Nghiên cứu một số dược liệu có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THU TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM LIPOXYGENASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013... BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI H

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THU TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

LIPOXYGENASE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THU TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

LIPOXYGENASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Hoàng

Quỳnh Hoa,người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể giảng viên, kĩ thuật viên Bộ môn Thực

vật đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong thời gian làm thực nghiệm tại Bộ

môn Thực vật

Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô Bộ môn Vật lý – Hóa lý đã tạo mọi

điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình sử dụng máy đo quang phổ tại bộ môn Vật lý – Hóa lý

Tôi xin cảm ơn toàn thể cán bộ, giảng viênTrường Đại học Dược Hà

Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới bố mẹ, người thân và

bạn bè của tôi – những người đã luôn động viên, chăm sóc và giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian qua

1.2.2 C

ác mô hình thử tác dụng ức chế LOXdựa trên phương pháp

đo độ hấp thụ……… 9

1.3 T ổng quan vềrutin và các dược liệu thực hiện nghiên cứu……… 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 18

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị trong nghiên cứu…….……… 18

2.2 Nội dung nghiên cứu… ……… 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 20

2.3.1 Phương pháp chiết xuất dược liệu……….……… 20

2.3.2 Phương pháp lựa chọn điều kiện nghiên cứu……….…… 20

2.3.3 Phương pháp khảo sát tương tác enzym – chất ức chế……….…… 23

2.3.4 Lựa chọn mô hình thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu….…… 24

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …….…… 27

3.1 Lựa chọn điều kiện nghiên cứu……… ………… 27

3.1.1 Xác định hoạt độ enzym ……….……….…… 27

3.1.2 Lựa chọn nồng độ enzym………… ……… …… …… 27

3.1.3 Lựa chọn nồng độ cơ chất……….…….… 29

3.1.4 Lựa chọn thời gian ủ……….……… … 31

3.2 Khảo sát tương tác enzym – chất ức chế……… …….… 33

3.3 Thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu theo mô hình 6 cuvet.…… 33

3.4 Bàn luận……….…… 35

3.4.1 Về mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang ……… 35

3.5.2 Về kết quả thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu……… 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AST Aspartate aminotransferase

ALT Alanine aminotransferase

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 1.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá độ ức chế LOX của

3 3.1 Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 5

7 3.5 Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của các

8 3.6 Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của chè

1 1.1 Cơ chất thường gặp của LOX 3

2 1.2 Cấu trúc của 15-LOX ở thỏ 4

4 1.4 Phương pháp đo độ hấp thụ của

5 1.5 Mô hình đĩa 96 giếng của Cayman 11

6 1.6 Cấu trúc hóa học của rutin 14

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong cơ thể người, enzym lipoxygenase (LOX) đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các chất trung gian hóa học gây ra các phản ứng viêm, dị ứng và phản ứng miễn dịch [17] Sản phẩm xúc tác của LOX liên quan nhiều bệnh như hen phế quản [23], xơ vữa động mạch [40], [48], ung thư [56], viêm loét đại tràng [21], viêm khớp, viêm cầu thận [17] và bệnh vẩy nến [32]

Các chất ức chế LOX đã được chứng minh có tác dụng ngăn cản nguy cơ ung thư [59] và đã được sử dụng để điều trị ung thư tuyến tụy [36], ung thư dạ dày [66], ung thư vú [25],ung thư gan di căn [28] và ung thư miệng [45], v.v Một số chất ức chế LOX đã được sử dụng để điều trị hen mạn tính [52], phổi tắc nghẽn mạn tính, bệnh viêm đường hô hấp trên[15], viêm đại tràng [22], [51],viêm khớp gối [29]và bệnh da liễu [15] Có nhiều chất ức chế LOX đã được nghiên cứu có nguồn gốc từ cây cỏ Đây là một hướng nghiên cứu rất tiềm năng trong việc sàng lọc và phát triển các sản phẩm chữa bệnh theo cơ chế ức chế enzym LOX

Nhiều phương pháp đã được tìm ra để thử hoạt tính của LOX như: Sử dụng điện cực oxygen [14], gắn đồng vị phóng xạ 14C [16] hay phương pháp

đo màu [65], [38] Những phương pháp trên yêu cầu các thiết bị chuyên dụng đồng thời lại phức tạp nên không phù hợp với sự sàng lọc nhanh nhiều mẫu Phương pháp đo quang dựa trên cơ chế hình thành hydroxyperoxid (sản phẩm tạo thành trong phản ứng enzym – cơ chất) có nối đôi liên hợp hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ởbước sóng 234nm là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm nhất để đánh giá hoạt tính của LOX [27] Tuy nhiên, cho tới nay, chúng tôi chưa thu thập được tài liệu nào công bố tại Việt Nam về phương pháp này Trên thế giới, cũng chưa có một mô hình thống nhất để thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang, đồng thời các tài liệu đều

không đưa ra vấn đề khảo sát để tìm ra nồng độ enzym, cơ chất hay thời gian

ủ phù hợp nhất

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu một số dược liệu có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase” với hai mục tiêu sau:

Mục tiêu 1: Xây dựng mô hình thử tác dụng dụng ức chế enzym lipoxygenase của dịch chiết dược liệu bằng phương pháp đo quang

Mục tiêu 2: Áp dụng mô hình vừa xây dựng để khảo sát tác dụng ức chế enzym lipoxygenase của dịch chiết các dược liệu: chè dây, dâu tằm, lá móng, kim ngân, cườm rụng, cúc áo, mã đề, xạ đen

Hình 1.1 Cơ chất thường gặp của LOX

1.1.2 Phân loại enzym LOX

LOX có trong thực vật, động vật và nấm Có nhiều loại LOX, nếu phân loại dựa trên vị trí hydroperoxide hóa thì có các loại LOX sau: LOX-1, LOX-

3, LOX-5, LOX-9, LOX-12, LOX-13, LOX-15 Trong đó chỉ có LOX-5, LOX-12, LOX-15 được tìm thấy trên người Hiện nay các nhà khoa học đã tìm ra cấu trúc của LOX-1 và LOX-3 từ đậu nành, LOX-15 từ thỏ[58]

Hình 1.2 Cấu trúc của LOX-15 ở thỏ [18]

Trong cấu trúc của LOX-15 được mô tả ở hình 1.2, có 2 phần riêng biệt: phần màu xanh là phần gắn với acid béo do có cấu trúc tương tự một phần cấu trúc lipase tụy người, phần còn lại là phần xúc tác, vị trí màu tím là trung tâm hoạt động của enzym

1.1.3 Cơ chế phản ứng của enzym LOX và cơ chất

Ở bước đầu tiên của phản ứng, 1 H được tách ra khỏi –CH2– nằm giữa 2 nối đôi trong phân tử acid béo Gốc carbon còn lại sẽ mang một điện tử tự do Một phân tử oxygen sẽ gắn vào nguyên tử Cacbon ở vị trí +2 và -2 tạo thành một acid béo chưa no có gốc peroxy và 2 nối đôi liên hợp Gốc peroxy không bền nên sẽ bị hydrogen hóa tạo thành dạng hydroperoxid [61]

Hình 1.3 Cơ chế xúc tác của LOX

1.1.4 Vai trò của LOX trong động thực vật

Trong thực vật, LOX tham gia vào các hoạt động sinh lý khác nhau bao gồm sinh trưởng phát triển (LOX là một loại protein dự trữ cho quá trình phát triển, đặc biệt là trong hạt lúc nảy mầm [24]), phản ứng khi bị thương, thiếu nước [49], sâu bệnh [47]

Ở động vật có vú, LOX là một trong những enzym chính trong quá trình sinh tổng hợp các chất trung gian hóa học gây ra các phản ứng viêm, dị ứng

và phản ứng miễn dịch [17] Sản phẩm xúc tác của LOX liên quan đến các bệnh hen phế quản [23], xơ vữa động mạch do làm tăng sự oxy hóa LDL

trong máu [40],[48], ung thư [56],viêm loét đại tràng [21], viêm khớp, viêm cầu thận [17] và bệnh vẩy nến [32]

Các chất ức chế LOX có tác dụng ngăn cản nguy cơ ung thư [59] và đã được sử dụng để điều trị ung thư tuyến tụy [36], ung thư dạ dày [66], ung thư

vú [25],ung thư gan di căn [28], ung thư miệng [45], hen mạn tính [52], phổi tắc nghẽn mạn tính, bệnh viêm đường hô hấp trên[15], viêm đại tràng [22], [51],viêm khớp gối [29] và bệnh da liễu [15]

Bên cạnh đó, các chất ức chế LOX cũng có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm Sự xúc tác quá trình oxy hóacác acid béo trong thực phẩm của LOX là một trong những nguyên nhân gây ôi thiu thực phẩmvà làm thay đổi hương vị, màu sắc của thực phẩm Nước chè đã được ứng dụng để bảo quản cá do các hợp chất polyphenol trong chè có tác dụng ức chế LOX tốt [61]

1.1.5 Các chất ức chế LOX

Cho tới nay, các nhà khoa học đã tìm ranhiều chất có tác dụng ức chế LOX bao gồm cả các chất có nguồn gốc thiên nhiên và các chất tổng hợp hóa học Trong số các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên, flavonoid chiếm đa số, bao gồm: Rutin [60], quercetin [30], baicalein, esculetin [54], artemitin và casticin [20] Ngoài ra còn có tanin như epigallocatechin gallate [31] và nhiều hợp chất phenolic tự nhiên khác như acid boswellic [25], acid caffeic, curcuminoid [39], eugenol [50], acid nordihydroguiaretic [64], daidzein và genistein [63] Các chất tổng hợp hóa học có tác dụng ức chế LOX gồmzileuton, tebufelone, darbufelone, phenidone, docebenone và lonapalene [18] Các chất đã liệt kê ở trên đều đã được nghiên cứu trên invitro cho kết quả ức chế LOX tốt, zileuton còn được ứng dụng trên lâm sàng dùng để điều trị hen mạn tính và phổi tắc nghẽn mạn tính [52], [15] Một số chất đã được thử nghiệm trên người và cho thấy kết quả điều trị tốt như acid boswellic

chiết xuất từ cây Boswellia serratatrong điều trị ung thư vú [25] và viêm đại

tràng [29], baicalein trong điều trị ung thư dạ dày [66]

Bên cạnh đó, rất nhiều dịch chiết thực vật đã được chứng minh có tác

dụng ức chế lipoxygenase tốt nhưng chưa phân lập chất tinh khiết như: Bidens pilosa, Solanum nigrum, Justicia flava, Galinsoga parviflora, Oxygonum sinuatum, Chenopodium album, Cleome monophylla, Physalis viscosa [60],Embrica ribes, Terminala chebula, Symplocos racemosa, Rosa demacena [13],Thespesia lampas [41], Woodfordia fructicosa [42], Mahonia aquifolium [46], Camellia sinensis, Theobroma cacao [61],…

1.1.6 Cơ chế ức chế LOX

Enzym LOX được ức chế bằng 2 cách chính: (1) tạo phức chelat với ion

ở vị trí hoạt động của enzym, (2) chuyển enzym từ dạng ferric (dạng có hoạt tính) thành dạng ferrous (bất hoạt) [35] Các chất ức chế LOX có thể hoạt

động theo một trong 2 cách trên

1.2 Các mô hình thử tác dụng ức chế LOX

1.2.1 Nguyên lý của các mô hình thử tác dụng ức chế LOX

Các phương pháp thử hoạt tính của lipoxygenase có thể dựa trên lượng oxy tiêu thụ, lượng cơ chất tiêu thụ hoặc lượng sản phẩm hydroperoxid tạo thành

- Dựa trên lượng oxy tiêu thụ: xác định lượng oxy tiêu thụ sử dụng điện

cực oxygen [14] Phương pháp tuy chính xác nhưng lại yêu cầu thiết bị chuyên dụng và không phù hợp với sự sàng lọc nhanh nhiều mẫu

- Dựa trên lượng cơ chất tiêu thụ:sử dụng acid linoleic gắn đồng vị

phóng xạ 14

C, sản phẩm tạo thành gắn đồng vị phóng xạ sẽ được tách ra bằng phương pháp sắc ký [16] Phương pháp này phức tạp và không nhanh

- Dựa trên lượng sản phẩm hydroperoxide tạo thành:

Sản phẩm đầu tiên của phản ứng biến đổi acid linoleic dưới xúc tác của

lipoxygenase là một acid béo chưa no có chứa 4-hydroperoxy-cis, trans-1,3- pentadien liên hợp [19], [26].Việc xác định lượng hydroperoxid tạo thành được thực hiện dựa trên 2 nguyên tắc đo màu và đo độ hấp thụ

o Phương pháp đo màu: sản phẩm hydroperoxid tạo thành phản ứng

với I– giải phóng I2, thêm hồ tinh bột, định lượng sản phẩm có màu tạo thànhdo hồ tinh bột kết hợp với I2bằng phương pháp đo màu [65].Một số tác giả khác cho sản phẩm hydroperoxide oxy hóa Fe2+

thành Fe3+ , sau đó cho

Fe3+phản ứng với thiocyanat và định lượng sản phẩm có màu tạo thành bằng phương pháp đo màu [38] Bên cạnh đó, một số tác giả lại cho hydroperoxid oxy hóa cặp 3-methyl-2-benzothiazolinon và 3-(dimethylamino)benzoic acid dưới xúc tác của hemoglobin tạo thành sản phẩm có màu rồi định lượng bằng phương pháp đo màu [27] Phương pháp đo màu đơn giản, tuy nhiên không phù hợp với các mẫu có màu

o Phương pháp đo độ hấp thụ: Sản phẩm hydroperoxid tạo thành có

nối đôi liên hợp, hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 234nm [27] nên có thể xác định lượng sản phẩm tạo thành qua sự thay đổi độ hấp thụ ở bước sóng 234nm.Đa số các phương pháp thử hoạt tính của lipoxygenase đều áp dụng phương pháp này vì đơn giản, nhanh chóng.Thiết bị là máy đo quang phổ UV-VIS sử dụng cuvet hoặc máyquang phổ Elisasử dụng đĩa nhiều giếng

Acid béo + O2 → Hydroperoxidcủa acid béo (R-O-O-H)

LOX

Hình 1.4 Phương pháp đo độ hấp thụ của hydroperoxid Phương pháp đo độ hấp thụ của sản phẩm hydroperoxid tạo thành có nhiều mô hình đo khác nhau

1.2.2 Các mô hình thử tác dụng ức chế LOX dựa trên phương pháp đo

độ hấp thụ

1.2.2.1 Mô hình của Sigma – Aldrich [57]

Mô hình của Sigma – Aldrich sử dụng máy quang phổ spectrophotometer UV – VIS và cuvet thạch anh, đọc độ hấp thụ ở bước sóng 234nm

Đơn vị hoạt tính enzym được sử dụng là Unit, được định nghĩa như sau:

1 unit enzym tương ứng sự tăng của độ hấp thụlà 0,001mỗi phút ở bước sóng 234nm, pH9,0, nhiệt độ 25oC, cơ chất sử dụng là acid linoleic, tổng thể tích dung dịch trong cuvet là 3ml, bề dày dung dịch là 1cm, 1unit tương ứng với

sự oxy hóa 0.12µmol acid linoleic

Có cis, cis-1,4-pentadien

Acid béo chưa no có chứa

4-hydroperoxy-cis,trans-1,3- pentadien liên hợp

Có nối đôi liên hợp hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 234 nm [27] → Đo được hydroperoxid tạo thành bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV

Phương pháp xác định hoạt tính enzym là phương pháp đo quang Phản ứng thực hiện trong cuvet Có 2 cuvet: cuvet chứa mẫu thử và cuvet chứa mẫu trắng Mẫu thử bao gồm 900µl đệm borat, 2ml dung dịch cơ chất, 100µl dung dịch enzym Mẫu trắng bao gồm 1ml đệm borat và 2ml dung dịch cơ chất Nồng độ dung dịch cơ chất là 536µM, nồng độ dung dịch enzym là 5000 – 10000U/ml và đệm borat pH9,0 Ở 25oC, bước sóng 234nm, đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắngtại thời điểm 5 phút

Hoạt độ thực sự của dung dịch enzym được tính theo công thức:

1.2.2.2 Mô hình của Cayman [19]

Mô hình của Cayman sử dụng máy quang phổ Elisa microplate reader và đĩa 96 giếng, ngừng phản ứng bằng chromogen, đọc độ hấp thụ ở bước sóng

490 – 500 nm.Mô hình đĩa 96 giếng được trình bày trong hình 1.4 Bố trí thí nghiệm được trình bày trong bảng 1.1

Hình 1.5 Mô hình đĩa 96 giếng của Cayman

Bảng 1.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá độ ức chế LOX của Cayman

phản ứng 10µl cơ chất 10µl cơ chất 10µl cơ chất 10µl cơ chất

Lắc đĩa trong 5 phút Ngừng

phản ứng chromogen 100µl

100µl chromogen

100µl chromogen

100µl chromogen Lắc đĩa trong 5 phút

Đọc độ hấp thụ ở 490 – 500nm

Tỷ lệ phần trăm ức chế của chất ức chế được tính theo công thức:

Trong đó:

IA là độ hấp thụ trung bình của các mẫu mà enzym có 100% hoạt tính

I là độ hấp thụ trung bình của các mẫu chất ức chế giống nhau

Ưu điểm của phương pháp này là cho kết quả chính xác vì tất cả các mẫu và tất cả các nồng độ đo cùng thời điểm Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là khó thưc hiện vì cần pha các mẫu cùng lúc để đo độ hấp thụ ở cùng thời điểm

1.2.2.3 Các mô hình thử hoạt tính kháng LOX của dịch chiết thực vật

Tất cả các nghiên cứu thử hoạt tính của dịch chiết thực vật đều thực hiện

ở 25oC Phần lớn các nghiên cứusử dụng máy quang phổ spectrophotometer

UV – VIS với cuvet thạch anh và giống nhau ở quy trình thí nghiệm như sau:Phối hợp enzym với chất ức chế Sau 5 phút, thêm cơ chất Đo độ hấp thụ

ở 234nm

Công thức tính % ức chế của dịch chiết dược liệu so chất ức chế chuẩn:

Các mô hình nghiên cứu khác nhau về chất chuẩn, dung môi chiết xuất, dung môi hòa tan cắn,dung dịch đệm sử dụng, nồng độ enzym và nồng độ cơ chất

a Mô hình của Kumaraswamy M.V.[41], [42]

Kumaraswamy M.V và cộng sự đã sử dụng phương pháp chiết xuất

dược liệu bằng methanol, cất thu hồi dung môi thu được cắn, hòa tan cắn

trong đệm borat pH9,0 Thêm 0,25ml dung dịch enzym (20 000U/ml) Ủ 5 phút ở 25o

C rồi thêm 1ml dung dịch acid linoleic 0,6mM Đo độ hấp thụ ở 234nm Song song thực hiện với mẫu indomethacin chuẩn

b Mô hình của Veronica Sanda Chedea[62]

Veronica Sanda Chedea và cộng sự đã thử tác dụng ức chế LOX theo quy trình sau: Ủ 160µl dung dịch LOX (2300U/ml) với 50µl chất ức chế trong

5 phút Thêm 8,4µl dung dịch cơ chất 2,2mM Đo độ hấp thụ ở 234nm Song song làm một mẫu trắng gồm 840µl đệm borat pH9,0 và 160µl dung dịch LOX

c Mô hình của Ali Shah S.M.[13]

Ali Shah S.M dùng methanol để chiết xuất dược liệu Cắn thu được sau khi cất thu hồi dung môi được hòa tan trong Tris-buffer pH7,4 Ủ dung dịch

ức chế tạo thành với enzym trong 10 phút ở 25o

C, thêm cơ chất Đo độ hấp thụ sau 6 phút Song song làm với baicalein chuẩn để so sánh

d Mô hình của Sekhar Rao [53]

Sekhar Rao và cộng sự dùng ethyl acetat để chiết xuất dược liệu, thu hồi dung môi thu cắn, hòa tan cắn trong DMSO Quy trình thí nghiệm như sau: Phối hợp 60µl dung dịch cơ chất 10mM với 10µl dung dịch chất ức chế, thêm 2,91ml đệm borat, bắt đầu phản ứng bằng cách thêm 20µl enzym Đo độ hấp thụ sau 3 phút Song song làm mẫu trắng, thay 10µl dung dịch chất ức chế bằng 10µl DMSO

e Mô hình của Uma Sankar Akula [60]

Uma Sankar Akula và cộng sự đã công bố phương pháp chiết xuất dược liệu bằng methanol, cất thu hồi dung môi thu được cắn, hòa tan cắn trong DMSO Dung môi hòa tan enzym và cơ chất là đệm phosphate pH9,0 Chất chuẩn được sử dụng là rutin và nordihydroguaiaretic acid.Phối hợp 50µl dung dịch enzym với 30µl dung dịch chất ức chế Thêm 2ml dung dịch cơ

chất 100µM Đo độ hấp thụ ở 234nm Song song làm một mẫu trắng, thay 30µl dung dịch chất ức chế bằng 30µl đệm phosphate pH9,0

1.3 Tổng quan về rutin và các dược liệu thực hiện nghiên cứu

1.3.1 Rutin

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của rutin

Rutin có nhiều trong các loại dược liệu như cây hoa hòe (Sophora japonica L.), táo ta (Zizyphus jujuba Lamk.), mạch ba góc (Fagopyrum esculentum Moench.) [8].Rutin có khả năng ức chế LOX mạnh nên đã được dùng làm chất chuẩn trong nhiều nghiên cứu về khả năng ức chế LOX của dịch chiết thực vật [60] Nhiều tác dụng của rutin liên quan trực tiếp đến khả năng ức chế LOX đã được thử nghiệm trên động vật cho thấy kết quả tốt như tác dụng chống viêm [55], chống oxy hóa [33] và giảm nguy cơ tim mạch do làm giảm oxi hóa LDL [34]

1.3.2 Chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.), họ Nho (Vitaceae)

Lá chè dây chứa flavonoid, tanin, đường, protein, giàu K+

, Ca2+, Fe2+,

Zn2+, cùng các vitamin E, B1, B2 Lá chè dây có hàm lượng flavonoidvà tanin cao.Hai flavonoid của lá chè dây là myricetin và dihydromyricetin Tanin trong lá chè dây thuộc loại tannin catechic [12]

Chè dây có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, khu phong, lợi thấp, giảm đau, chống viêm[1].Chè dây có tác dụng tốt trong điều trị viêm loét dạ dày – hành

tá tràng, có tác dụng kháng khuẩn khá và tác dụng chống oxy hóa mạnh [12] Cao khô chè dây có hoạt tính chống oxy hóa, ức chế sự phát triển của một số chủng vi khuẩn, điều trị hiệu quả bỏng và loét dạ dày tá tràng, ức chế đột biến gen gây nên bởi một số tác nhân độc hại [43]

1.3.3 Dâu tằm(Morus alba L.), họ Dâu Tằm (Moraceae)

Lá dâu tằm chứa 4 flavonol là quercetin-3-β-D-glucose, glucose-6″-acetate, rutin và quercetin[37] Ngoài ra còn có caroten, tanin, rất

quercetin-3-O-ít tinh dầu, vitamin C, cholin, adenin, trigonellin, pentozan, đường, canxi malat và canxi cacbonat [8].Các flavonol khử các gốc peroxyl, gốc hydroxyl nên chống oxy hóa mạnh [37]

1.3.4 Lá móng(Lawsonia inermis L.), họ Tử Vi (Lythraceae)

Trong lá và rễ cây lá móng chứa flavonoid, saponin, acid hữu cơ, đường khử, chất béo, hợp chất steroid và polysaccharid [3] Ngoài ra còn có tannin, tinh dầu, chất nhựa, chất màu, glucose, manitol Rễ chiết được chất sterol là lawsaritol và dihydroxysterol là lawsaritol A Hoa chứa tinh dầu có ionon Hạt chứa protein, chất béo và hydratcarbon.Vỏ cành cây chứa một naphtoquinon gọi là isoplumbagin [8], [2] Lá chứa anthranoid Từ lá đã phân lập được 6 chất sau: 2β, 3β–dihydroxy–12–oleanen–28–oic acid; 1β, 2α, 3α, 19α–tetrahydroxy–12–ursen–28–oic acid; Suavissimoside R1; Afzelin; Catechin;

và Rubinaphthin [3] Ngoài ra, lá móngcòn chứa một oxynaphtoquinon gọi là Lawsone, một hydrocarbon no là 3–methylnonacosan–1–ol, một lawsoniasid

có cấu trúc 1,2,4–trihydroxynaphtalen–1,4–dibeta–D–glucopyranosid và một laliosid là 2,3,4,6–tetrahydroxyacetophenol–2–beta–D–glucopyranosid[8], [2]

Lá móng có tác dụng kháng khuẩn, giảm đau, hạ sốt, chống viêm, lợi tiểu, lợi mật, ức chế co thắt cơ trơn gây bởi histamine và acetylcholine trên chuột lang, giảm AST và ALT huyết thanh chuột, kháng estrogen chuột nhắt trắng [2]

1.3.5 Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), họ Cơm Cháy (Caprifoliaceae)

Trong kim ngân có 2 nhóm chất chủ yếu là flavonoid và saponin triterpenoid Flavonoid được biết đến nhiều trong kim ngân là luteolin và luteolin – 7 – glucosid.Ba loại saponin triterpenoid là caroten, cryptoxanthin

và auroxanthin Lonicerosid là một saponin kim ngân có có tác dụng chống viêm Tinh dầu kim ngân chứa α–pinem, genaniol, α–terpeniol, eugnol, linalol Tanin kim ngân gồm acid chlorogenic và acid isochlorogenic

Kim ngân có tác dụng kháng khuẩn, tăng đường huyết, chống choáng phản vệ [8], kháng virus, chống lao [2], hạ cholesterol máu [10] Tác dụng chống viêm [6], chữa viêm kết mạc tốt [2], chống oxy hóa mạnh bằng cách làm tăng hoạt động của peroxydase trong máu người và ức chế sự peroxyd hóa lipid màng tế bào [4]

1.3.6 Cườm rụng (Ehretia acuminata P Br), họ Vòi Voi (Boraginaceae)

[5]

Trong lá và cành cườm rụng có flavonoid, tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử Acid hữu cơ chỉ có trong cành, saponin và sterol thì chỉ có ở lá Cườm rụng có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, bảo vệ gan (giảm hoạt độ các enzm ALT và AST ở gan chuột bị gây độc bằng paracetamol)

1.3.7 Xạ đen (Ehretia asperula Zoll et Mor), họ Vòi Voi (Boraginaceae)

Thành phần hóa học của lá xạ đen gồm có flavonoid, tanin, các acid amin, đường khử, cyanoglycosid, triterpenoid

Xạ đen có tác dụng hữu hiệu trong chữa trị ung thư doức chế sự phát triển của tế bào ung thư [5], [7], bảo vệ gan (giảm hoạt độ các enzm ALT và AST ở gan chuột bị gây độc bằng paracetamol), điều trị mụn nhọt, ung thũng, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng, giúp ăn ngon, mát huyết, chữa mất ngủ, vàng da Hợp chất lấy từ xạ đen kết hợp với phylamin còn có tác dụng kéo dài tuổi thọ trung bình của động vật bị ung thư [7] Xạ đen cũng được bào chế thành những sản phẩm chức năng hỗ trợ điều trị ung thư hiện có trên thị trường như “Trà bảo thọ xạ đen Hòa Bình” của Công ty cổ phần y dược học cổ truyền Hòa Bình kết hợp với Công ty Dược liệu Trung ương I, và “Trà tam thất – Xạ đen” của Học viện quân y

1.3.8 Cúc áo (Spilanthes acmella L Murr.), họ Cúc Asteraceae [8]

Trong cụm hoa cúc áo có chứa một tinh dầu mùi cay hăng, thành phần chủ yếu của tinh dầu là một chất tecpen đặc biệt gọi là spilanthen và một chất rượu gọi là spilantola

Cúc áo có tác dụng giảm đau, sưng, gây tê, chữa sâu răng, chảy máu chân răng

1.3.9 Mã đề (Plantago asiatica L.), họ Mã Đề (Plantaginaceae) [8]

Toàn cây mã đề chứa plantagin và một glucosid gọi là aucubin Trong lá chứa chất nhầy, chất đắng, carotin, Vitamin C, vitamin K, vitamin T, acid citric Trong hạt chứa nhiều chất nhầy, acid plantenolic, adenine và cholin

Mã đề có tác dụng lợi tiểu, chữa ho trừ đờm, ức chế một số vi trùng bệnh ngoài da, đắp lên mụn nhọt đỡ mung mủ và viêm tấy, chữa viêm khí quản, mắt đỏ đau, chữa cao huyết áp và tả lỵ

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị trong nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Danh mục các mẫu nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục các mẫu nghiên cứu

STT Tên Việt Nam Bộ phận dùng Nơi thu mẫu Thời gian

thu mẫu

1 Chè dây Toàn cây Sa Pa, Lào Cai 3/2013

Các mẫu thu được sấy khô ở 50oC, bảo quản ở nơi thoáng mát, nhiệt độ phòng, tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội

2.1.2 Hóa chất

- Enzym Lipoxygenase Type I – B, mã số L1376-1G (Sigma – Mỹ)

- Cơ chất acid linoleic, mã số L7395-15MU (Sigma – Mỹ)

- Rutin (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương)

- Methanol, acid boric, natrihydroxide (Trung Quốc)

- Nước cất 2 lần (Khoa dược, Bệnh viện 108)

2.1.3 Thiết bị

- Máy quang phổ Spectrophotometer U – 1900 UV/VIS, model 3J0 –

0003 (Bộ môn Vật lý – Hóa lý Trường Đại học Dược Hà Nội)

- Máy đo pH BenchMeter pH 510 (Bộ môn Hóa phân tích, Trường Đại

học Dược Hà Nội)

- Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI – Đức (Bộ môn Thực vật,

trường Đại học Dược Hà Nội)

- Tủ sấy Memmert (Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội)

- Cân phân tích Shimadzu (Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà

Nội)

- Pipet Eppendorf (Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội)

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các điều kiện nghiên cứu: Xác định hoạt độ enzym, lựa chọn

nồng độ enzym, lựa chọn nồng độ cơ chất và lựa chọn thời gian ủ

- Kiểm tra tương tác giữa enzym và các mẫu nghiên cứu bao gồm rutin,

chè dây, dâu tằm, lá móng, kim ngân, cườm rụng, cúc áo, mã đề, xạ đen Từ đó lựa chọn mô hình thử phù hợp với từng mẫu nghiên cứu

- Thử tác dụng ức chế LOX của các mẫu nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết xuất dược liệu

Cân 20g bột dược liệu bằng cân kĩ thuật Thấm ẩm bằng methanol, ngâm trong 300ml methanol trong 1 tuần Gạn lấy dịch chiết Cất thu hồi dung môi thu được cắn.Làm khô cắn, cắn pha trong methanol tạo dung dịch có nồng độ từ1mg/ml đến 10mg/ml

2.3.2 Phương pháp lựa chọn điều kiện nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành khảo sát để lựa chọn điều kiện thí nghiệm bao gồm: xác định lại hoạt độ enzym, lựa chọn nồng độ enzym, lựa chọn nồng độ

cơ chất và lựa chọn thời gian ủ

2.3.2.1 Chuẩn bị hóa chất

A Đệm borat 200mM, pH 9,0

- Pha NaOH1M: cân khoảng 2g NaOH hòa tan trong vừa đủ 50ml nước

cất 2 lần

- Cân chính xác khoảng 6,183g acid boric hòa tan trong ≈ 500ml nước cất

2 lần, điều chỉnh đến pH 9,0 bằng NaOH 1M vừa pha, bổ sung nước cất

2 lần vừa đủ 500ml

B Ethyl alcohol 95% (v/v)

Thêm nước cất 2 lần vào ethyl alcohol tuyệt đối đến khi cồn kế chỉ 95%

C Dung dịch acid linoleic

Phối hợp 0,05ml ethyl alcohol 95% và 0,05ml acid linoleic, thêm từ từ đệm borat đến vừa đủ 50ml Lắc ở máy vortex đến đồng nhất Lấy 5ml dung dịch này thêm 20ml đệm borat và 5,0ml nước cất 2 lần được dung dịch acid linoleic có nồng độ 536µM

D Dung dịch enzym LOX