- Mẫu cây tươi cả rễ, thân, lá Đinh lăng có độ tuổi trên 1 năm được thu hái ở Đại Từ- TP Thái Nguyên để phân tích hình thái và giám định tên khoa học.
- Lá cây Đinh lăng để nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng sinh học.
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất, thuốc thử
+ Dung môi chiết và chạy sắc ký: dung môi được sử dụng là n-hexan, cloroform, ethylacetat, aceton, methanol...
+ Phát hiện vệt chất: đèn tử ngoại bước sóng 254 và 366 nm, thuốc thử ceri sunphat + H2SO4 10% hơ nóng từ từđến khi vết chất hiện màu.
+ Các hóa chất, thuốc thử dùng đánh giá hoạt tính sinh học: p-nitrophenyl-α- D-glucopyranoside, 2-chloro-4-α-D-nitrophenyl maltotrioside, streptozocin, Acarbose (Sigma–Aldrich), tinh bột, dung dịch iod, enzyme α-amylase (A8220, Sigma– Aldrich), enzyme α-glucosidase (G0660, Sigma–Aldrich),…
2.2.2.Dụng cụ và thiết bị chiết tách mẫu
Dụng cụ tách chiết và tinh chế chất phân lập được sử dụng bao gồm: bình chiết, máy chiết siêu âm JAC Ultrasonic 2010, bình cầu cất quay, bình tam giác, cốc thuỷ tinh, ống đong chia vạch, máy cất quay chân không, máy sấy, bình triển khai sắc ký, bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck), bản sắc ký pha đảo RP18 (Merck, RP C-18 F254), cột sắc ký silicagel pha thường (Merck, Kielselgel 60), pha
đảo (30-50 µm, Fuji Silysia Chemical Ltd.), cột sắc ký diaion HP-20,…
2.2.3Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc
+ Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT–NMR Spectrometer.
+ Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) đo trên máy AGILENT 1260 series single quadrupole LC-MS system.
+ Thiết bịđo điểm nóng chảy Mel-Temp 3.0 (ThermoScientific). + Thiết bịđo độ quay cực JASCO P2000 polarimeter.
21
2.2.4. Dụng cụ thiết bị thử hoạt tính in vitro
+ Phiến 96 giếng. + Pipetman các loại. + Máy ủ phiến 96 giếng.
+ Máy đọc ELISA (Molecular devices Mỹ)
2.2.5. Dụng cụ và thiết bị thử hoạt tính in vivo
+ Kim cong đầu tù, kim tiêm và các thiết bị phụ trợ khác. + Máy đo đường huyết Onetouch Ultra.
+ Máy định lượng sinh hoá bán tựđộng AU680 của hãng Beckman Coulter…
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.1.1.Định tính một số nhóm chất hữu cơ chính
- Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ chính có trong lá Đinh lăng và trong phân đoạn nghiên cứu: bằng các phản ứng đặc trưng của các nhóm chất [7].
2.3.1.2. Chiết xuất và phân lập
* Quy trình chiết xuất phân đoạn lá Đinh lăng
Lá Đinh lăng được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm và xay nhỏ thành bột (4 kg). Toàn bộ lượng bột cho vào bình chiết và được làm ẩm bằng methanol, để yên cho dược liệu được thấm ẩm và trương nở hoàn toàn. Sau đó đổ methanol ngập dược liệu, cách bề mặt dược liệu khoảng 3cm rồi ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24 h. Tiến hành chiết 3 lần. Dịch chiết gom lại và cô cạn dưới áp suất giảm ở nhiệt độ
500C thu được 470 g cắn chiết dạng cao đặc. Cắn toàn phần này được chiết phân
đoạn với dung môi hữu cơ cloroform.
Phân tán cắn methanol với 1,5 lít nước sau đó thêm 1 lít cloroform. Chiết lỏng-lỏng rồi gạn phần cloroform, lấy phần nước. Phần nước tiếp tục được chiết với cloroform 2 lần nữa sẽ thu được phân đoạn nước và phân đoạn cloroform. Cất thu hồi dung môi phân đoạn cloroform thu được cắn cloroform và dịch nước (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phần dung dịch nước để ở 500C cho bay hơi hết dung môi hữu cơ rồi đưa lên cột sắc ký diaion HP-20 và rửa giải bằng hệ dung môi methanol:nước (với tỷ lệ
22
0:100; 25:75; 100:0) thu được 3 phân đoạn ký hiệu F1-F3. Phân đoạn F2 được sử
dụng để nghiên cứu.
Quy trình chiết xuất phân đoạn nghiên cứu được trình bày ở hình 3.1
Hình 2.1. Sơđồ chiết xuất phân đoạn nghiên cứu
Bột dược liệu (4 kg) Dịch chiết MeOH Cắn cloroform Dịch nước F1 F2 MeOH/nhiệt độ phòng (10 l x 3 lần) Diaion HP-20, methanol:nước ( 0:100, 25:75, 100:0) F3 Cắn MeOH (470 g) Cô quay t0, áp suất giảm + cloroform (1l x 3 lần) Phân tán trong nước Chiết
phân
23
Phân lập
Qua nghiên cứu tài liệu về tác dụng sinh học của cây Đinh lăng và của saponin triterpen, kết hợp với kết quả nghiên cứu dược lý (được trình bày ở phần 3.4) của dịch chiết (dịch tổng methanol, phân đoạn nước, phân đoạn F2) thấy phân đoạn F2 có tác dụng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase rất mạnh. Do đó phân đoạn này được tiến hành chiết xuất, phân lập các hoạt chất tinh khiết.
Cắn phân đoạn F2 được hòa tan vào một lượng tối thiểu methanol, sau đó tẩm với silicagel pha thường, tỷ lệ khối lượng 1:1. Khối silicagel ẩm này được quay cất thu hồi dung môi đến thể chất tơi mịn. Bột khô thu được dùng để chiết pha rắn trong bước tiếp theo.
Chuẩn bị cột: cột sắc ký được rửa sạch, tráng bằng methanol, để khô tự nhiên. Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn trên giá. Cho silicagel pha thường lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 1 cm, sau đó đưa lượng chất đã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹđể bột phân bốđều.
Triển khai cột với hệ dung môi ethyl acetat:methanol:nước ( 3:1:0,2). Khảo sát các phân đoạn thu được bằng SKLM, những phân đoạn giống nhau gộp chung lại thì thu được 3 phân đoạn nhỏ F2a-F2c.
Trong đó phân đoạn F2a thấy xuất hiện kết tinh. Lọc lấy chất kết tinh rồi rửa và kết tinh lại nhiều lần bằng methanol sau đó sấy khô thu được một chất kết tinh màu trắng ngà ký hiệu là PFW1(1 g).
Phân đoạn F2c được phân lập tiếp trên cột sắc ký pha đảo YMC-C18 với hệ
dung môi rửa giải bằng methanol:nước (1:1) thu được 2 phân đoạn F2c1-F2c2. Phân
đoạn F2c1 thử trên sắc ký đồ chỉ có 1 vết và xuất hiện kết tinh. Lọc, rửa, kết tinh lại nhiều lần bằng methanol và sấy khô thu được 1 hợp chất ký hiệu là PFW2(20mg).
Hợp chất PFW8 (10 mg) thu được từ phân đoạn F2b khi khai triển trên cột sắc
ký silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải cloroform:metanol:nước (1,5:1:0,1).
24
Hình 2.2. Sơđồ phân lập các hợp chất PFW1, PFW2, PFW8
2.3.1.3. Xác định cấu trúc
- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý như thể chất, màu sắc, độ quay cực, điểm nóng chảy và các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng phun mù điện tử (MS) [25].
2.3.2. Nghiên cứu về tác dụng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase in vitro
Hoạt tính ức chếα-amylase [35]
* Phương pháp
Hoạt tính ức chếα-amylase được thực hiện dựa vào phản ứng khử tinh bột của
α-amylase trong sự có mặt/không có hoạt chất nghiên cứu. Lượng tinh bột còn lại sau phản ứng được định lượng bằng cách bổ sung thêm dung dịch iod và đo mật độ
quang trên máy đo ELISA ở bước sóng 650 nm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Kết quả: được tính theo công thức sau:
% ức chế = [(ODmẫu - ODâm)/(ODdương - ODâm)] x 100 F2 F2b F2c CC, Silicagel EMW (3:1:0,2) F2a F2c1 F2c2 PFW2 Pha đảo YMC-C18 M:W (1:1) PFW1 PFW8 Để kết tinh CC, Silicagel CMW (1,5:1:0,1) Để kết tinh
25 Trong đó:
ODmẫu là giá trị mật độ quang của hỗn hợp tinh bột có ủ với enzyme và mẫu. ODâm là giá trị mật độ quang của hỗn hợp tinh bột ủ với enzyme và không có mẫu.
ODdương là giá trị mật độ quang của hỗn hợp tinh bột không ủ với enzyme và mẫu.
Quá trình tiến hành cụ thể
Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase được tiến hành thử in vitro trên 4 mẫu thử
(dịch chiết methanol tổng, phân đoạn nước, phân đoạn F2, chất PFW1) và chứng dương Acarbose.
Với mỗi một mẫu thử và chứng dương Acarbose, ta tiến hành như sau:
Đun sôi 100 mg tinh bột trong 5 ml đệm phốt-phát (pH 7,0) trong 5 phút sau
đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Tiếp đó trộn 50 μl dung dịch tinh bột này với 30 μl mẫu thử nghiệm pha loãng trong đệm phốt-phát (pH 7,0) và ủ trong tủ ấm 37 oC. Sau 5 phút bổ sung 20 μl dung dịch α-amylase (5 μg/ml pha trong đệm phốt-phát) và ủ tiếp trong 15 phút.
Lượng tinh bột còn lại sau phản ứng được định lượng bằng cách bổ sung thêm 50 μl dung dịch iod và đo mật độ quang trên máy đo ELISA ở bước sóng 650 nm.
Thực hiện 3 lần lặp lại ở mỗi nồng độ thử và thửở 5 nồng độ khác nhau.
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase [35]
* Phương pháp
- Hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNG) thành đường glucose và p-nitrophenol dưới xúc tác α-glucosidase trong sự có/không có mặt hoạt chất nghiên cứu. Mật độ
quang của p-nitrophenol sinh ra sau phản ứng được đo trên máy ELISA (Molecular Device-Mỹ) ở bước sóng 405 nm.
* Kết quả: được tính theo công thức sau:
% ức chế = 100 - [(C - B)/(A - B) × 100] Trong đó:
26
A: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu nghiên cứu, có α-glucosidase và pNPG)
B: Mật độ quang trung bình của mẫu trắng (chỉ có dung dịch pNPG) C: mật độ quang trung bình của mẫu thử.
Quá trình tiến hành cụ thể
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase được tiến hành thử in vitro trên 4 mẫu thử ( methanol tổng, phân đoạn nước, phân đoạn F2, chất PFW1) và chứng dương Acarbose.
Với mỗi mẫu thử và chứng dương, tatiến hành như sau:
Tra vào phiến 96 giếng 10 μL mẫu (pha trong DMSO ở các nồng độ phù hợp) cùng với 45 μL enzyme α-glucosidase (10 U/ml) rồi ủ trong 5 phút. Sau đó bổ sung 45 μL pNPG (5 mM pha trong đệm phosphate) rồi tiếp tục ủ hỗn hợp trong 30 phút
ở 37°C.
Hoạt động của enzyme được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ của sản phẩm p-nitrophenol ở bước sóng 405 nm.
Thực hiện 3 lần lặp lại ở mỗi nồng độ thử và thửở 5 nồng độ khác nhau.
Cách tính kết quả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tính IC50 : giá trị này được tính toán dựa trên đồ thị thể hiện mối tương quan giữa nồng độ và % ức chế của mẫu thửở 5 nồng độ khác nhau.
Kết quảđược biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) từ kết quả
của 3 thí nghiệm lặp lại.
2.3.3. Nghiên cứu tác dụng giảm sự gia tăng đường huyết in vivo
Động vật thí nghiệm
Chuột BALB/c trưởng thành khoẻ mạnh, không mắc bệnh, có khối lượng từ
24-28g được nuôi tại khu nuôi động vật của viện Công nghệ sinh học.
Chuột được nuôi trong điều kiện dinh dưỡng theo tiêu chuẩn của chuột dùng cho thử nghiệm tác dụng dược lý, đảm bảo chu kỳ chiếu sáng, nhiệt độ, độẩm:
+ Thức ăn: Thức ăn viên tổng hợp (làm từ bột bắp, đậu nành, bột cá, thóc mầm,…) dành cho chuột nhắt trắng thí nghiệm của Viện vệ sinh dịch tễ trung ương
27
có chứa tỷ lệ thích hợp protein, carbohydrat, mỡ, chất khoáng, vitamin, chất xơ
(0,8g thức ăn/con chuột/ngày).
+ Nước uống: nước máy sinh hoạt.
+ Ánh sáng: chiếu sáng với chu kỳ 12 giờ sáng, 12 giờ tối.
2.3.3.1. Mô hình chuột dung nạp đường sucarose liều cao
Phương pháp: Phương pháp xác định khả năng chống dung nạp sucarose của
các chất chiết[43]
Nghiên cứu khả năng chống dung nạp sucarose của các chất chiết được thực hiện theo phương pháp của Wu et al, 2011 [43]. Theo đó, 18 con chuột được chia thành 3 nhóm.
- Lô 1 (Chứng thường): uống nước (0,2 ml/con)
- Lô 2 (Chứng dương): uống Acarbose liều 5 mg/kg thể trọng - Lô 3 (thử mẫu): uống PFW1 liều 200 mg/kg thể trọng
Chuột cho nhịn đói 12 giờ trước khi thí nghiệm rồi được uống mẫu thử hoặc nước. Sau 30 phút cho uống mẫu thử, chuột được cho uống sucarose liều 4g/kg thể
trọng. Máu được thu thập ở các thời điểm 0; 0,5; 1 và 2 giờ sau uống sucarose.
Phương pháp xử lí số liệu
- Số liệu được xử lí trên Excel.
- Kết quảđược biểu diễn dưới dạng: giá trị trung bình ± SD
2.3.3.2. Mô hình chuột gây tiểu đường bằng Streptozocin
Gây tiểu đường cho chuột nhắt
Gây tăng đường huyết cho 27 con chuột bằng cách tiêm dung dịch Streptozocin liều 200 mg/kg thể trọng/01 lần duy nhất (pha trong đệm vô trùng Natri citrate). Lấy máu định lượng glucose trong huyết thanh sau 96 giờ (4 ngày) tiêm Streptozocin. Chọn những con chuột có nồng độ glucose huyết lớn hơn hoặc bằng 150 mmol/dL thì được coi là mắc bệnh tiểu đường [30].
Tiến hành thử nghiệm
18 con chuột bị mắc tiểu đường (lựa chọn trong 27 con) được chia thành 3 lô thí nghiệm (6 con/lô) sao cho các lô có trị số glucose huyết trung bình ban đầu tư- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
28
- Lô 1 (Chứng thường): uống nước hòa tan mẫu (0,3 ml/con/ngày) - Lô 2 (Chứng dương): uống Acarbose liều 5 mg/kg thể trọng/ngày - Lô 3 (Thử mẫu): uống PFW1 liều 100 mg/kg thể trọng/ngày
Cho chuột uống mẫu thử hoặc nước trong 4 tuần, mỗi ngày cho chuột uống 1 lần vào buổi sáng. Sau 2 và 4 tuần lấy máu chuột để định lượng glucose huyết (chuột đã được nhịn đói 12 giờ trước).
Phương pháp xử lí số liệu
- Các số liệu được sử lí trên Excel, thuật toán thống kê student t’ test, F’test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA)
- Kết quảđược biểu diễn dưới dạng: giá trị trung bình ± SD - p<0,05 được coi là sai khác có ý nghĩa so với lô chứng
29
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xác định tên khoa học của cây Đinh lăng nghiên cứu
Mẫu Đinh lăng được thu hái tại Đại Từ - TP Thái Nguyên vào tháng 08/2014, có kết quả giám định như sau:
Tên khoa học: Polyscias fruticosa (L.) Harm. Họ: Araliaceae.
Tên thường gọi: Đinh lăng, Đinh lăng lá xẻ, Đinh lăng lá nhỏ
3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
3.2.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong lá Đinh lăng.
Kết quả định tính các nhóm chất có trong lá Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quảđịnh tính sơ bộ các nhóm chất trong lá Đinh lăng STT Nhóm chất Phản ứng quKếảt Sơlu bộận kết Phản ứng với TT. Mayer + Phản ứng với TT. Bouchardat + 1 Alcaloid Phản ứng với TT. Dragendorff + Có Phản ứng Liebermann-burchardt ++ Phản ứng Keller-Kiliani ++ Phản ứng Baljet ++ 2 Glycosid tim Phản ứng Legal ++ Có Phản ứng Cyanidin + Phản ứng với kiềm + Phản ứng với Sắt(III) clorid 5% + 3 Flavonoid Phản ứng với TT.diazo + Có Phản ứng đóng mở vòng lacton - 4 Coumarin Phản ứng với TT.diazo - Không 5 Anthranoid Phản ứng Borntrager - Không
30 STT Nhóm chất Phản ứng quKếảt Sơlu bộận kết Vi thăng hoa - Hiện tượng tạo bọt ++ 6 Saponin Phản ứng Salkowski ++ Có Phản ứng với dd sắt (III) clorid 5% ++ Phản ứng với dd chì acetat 10% ++ 7 Tanin Phản ứng với dd gelatin 1% + Có 8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 + Có 9 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% + + Có
10 Đường khử Phản ứng với TT Felling + Có 11 Polysaccharid Phản ứng với dd Lugol + Có
12 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc + Có
13 Sterol Phản ứng Liebermann-Bouchardt + Có
14 Caroten Phản ứng với acid sulfuric đặc - Không
Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính
(+): Phản ứng dương tính (++): Phản ứng dương tính rõ
Nhận xét: Trong lá Đinh lăng có các nhóm chất chính sau: alcaloid, glycosid tim,
saponin, flavonoid, tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử, polysaccharid, chất béo, sterol.
3.2.2. Định tính sơ bộ các nhóm chất trong phân đoạn chiết lá Đinh lăng
* Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong phân đoạn F2
Tiến hành định tính sơ bộ các nhóm chất chính sau: Alcaloid, Glycosid tim, flavonoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử, polysaccarid, sterol, chất béo
31 Bảng 3.2. Kết quảđịnh tính sơ bộ các nhóm chất trong phân đoạn F2 STT Nhóm chất Phản ứng quKếảt kSết luơ bộận Phản ứng với TT. Mayer - Phản ứng với TT. Bouchardat - 1 Alcaloid Phản ứng với TT. Dragendorff - Không Phản ứng Liebermann-burchardt ++ Phản ứng Keller-Kiliani ++ Phản ứng Baljet ++ 2 Glycosid tim Phản ứng Legal ++ Có Phản ứng Cyanidin + Phản ứng với kiềm + Phản ứng với Sắt(III) clorid 5% + 3 Flavonoid Phản ứng với TT.diazo + Có Hiện tượng tạo bọt ++ 4 Saponin Phản ứng Salkowski ++ Có Phản ứng với dd sắt (III) clorid 5% - Phản ứng với dd chì acetat 10% -
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});