độc tính cấp chuột 48 Bảng 3.7: Kết thử độc tính cá Vàng 49 10 Bảng 3.8: Kết thử độc tính cá Cờ 50 11 Bảng 3.9: Kết thử độc tính cá Rơ 50 12 Bảng 3.10: Các cơng thức thí nghiệm 52 13 Bảng 3.11: Mật độ sâu Khoang trước sau sử lý 52 14 Bảng 3.12: Hiệu lực thuốc sâu Khoang 53 15 Bảng 3.13: Hiệu lực thuốc sâu Đục 53 16 Bảng 4.1: So sánh đặc điểm thực vật Millitia Derris 55 DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH TRANG Hình 1.1: Cơng thức Rotenon 10 Hình 3.1: Hình ảnh Dây mật Hà Giang 21 Hình 3.2: Hình ảnh cụm hoa Dây mật Hà Giang 21 Hình 3.3: Hình ảnh hoa bổ đơi Dây mật Hà Giang 21 Hình 3.4: Hình ảnh chùm hoa Dây mật Hà Giang 22 Hình 3.5: Hình ảnh hoa Dây mật Hà Giang 22 Hình 3.6: Hình ảnh cánh hoa Dây mật Hà Giang 22 Hình 3.7: Hình ảnh cánh hoa Dây mật Hà Giang 22 Hình 3.8: Hình ảnh nhị hoa Dây mật Hà Giang 22 10 Hình 3.9: Hình ảnh nhuỵ hoa Dây mật Hà Giang 22 11 Hình 3.10: Mẫu tiêu lưu viện Sinh thái – Tài nguyên 23 12 Hình 3.11: Tiêu nghiên cứu lưu Trường Dược HN 23 13 Hình 3.12: Hình ảnh vi phẫu Dây mật Hà Giang 25 14 Hình 3.13: Hình ảnh vi phẫu thân Dây mật Hà Giang 25 15 Hình 3.14: Hình ảnh vi phẫu rễ Dây mật Hà Giang 26 16 Hình 3.15: Hình ảnh bột rễ Dây mật Hà Giang 26 17 Hình 3.16: Hình ảnh SKLM nhóm flavonoid 41 18 Hình 3.17: Công thức Rotenon theo thư viện phổ 42 19 Hình 3.18: Cấu trúc liệu Rotenon nghiên cứu 46 20 Hình 3.19: Biểu đồ so sánh nồng độ gây cá chết 51 Kết cho thấy nồng độ 0,5% dịch chiết 1:10 rễ Milletia pachyloba Drake var pachyloba diệt 867% số sâu Khoang nồng độ 1,0% dịch chiết 1:10 rễ Milletia pachyloba Drake var pachyloba diệt 91,3% số sâu Khoang sau ngày phun thuốc Ở nồng độ 0,5% dịch chiết 1:10 rễ Milletia pachyloba Drake var pachyloba diệt 33,3% số sâu Đục nồng độ 1,0% dịch chiết 1:10 rễ Milletia pachyloba Drake var pachyloba diệt 44,4% số sâu Đục sau ngày phun thuốc Như vậy, dịch chiết nồng độ 0,5% 1,0% có hiệu lực cao trừ sâu Khoang sau phun thuốc – ngày Dịch chiết nồng độ 0,5% 1,0% có hiệu lực khơng cao đối vói sâu Đục thời điểm ngày sau phun thuốc Đối chiếu theo tiêu chuẩn hiệu lực thuốc trừ sâu [3][4] sử dụng dịch chiết rễ Milletia pachyloba Drake var pachyloba mọc Hà Giang với nồng độ 0,5% dịch chiết 1:10 để diệt trừ sâu Khoang Những kết nghiên cứu độc tính cá góp phần chứng minh việc sử dụng rễ Dây mật Milletia pachyloba Drake var pachyloba nhân dân vùng núi miền Bắc nói chung nhân dân địa phương Hà Giang nói riêng để duốc cá có sở khoa học Kết nghiên cứu tác dụng diệt trừ sâu Khoang sâu Đục mở triển vọng dùng dịch chiết rễ làm thuốc trừ sâu Khoang sâu Đục loại sâu thường gặp trình canh tác số loài rau rau bắp cải, đậu đũa,v.v KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Qua thời gian nghiên cứu Dây mật thu hái Hà Giang thu số kết sau: *) Về thực vật Đã mô tả chi tiết đặc điểm thực vật mẫu Dây mật thu hái Hà Giang xác định tên khoa học là: Milletia pachyloba Drake var pachyloba – họ Đậu (Fabaceae) Đã xác định đặc điểm vi phẫu lá, thân, rễ đặc điểm bột rễ Dây mật Milletia pachyloba Drake var pachyloba mọc Hà Giang *) Về thành phần hoá học Đã xác định lá, thân rễ Milletia pachyloba Drake var pachyloba có chứa flavonoid, tanin, coumarin, acid hữu cơ, steroid polysaccharid Bằng phương pháp SKLM xác định dịch chiết chloroform rễ có vết chất flavonoid với hệ dung mơi Toluen : Ethylacetat : Acid acetic [ 9: 1: 0,2] Bằng phương pháp LC-MS xác định khối lượng phân tử chất dịch chiết chloroform rễ Đã phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn chiết chloroform rễ Milletia pachyloba Drake var pachyloba Dựa vào nhiệt độ nóng chảy số liệu UV, MS, 1H – NMR, 13C – NMR, DEPT, HSQC, HMBC phổ mô xác định chất Rotenon *) Về tác dụng sinh học Đã xác định liều LD50 chuột nhắt trắng đường uống 372,5 mg cặn khô từ dịch chiết chloroform dịch chiết rễ Milletia pachyloba Drake var pachyloba tương ứng với 41,4 g rễ khô/kg thể trọng chuột Đã xác định liều LC50 cá: +) Trên cá Vàng 0,23 mg cặn khô/l tương đương 25,6 mg rễ khô/l +) Trên cá Cờ 0,26 mg cặn khô/l tương đương 28,9 mg rễ khô/l +) Trên cá Rô 0,28 mg cặn khô/l tương đương 31,1 mg rễ khô/l Đã thử tác dụng dịch chiết (1:10) rễ Milletia pachyloba Drake var pachyloba sâu Khoang (Spodoptera litura F) sâu đục (Manuca testulalis) +) Nồng độ 0,5% dịch chiết diệt 86,7% số sâu Khoang 33,3% số sâu Đục +) Nồng độ 1,0% dịch chiết diệt 91,3% số sâu Khoang 44,4% số sâu Đục ĐỀ NGHỊ Những kết thu bước đầu, đề nghị: - Cần tiếp tục nghiên cứu sâu thành phần hoá học, phân lập, xác định cấu trúc số chất khác Milletia pachyloba Drake var pachyloba mọc Hà Giang địa phương khác - Cần nghiên cứu đầy đủ tác dụng diệt sâu số tác dụng sinh học khác để đưa Milletia pachyloba Drake var pachyloba ứng dụng làm thuốc diệt sâu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1.Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật Hạt kín Việt Nam, NXB Nơng nghiệp Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (1997), Phân loại thực vật, tr 70 – 99, Trung tâm thông tin thư viện trường đại học Dược Hà Nội Bộ Nông nghiệp (2000), Cẩm nang thuốc bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp Bộ Nông nghiệp (1995), Thuốc bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp Bộ Nông nghiệp (1999), Kỹ thuật trồng rau sạch, NXB Nông nghiệp Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học Võ Văn Chi (1998), Từ điển động vật khoáng sản làm thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 73 – 74, 90, 97 Phạm Ngọc Chuyển (2005), Điều tra phân bố tự nhiên, khảo nghiệm hiệu lực diệt sâu hại rau, đậu Dây mật (Derris elliptica (Roxb.)Benth Wallbernth), đề tài mã số: KC – HG 03 (04) Nguyễn Duy Cương cộng (1999), Từ điển bách khoa Dược học, NXB từ điển bách khoa – Hà Nội, tr 252 10 Đường Hồng Dật (1980), Khoa học bệnh thuốc, NXB Nơng nghiệp 11 Hồng Thị Dung, Nguyễn Duy Diễn (2007), Hướng dẫn trồng rau sạch, NXB Phụ nữ 12 Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc, Tr 35- 57, NXB Y học 13 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y học 14 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, tr 1113 – 1141 3219 - 3239, Tái lần 2, NXB Trẻ 15 Trần Công Khánh (1980), Kỹ thuật dùng kính hiển vi dùng nghiên cứu thực vật dược liệu, NXB Y học 16 Trần Công Khánh (1987), Thực tập sinh thái giải phẫu thực vật, NXB Đại học trung học chuyên nghiệp 17 Trần Công Khánh, Phạm Quang Hải (2004), Cây độc Việt Nam, NXB Y học, tr 110 -111 18 Nguyến Đức Khen (2003), Côn trùng – Sử dụng thuốc diệt côn trùng bảo vệ môi trường, NXB Nghệ An 19 Phạm Thanh Kỳ (chủ biên, 2007), Dược liệu học, tập II, NXB Y học 20 Phạm Thanh Kỳ (chủ biên, 2006), Thực tập dược liệu, phần hóa học, Trung tâm thơng tin thư viện trường đại học Dược Hà Nội 21 Đỗ Tất Lợi (2003), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 351 22 Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm Dược liệu phương pháp hiển vi, NXB Hà Nội 23 Trần Khắc Thi, Nguyễn Công Doan (2005), Kỹ thuật trồng rau – Rau an tồn, NXB Nơng nghiệp 24 Ngơ Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu, tập I, Trung tâm thông tin thư viện trường đại học Dược Hà Nội 25 Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh, Trịnh Thanh Lâm (1995), Toán thống kê tin học ứng dụng sinh-y-dược, Tr 141-149 NXB Quân đội nhân dân 26 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc, tr 654 – 656, NXB Khoa học Kỹ thuật Tiếng Anh 27 Chapman and Hall (1994), Dictionary of Natural products, Vol 1, London 28 EXTOXNET: The extension toxicology network (1993), Rotenone A Pesticide Information Project of Cooperative Extension Offices of Cornell University 29 Hayes WJ & Laws, ER (1991) Rotenone and related materials Handbook of pesticide toxicology New York, Academic Press, Inc., pp 599-603 30 Pergamon, Phytochemistry Vol 49,No 6, pp 1479 – 1507, 1998 Printed in Great Britain 31 The Farm chemicals hanbook (2002) London 32 The Massachusetts institute of techology (2000), Medicinal plants of Easst and South of Asia, London 33 WHO (1992) The WHO recommended classification of pesticides by hazard and guidelines to classification 1992-1993 Geneva, World Health Organization, 66 pp (unpublished document, WHO/PCS/92.14) 34 Wood D M, Alsahaf H, Streete.P, Jones.A (2005), Fatality after deliberate ingestion of the pesticide Rotenone: a case report PubMed central, Jurnal list Tiếng Pháp 35 H Lecomte, Flore générale de l’Indo – chine, tom II, pp 57 - 612 (1908 – 1923), Laboratoire de Phanérogamie 16, rue Buffon, 75005 Paris 36 Phan kê Lôc & J E Vidal (2001), Leguminosae – Papilionoideae Milletteae, Flore du Cambodge du laos et du Viet Nam, pp 94 – 153, Laboratoire de Phanérogamie 16, rue Buffon, 75005 Paris Tiếng Đức: 37.W.Karrer (1958), Konstitution und Vorkommen der organischen Pflanzzenstoffe BirKhauser Verlag Basel und Stuttgart Internet 38 WWW.Intox.org IPCS-INTOX Databank (2002); Rotenone PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các xác nhận kết giám định tên Giấy chứng nhận mã số tiêu Phụ lục 2: Phổ GC-MS phân đoạn chiết chloroform rễ Dây mật Phụ lục 3: Phổ UV, IR, MS,1H – NMR, 13C – NMR, DEPT, HSQC, HMBC chất DMI Phụ lục Các xác nhận kết giám định tên Giấy chứng nhận mã số tiêu Phụ lục Phổ GC-MS phân đoạn chiết chloroform rễ Dây mật Phụ lục Phổ UV, IR, MS,1H – NMR, 13C – NMR, DEPT, HSQC, HMBC chất DMI O13 130,010 113,373 11 104,912 167,401 H2C 143,073 21 CH3 20 17,154 31,311 4a 12 157,965 O 112,985 17 87,866 19 104,881 12b 4 7a 18 112,558 O 22 16 110,503 11a 188,963 O 10 14 56,370 143,949 23 O CH3 12a 44,647 6a 149,567 O 72,269 66,304 15 55,880 100,978 147,426 CH3 Đã đăng bài: “ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC ROTENON TRONG RỄ CÂY MILLETIA PACHILOBA DRAKE VAR.PACHILOBA” Trong tạp chí Dược học số 11 năm 2007 trang 20 ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT SÂU CỦA CÂY DÂY MẬT THU HÁI Ở HÀ GIANG Chuyên ngành: Dược... Giang có số đặc điểm thực vật khác biệt so với số tài liệu biết Do đó, chúng tơi tiến hành đề tài Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng diệt sâu Dây mật thu hái Hà Giang Đề... nghiên cứu 16 2.3.1 Nghiên cứu thực vật 16 2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 17 2.3.3 Nghiên cứu độc tính 17 2.3.4 Nghiên cứu tác dụng diệt trừ sâu 18 Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU