BỘ Y TẾ
BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
Nghiên cứu một số dược liệu cĩ tác:
dụng trên ký sinh trùng,
— Cơn Trùng vị ung thư
từ nguồn tời nguyên thực vột Việt nam
bằng kết hợp sịng lọc sinh học vị nghiên cứu hĩa học
CƠ QUAN CHỦ TRÌ
Trường Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh BAN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
Trang 2CÁN BỘ NGHIÊN CỨU CHÍNH
PGS Ngơ Vân Thu - Trưởng bộ mơn Dược - ĐH Y Dược Tp HCM
PGS PTS Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ - Phĩ phịng NCKH - ĐHYD Tp HCM TS Trần Hùng - Trưởng ban Sau ĐH, Giảng viên BM Dược liệu
ThS Vương Văn Ảnh - Phĩ phịng TCCB, Giảng viênBM Dược liệu
DS CKY Võ Văn Lẹo - Phĩ CN BM Dược liệu
DS CKI Võ Thị Bạch Huệ - Phĩ CN BM Kiểm nghiệm DS CKI Huynh Ngoc Thuy - Giảng viên bộ mơn Dược liệu
Ths Phạm Đơng Phương - Phĩ trưởng Khoa Dược, Giảng viên BM Dược liệu PTS Nguyễn Viết Kình - Giảng viên BM Dược liệu
Trang 3PHAN |
Trang 4iz dna ƒ - Det van dé
}
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, nhu cầu về các thuốc đùng trong điều trị ký sinh trùng và chống ung thư trên thế giới và trong nước là rất lớn Các thuốc hiện cĩ trên thị trường cịn cĩ những hạn chế về mặt tác dụng, nên các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang phải tiếp tục nghiên cứu tìm ra các thuốc trị ung thư và sốt rét cĩ hiệu quả hơn để bổ sung vào các phác đồ điều trị Các nhà khoa học biện đang rất chú ý đến kho tàng y dược học cổ truyền của các dân tộc nhằm tìm ra những phân tử thuốc mới cĩ nguồn gốc tự nhiên cĩ tác dụng trị liệu để đưa vào sử dụng, cũng như làm mơ hình cho việc bán tổng hợp những dẫn xuất cĩ tác dụng trị liệu cao Nước ta cĩ hệ thực vật rất phong phú và cĩ rất nhiễu bài thuốc
dân gian Việc nghiên cứu thử nghiệm tac dụng trị ung thư, ký sinh trùng và cơn trùng
để làm sáng tỏ giá trị của nguồn (ài nguyên thiên nhiên, tìm ra các cây thuốc quí để đưa vào khai thác sử dụng là cần thiết Nhu cầu-về thuốc nĩi chung và thuốc điều trị ký sinh trùng, ung thư v.v nĩi riêng ở nước ta hiện nay rất lớn Phần lớn các thuốc này đều phải nhập nội Nhiều loại thuốc rất đắt tiền (như các thuốc trị ung thư) mà đa số nhân dân lao động khơng đáp ứng được Việc tìm ra các nguồn thuốc tại chỗ, đi từ nguồn gốc tự nhiên để bổ sung hay thay thế một phần các thuốc nhập nội ngồi ý nghĩa khoa học cịn gĩp một phần khơng nhỏ trong việc bảo vệ sức khỏe nhân dan
Việc nghiên cứu tìm ra thành phần hoạt chất của cây thuốc địi hỏi nhiều thời gian và cơng sức Trước đây, được liệu nghiên cứu thường được chọn các một cách ngẫu nhiên
và các nghiên cứu thường được tiến hành độc lập giữa nghiên cứu hố học và thử tác dụng sinh học nên tiêu tốn nhiễu thời gian và tiên của Hiện nay, xu hướng chung trong
nghiên cứu cây thuốc là kết hợp giữa việc sàng lọc các cây thuốc được sử dụng trong dân gian bằng các thử nghiệm sinh học với nghiên cứu chiết xuất phân lập các hoạt chất
nhằm định hướng vào các thành phần cĩ tác dụng sinh học đỂ rút ngắn thời gian, tránh mị mẫm trong nghiên cứu Kết qủa nghiên cứu trong những năm gần đây đã chứng tỏ
hướng nghiên cứu này rất cĩ hiệu quả Thời gian nghiên cứu được rút ngắn, giảm kinh phí và tăng hiệu quả trong việc âm kiếm các thuốc mới Việc tìm ra các hợp chất chống
ung thư như podophyllin, taxol là những ví dụ chứng minh cho tính đúng đắn của việc
kết hợp đĩ
Trừớc đây, các thử nghiệm sinh học, đặc biệt là các thử nghiệm tác dụng chống ung thư
phải thực hiện in vivo r&t tốn thời gian và tiên của Gần đây nhiều tác giả đã nghiên
cứu các mơ hình thử nghiém sinh hoc in vitro nhu 1a cdc tht nghiém ban dau (pretest)
cho việc sàng lọc nhanh và it tốn kém một lượng lớn mẫu nghiên cứu Bằng những thử nghiệm này, từ một số lượng lớn các mẫu cây thuốc được thu thập đựa vào kinh nghiệm
dân gian (Ethnopharmacology) qua sang lọc sinh học, các nhà nghiên cứu cĩ thể tập
trung vào một vài cây thuốc cĩ tác dụng tốt nhất Từ các cây thuốc này, cũng bằng kết
hợp các thử nghiệm sinh học và nghiên cứu hĩa học cĩ thể định hướng tới các hoạt chất
của cây thuốc, bỏ qua các thành phần khơng cĩ tác dụng
Trang 5Phén 1 Dat vain dt 2
plasmodium in vitro 14 nhitng thit nghiém nhu vay Cac thứ nghiệm sinh học này đã được các nhà nghiên cứu của các viện nghiên cứu lớn sử dụng và hồn thiện Ngày nay
chúng được chấp nhận rộng rãi trên thế giới trong sàng lọc ban đầu các cây thuốc Viện
Nghiên cứu Ung thư Hoa Kỳ đã quyết định chỉ sử dụng các thử nghiệm in vivo (P-388,
9-KB ) những chất nào cho kết quả tốt trên các thử nghiệm sàng lọc trên
Trong nước đã cĩ một số cơng trình nghiên cứu riêng lẻ về sàng lọc các cây thuốc trị giun sán như các cơng trình của GS Đăng Văn Ngữ và các cộng tác viên (1960), sốt rét của GS Ngơ Vân Thu và Cs (1976) và ly amib của GS Nguyễn Vĩnh Niên, GS Ngơ Vân Thu và Cs (1988) Tuy nhiên, các cơng trình nghiên cứu trước đây chỉ mới thực
hiện trên một số nhỏ các cây thuốc Chưa cĩ cơng trình nào nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc hướng tới tác dụng trị ung thư, một trong những mối quan tâm hàng đầu của
các nhà nghiên cứu những dược phẩm tương lai cũng chưa nghiên cúu các tác dụng kể trên trong mối liên hệ : kháng sốt rét - trị ly amib - độc đối với tế bào / trị ung thư như
một số cơng trình nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh
Các nghiên cứu khác chỉ thực hiện trên từng được liệu riêng lẻ
2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI :
Tìm ra những cây thuốc thực sự cĩ tác dụng trị bệnh nhằm đưa các cây thuốc đĩ vào sử dụng nhằm tăng nguồn thuốc phịng và chữa bệnh cho nhân dân
Để thực hiện mục tiêu này, để tai sit dung mét s6 thi nghiém in vitro ding Artemia
salina và các thử nghiệm trên ký sinh trùng và cơn trùng khác v.v sàng lọc một số cây
thuốc được sử dụng trong dân gian và những lồi tương cận nhằm tầm ra những cây
thuốc cĩ tác dụng trên các bệnh ký sinh trùng, cơn trùng ung thư Từ đĩ tìm ra những
nhĩm hoạt chất hay hoạt chất tinh khiết từ những cây thuốc đã được lựa chọn qua kết
quả sàng lọc ban đầu làm tiễn để triển khai các nghiên cứu sâu hợn vệ dược lý và đạng
bào chế các chế phẩm từ một vài cây cĩ tác dụng tốt nhất đối với các bệnh nĩi trên
3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
(cho đề tài hồn chỉnh nghiên cứu trong nhiều năm)
1 Nghiên cứu Được lý dân tộc học (ethnopharmacology) : Thu thập tài liệu về các cây
thuốc, bài thuốc kinh nghiệm dân gian; tham khảo các tài Hiệu về sử dụng cây thuốc
của các nước; các dân tộc trên thế giới; các nghiên cứu được lý hiện đại để lập nên một danh sách cây thuốc trị các bệnh ly, ký sinh trùng và cơn trùng v.v
2 Chọn ra nhũng cây thuốc được xem là cĩ tác dụng tốt, cĩ tần suất sử đụng cao trong
dan gian, được nhiều dân tộc sử dụng, hoặc đã cĩ các thử nghiệm dược lý chứng mỉnh tác dụng để phục vụ cho nghiên cứu sàng lọc
3 Thu thập mẫu dược liệu từ đanh sách cây thuốc nêu trên
Trang 6Phén | - Dat véin dé 3
ee
ND
10
Thử độc tính trên trùn chỉ 1ữmnodrilus hofmoistery
Thit déc tinh trén Tam Bombyx mori Thử độc tính trên ấu trùng muỗi Aedzs
Thử tác đụng gây chán ăn trên Tằm Bormbyx mmori
"Thử tác động chống phân bào trên mơ phân sinh rễ hành Ailiur ascalonicum
Từ các thử nghiệm trên lựa chọn những cây thuốc cĩ tác dụng mạnh nhất để nghiên cứu tiếp các bước 11 12 13 14 15 16
Phân tích thành phần hĩa thực vật của cây thuốc bằng các phương pháp hố học, sắc ký (Sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng cao áp .) để định hướng cho chiết xuất và phân lập các hoạt chất
Chiết cao chiết tồn phân của dược liệu Dùng các kỹ thuật hố thực vật (chủ yếu là các kỹ thuật sắc ký) để phân tách hoạt chất tồn phần thành những phân đoạn
đơn giản hơn
Kiểm tra tác dụng sinh học của các phân đoạn đã tách được
Định hướng vào các phân đoạn cĩ tác dụng sinh học tốt, kết hợp với kỹ thuật hĩa thực vật để chiết tách các hoạt chất tinh khiết phục vụ cho nghiên cứu cấu trúc,
nghiên cứu tác dụng dược lý, chiết xuất lớn, bào chế và tiêu chuẩn hĩa
Nghiên cứu các đặc tính lý hĩa của các chất phân lập được và xác định cấu trúc
của chúng bằng các phương pháp phổ hiện đại như MS, NMR, X-ray
Song song với giai đoạn 14, 15 là nghiên cứu bước đầu độc tính và dạng bào chế
của cây thuốc cĩ tác dụng tốt nhất
4 NỘI DUNG CỤ THỂ CỦA ĐỀ TÀI
1
@
Ø0
Thu thập tài liệu về các cây thuốc, bài thuốc kinh nghiệm dân gian; tham khảo các tài liệu về sử dụng cây thuốc của các nước; các dân tộc trên thế giới; các nghiên
cứu dược lý hiện đại để lập nên một danh sách cây thuốc trị các bệnh ly, ký sinh trùng và cơn trùng v.v
Chọn ra khoảng 50 cây thuốc được xem là cĩ tác dụng tốt, cĩ tần suất sử dụng cao trong dân gian, được nhiều dân tộc sử dụng, hoặc đã cĩ các thử nghiệm dược lý
chứng minh tác dụng để phục vụ cho nghiên cứu sàng lọc
_ Thu thập mẫu dược liệu từ danh sách 50 cây thuốc nêu trên
Chiết cao MeOH và cao nước tồn phần của các mẫu dược liệu đãthu thập
Thử độc tính của các dịch chiết trên ấu trùng Artemia salina
Thử độc tính trên trùn chi Limnodrillus hofmoistery
Thử độc tính trên Tăằm Bombyx mọi Thử độc tính trên ấu trùng muỗi Aedes
Trang 7ha i Dat van 4
10 Thử tác động chống phân bào trên mơ phân sinh rễ hành Alium agealonicuma Từ các thử nghiệm trên lựa chọn những cây thuốc cĩ tác dụng mạnh nhất để nghiên cứu tiếp các bước
11 Phân tích thành phần hĩa thực vật của cây thuốc bằng các phương pháp hố học, sắc ký (Sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng cao ấp ) để định hướng cho chiết xuất và phân lập các hoạt chất
12 Chiết cao chiết tồn phân của dược liệu Dùng các kỹ thuật hố thực vật (chủ yếu
là các kỹ thuật sắc ký) để phân tách hoạt chất tồn phần thành những phân đoạn
đơn giản hơn
13 Kiểm tra tác đụng sinh học của các phân đoạn đã tách được
14 Định hướng vào các phân đoạn cĩ tác dụng sinh học tốt, kết hợp với kỹ thuật hĩa
thực vật để chiết tách các hoạt chất tĩnh khiết phục vụ cho nghiên cứu cấu trúc, nghiên cứu tác dụng dược lý, chiết xuất lớn, bào chế và tiêu chuẩn hĩa
15 Nghiên cứu các đặc tính lý hĩa của các chất phân lập được và xác định cấu trúc
Trang 8PHAN II
Trang 9hdr M huenag php nghien ate 2
1 LỰA CHỌN MẪU NGHIÊN CỨU
Mẫu nghiên cứu được lựa chọn theo các nguyên tắc sau :
Được sử dụng trong dân gian, được ghi nhận trong các sách y học cổ truyền của các dân
tộc dùng để điều trị các bệnh giun sán, ký sinh trùng (chấy, rận), ly, tiêu chảy, sốt rét
(sốt cách nhật, ngã nước, sốt rét rừng, nghịch tật), ung thư, Các dữ liệu này được thu thập từ các tài liệu trong và ngồi nước, các kinh nghiệm thực tế thu thập trong các
chuyến đi điều tra thu thập mẫu (Nghiên cứu dược lý dân tộc học -
Ethnopharmacology)
Được biết cĩ tác dụng trên giun sán, chấy rận, ly, sốt rét, ung thư và cĩ tác dụng tác
dụng trên đơn bào, cơn trùng khác qua các thử nghiệm sinh học, dược lý, lâm sàng cơng bố trên các tạp chí khoa học, các hội nghị về-cây thuốc trong và ngồi nước
Cĩ mối quan hệ họ hàng gần gũi về mặt thực vật với những cây thuốc đã được biết là
cĩ tác đụng sinh học, được lý lâm sàng theo hướng đang thử nghiệm (nghiên cứu dựa trên Hố phân loại học - chemotaxonomy) hoặc với những cây thuốc được sử dụng
nhiều trong dân gian để điều trị các bệnh nĩi trên Đặc biệt chú ý tới các cây chưa hoặc
ft được nghiên cứu và những lồi đặc hữu (cndemic plants) của Việt nam hay Đơng dương
Từ các dữ liệu thu thập từ 3 nguồn trên, lập nên một Đanh sách các cây thuốc cĩ nhiều
triển vọng cho nghiên cứu Từ danh sách này, chọn ra những cây thuốc cĩ tần suất sử
dụng cao trong dân gian, được sử dụng bởi nhiều dân tộc, nhiễu vùng địa lý khác nhau, cĩ hoạt tính cao trong các thử nghiệm sinh học và dược lý lâm sàng và cĩ thể thu thập
mẫu cho nghiên cứu để lập nên Danh sách các mẫu nghiên cứu ,
Các cây thuốc trong Danh sách mẫu nghiên cứu được tổng quan về các mặt : Thực vật, hĩa học, được lý, cơng dụng và kinh nghiệm sử dụng làm định hướng cho nghiên cứu phịng thí nghiệm
2 CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU
2.1 Thu hái dược liệu
Phần lớn các dược liệu được thu hái tại thực địa Khi cĩ thể, mẫu vật được thu thập riêng từ tất cả các bộ phận chính của cây (1á, thân, vỏ thân, gỗ, rễ, vỏ rễ, lõi rễ, hoa, * quả, hạt) đặc biệt chú ý tới bộ phận được sử dụng làm thuốc theo kinh nghiệm dân
gian Một số dược liệu được thu mua tại các cửa hàng dược liệu
Trang 10+ Rhadn tl “Phuong phdp nghien clit 6 2.2 Xử lý dược liệu Mẫu vật được xử lý, phơi sấy theo quy trình chung để đảm bảo chất lượng của dược liệu
Cây thuốc sau khi thu hái được giũ hay rửa sạch đất cát, loại bỏ những phần hư héo hay những cây cỏ khác lẫn vào Tách riêng mẫu theo bộ phận dùng, phơi trong điều kiện nắng bình thường, sau đĩ được sấy trong tủ sấy ở 60-70°C cho đến khơ Nguyên liệu
khi đã khơ xay thành bột bằng máy xay hoặc tần bằng thuyền tán, Bột dược liệu được
rây bột qua rây cĩ lỗ 0,5mm, để đầm bảo các mẫu được liệu đồng nhất về kích cỡ Bột
dược liệu được giữ trong lọ kín cĩ đán nhãn để tên nguyên liệu, ngày hái, nơi hái và
lượng mẫu
3 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HĨA THỰC VẬT CÁC MẪU
Phân tích sơ bộ thành phần hĩa học của các dược liệu đuợc thực hiện theo quy trình
phân tích của Trường Đại học Dược khoa Roumani Các định tính xác nhận từng nhĩm
hoạt chất được thực hiện bằng cách chiết riêng biệt theo nhĩm hoạt chất và định tính bằng các thuốc thử đặc hiệu
4 CHUẨN BỊ CÁC CAO CHIẾT CHO THỬ SINH HỌC
4.1 Xác định độ ẩm
Dược liệu trước khi chiết được xác định độ ẩm để tính tốn hàm lượng cao chiết được
trên lượng dược liệu khơ tuyệt đối
Dụng cụ : Cân xác định độ ẩm Moisture Balance EB-340 MOC (Shimadzu) Kết quả tính trung bình trên 3 lân đo
4.2 Cao methanol cho thử nghiệm sinh học
Cân chính xác 5g dược liệu, sau khi ngâm dược liệu qua đêm với 40 ml methanol, hỗn hợp được để trong bể siêu âm ở nhiệt độ 40°C trong 12 phút Gạn lấy dịch chiết, Bã
dược liệu được chiết trong bể siêu âm ở nhiệt độ 402C trong 12 phút thêm 3 lần nữa, mỗi lần với 30 ml methanol Gộp chung dịch chiết, Lọc qua giấy lọc Cơ địch lọc trên bếp cách thủy đến cao khơ Cân xác định khối lượng cao tồn phần và tính tỉ lệ % lượng cao methanol chiết được
* -Bảo quần cao trong chai thủy tỉnh nhỏ, cĩ nắp đậy và để trong các bình hút ẩm Cao này được sử dụng để thử sinh học
4.3 Chuẩn bị cao nước cho thử nghiệm sinh học
Tiến hành các giai đoạn chiết tương tự như cao methanol nhưng thay methanol bằng
Trang 11TH Il - Phuong phdp nghien citt 3
Quy trình chung để chiết các cao thử nghiệm được trình bày ở hình 1
NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT (10g)
Đung mơi, ngâm qua đêm
Siêu âm ở 409/15 phút - Loc | E— DỊCH CHIẾT BÃ DƯỢC LIỆU Dung mơi
[| Siên Âm & 409/15 nhất - Ï.nec
— DỊCH CHIẾT BÃ DƯỢC LIỆU Dung mơi [TT | Siêu âm 8 407/15 phút - Lọc F—| DICH CHIET BA DUGC LIEU * Loại Dung mơi/cách thuỷ CAO CHIẾT
Hình 1 : Sơ đồ chung chiết các cao thử sinh học
5 THỬ ĐỘC TÍNH CÁC CAO CHIẾT TRÊN MƠ HÌNH THỬ NGHIỆM
Các thử nghiệm sinh hoc in vitro được thực hiện theo các tài liệu đã cơng bố (Thử nghiệm brine shrimp, thử nghiệm trên ấu trùng muỗi, thử nghiệm chống phân bào trên mơ phân sinh rễ hành) Những thử nghiệm mới (Thử độc tính trên tầm, thử độc tính trên trùn chỉ, thử tác động gây chán ăn trên tầm) được thăm dị điều kiện thử nghiệm theo
nguyên tắc thử nghiệm chung của các mơ hình thử nghiệm tương cận đã được chấp
nhận
5.1 Thử độc tính trên mơ hình brine shrimp
5.1.1 Nguyên tắc
Xác định độc tính của các cao chiết được liệu trên ấu trùng Brine shrimp, một lồi giáp
xác sống trong nước biển cĩ tên khoa học là Arfemia salina Leach
Hầu hết các chất cĩ hoạt tính sinh học đều cĩ độc tính ở liều cao Vì thế, một thử
nghiệm xác định độc tính của các chất trên các động vật bậc thấp cĩ thể được sử dụng
Trang 12‘Bhan i Phuong phdp nghien ctu 8
dụng sinh học Thử nghiệm trén brine shrimp (Artemia salina Leach) 14 một trong
những thử nghiệm như vậy
Brine shrimp đã từng được sử dụng trong nhiều thử nghiệm sinh học khác nhau như để
xác định dư lượng các chất diệt cơn trùng, các chất độc từ nấm, ơ nhiễm mơi trường,
thử nghiệm các thuốc tê, các chất gây ung thư v.v Năm 1982, McLaughin và các cộng sự đã triển khai thử nghiệm này cho việc nghiên cứu sàng lọc ban đầu các chất chống ung thư trước khi thử nghiệm trên các dịng tế bào ung thư, cũng như cho việc định
hướng chiết xuất phân lập các hoạt chất chống ung thư trong cây cỏ
Các nghiên cứu thực hiện tại của nhĩm McLaughin tại Đại học Purdue (Mỹ) và của nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới đã cho thấy giữa độc tính của cây thuốc trên Brine shrimp và tác dụng trên các dịng tế bào ung thư cĩ mối tương quan thuận chiểu Đa số các chất cĩ tác dụng trên tế bào ung thư đều cĩ tác dụng trên brine shrimp Nhiều chất cĩ tác dụng trên các thử nghiệm chống tế bào ung thu in vivo da được phân lập nhờ định hướng của thử nghiệm brine shrimp Các tác giả đã để nghị sử dụng mơ hình thử nghiệm này như một thử nghiệm sàng lọc sơ bộ các chất cĩ hoạt tính sinh học từ các
dịch chiết sinh học và đùng như một thử nghiệm để định hướng trong việc chiết xuất và
phân lập các hoạt chất cĩ tác dụng trong nguyên liệu thử nghiệm
De đơn giản, khơng địi hỏi trang bị đắt tiền và điểu kiện vơ trùng như nuơi cấy tế bào; thời gian thử nghiệm ngắn (24 giờ) nên hiện nay thử nghiệm brine shrimp được sử dụng rất phổ biến, như những cơng việc hàng ngày tại các phịng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên
5.1.2 Dụng cụ và hĩa chất thử
Tring Brine shrimp (Artemia salina Leach)
Trứng bào xác Artemia Vĩnh Châu (Artemia cystis) do khoa Sinh, Đại học Cần Tho sản
xuất Loại hộp thiếc 200g trứng, tiêu chuẩn chất lượng :
e Kích thước trứng : 230 + 2.5m
© Số lượng trứng : 398000/gram
e Độ ẩm :3.5-4%
« Tỷ lệ nở: Sau 24h ở 26 °C : 78% (310000 ấu trùng/g) Sau 48h ở 26 °C : 84% (335000 ấu irùng/g) « Hàm lượng acid béo khơng no (HUFA) 17mg/gram DMSO (dimethyl sulfoxid) : Prolabo, loại tỉnh khiết phân tích Muối biển nhân tạo : Marinemix, Singapore
Hộp ap tritng brine shrimp :
Trang 13Phan ll -Rhuong phdo nghien atu 9
tránh ánh sáng
Khay thử :
Khay thử Cooke microtiter 96 lỗ, cĩ nắp đậy Mỗi lỗ (giếng thử) cĩ thể tích là 0,3mI
Nguyên liệu thi :
Cao dược liệu để thử nghiệm (cao methanol và cao nước, theo quy trình chiết ở mục II- 4.2 và II-4.3) Các dụng cụ khác : Ống mao quản cĩ khắc vạch tương ứng với thể tích 0,02ml, syring, microburrete 5ml, pipette 1ml, 10ml, bình định mức, kính lúp, đèn soi v.v 5.1.3 Phương pháp thử
Cao chiết methanol và cao chiết nước của được liệu được thử nghiệm ở các néng độ ban đầu là 1mg/ml; 0.1 mg/ml và 0.01mg/ml trong các giếng nhỏ của khay thử 96 lỗ Cooke Microtiter Mỗi giếng thử chứa 0.29ml dung dịch thử pha trong dung dịch nước biển nhân tạo và 10 ấu trùng Ariemia salina Mỗi nơng độ được thử trên 3 giếng với tổng số 30 ấu trùng Đếm số lượng ấu trùng chết sau 6, 12 và 24 giờ Những số liệu này
được sử dụng để đánh giá hoạt tính của dược liệu
Kết quả được đánh giá dựa trên số trung bình Brine Shrimp chết ở mỗi nơng độ: - Khơng cĩ tác dụng nếu khơng cĩ con ấu trùng nào chết (-)
- Cĩ tác dụng nếu cĩ từ 1-5 ấu trùng chết (+) - Cĩ tác dụng mạnh nếu cĩ từ 6-10 con chết (++) 5.2 Thử độc tính trên ấu trùng muỗi
8.2.1 Sinh lý của muỗi - Phương pháp nuơi muỗi và ấu trùng để thử
nghiệm
5.2.1.1 Sinh lý của muỗi
Muốỗi là lồi cơn trùng rất được quan tâm trong y tế cộng đồng Là một nhĩm phổ biến gồm 3.000 lồi phân tán khắp nơi trên thế giới Muỗi hút máu người và truyền các tác
nhân gây bệnh nguy hiểm cho người như : sốt rét, sốt vàng, sốt xuất huyết, bệnh giun
chỉ Bancroft, viêm não
Muỗi thuộc họ Culicidae, bộ Diptera, là loại cơn trùng nhỏ, chân dài, cĩ 2 cánh Chu kỳ sinh sống của muỗi gơm 4 giai đoạn : trứng, ấu trùng, nhộng và muỗi trưởng thành Ba giai doan đâu sống trong nước, con trưởng thành năng động, bay được và sống nhờ hút
Trang 14han It “Rhuong pháp nghien clu 10
Giai đoạn trứng
Trứng khi mới để ra cĩ mầu trăng, sau 1 - 2 giờ thì sẵm lại
Trứng mới đẻ cần nước hay độ ẩm đây đủ, nhưng sau 48 giờ, nếu điều kiện khơ thì trứng vẫn cĩ thể tổn tại một thời gian lâu, chờ khi cĩ nước sẽ nở cho ấu trùng Trứng của một vài loại muỗi cĩ khả năng tổn tại 3 - 4 năm trong điều kiện khơ, Bình thường trứng sẽ nở sau 2 - 3 ngày
Ấu trùng
Au tring của tất cả các lồi muỗi đều sống trong nước : ao hỗ, đầm lầy ẩm ướt hay các
vũng nước đọng trong rừng, hốc cây, hõm đá hay những vật chứa nước dùng trong
nhà nhưng chúng khơng sống được trong các mơi trường cĩ nước chảy mạnh như: suối, thác, hê, cạnh thác và nước biển Thời gian ấu trùng kéo đài 4 - 10 ngày gồm cĩ 4 giai đoạn lột xác để phát triển, thời gian từng giai đoạn thay đổi tùy theo yếu tố mơi trường
đặc biệt là nhiệt độ, ở lần lột xác thứ 4 thì ấu trùng thành nhộng Nhộng
Rất năng động và sống dưới nước Nhộng khơng cân ăn, chỉ nổi lên mặt nước để thở Hình đạng nhộng khác hẳn ấu trùng Đầu và ngực phình to được bọc trong một bao, mặt
trên cĩ một cặp ống thở Phẫn bụng cĩ 8 đốt năng động và một cặp vậy chèo ở phía cuối
Giai đoạn nhộng kéo dài từ một ngày đến vài tuần tùy điều kiện Cuối giai đoạn, ở
nhộng nứt ra cho muỗi trưởng thành
Muỗi trưởng thành
Muỗi trưởng thành nhỏ, phần bụng mang một đơi cánh hẹp và 3 đơi chân đài mỏng
mảnh, đầu dài thay đổi từ 1.6 - 12.5 mm Cấu tạo cơ thể gồm 3 phần: đầu , ngực, bụng Đầu trịn gồm một cặp mắt kép, 1 đơi râu, 1 đơi xúc biện và vịi Râu dài, mỏng, gồm
15 đốt cĩ thể thấy được, những đốt cuối mang lơng ngắn, thưa (con cái), day ram rap
(con đực) Râu cĩ nhiệm vụ xúc giác, xúc biện gồm 5 đốt
5.2.1.2 Muỗi Aedes
Cịn gọi là muỗi đốm, muỗi vẫn, muỗi cĩ tầm vĩc nhỏ, màu sậm, cĩ những đốt trắng
bạc trên thân và trên chân Bụng muỗi cĩ những băng ngang màu trắng Xúc biện hàm
đài hơn vịi ở con đực và ngắn hơn ở con cái Muỗi đậu với tư thế song song chỗ đậu
Aedes gồm hơn 500 lồi phân bố khắp nơi từ miễn cực đến những vùng nhiệt đới Để trứng đơn độc trên đất ẩm, trong hốc cây hay những vật chứa nước khác, trong trứng đã cĩ phơi Trứng tổn tại một thời gian dài trong điều kiện khơ ráo
Trang 15Bhan Phuong phdp nghien atu i
trong vịng khoảng 5 - 7 ngày với nhiệt độ của nước là 25 - 30°C Nước lạnh dudi 10°C
sẽ làm chết ấu trùng, cũng như nhiệt độ càng nĩng thì tỉ lệ chết của ấu trùng càng cao
Nhiệt độ của nước là 32°C sẽ ức chế sự phát triển và nếu hơn 36oC thì ấu trùng bị tiêu diệt Ấu trùng Aedes øegypii ưa nước sạch, nhưng chúng vẫn cĩ thể tổn tại được trong
các mơi trường hơi acid, hơi kiểm hoặc hơi mặn Đa số ấu trùng bị chết trong điều kiện khơ cạn, chỉ cĩ một số rất ít ẩn trong lá cây ẩm ướt thì tổn tại
Giai đoan nhộng hồn tất trong 1 - 5 ngày với nhiệt độ của nước là 27 - 32°C, trung bình nhộng đực cân 44 giờ, nhộng cái cần 60 giờ để phát triển, Nhộng cĩ thể tổn tại 24 giờ trên giấy thấm ẩm và chỉ nở thành muỗi khi gặp nước Nhộng thành muỗi bằng một đường nứt trên lưng, sau 15 phút, muỗi ra khỏi thân nhộng và nằm yên trên xác nhộng
khoảng 1 giờ mới bay được Ở nhiệt độ mơi trường 6°C, muỗi sẽ bị giết chết trong 24 giờ, 7 - 9°C, muỗi cĩ thể tổn tại lâu hơn
5.2.1.3- Phương pháp nuơi muỗi và ấu trùng Aedes aegypti
Muỗi Aedes aegypti được nuơi trong lổng lưới kín, lưới 1mm, cĩ cửa bằng vải lưới được cột kỹ Muỗi đực được nuơi bằng nước đường (dùng bơng gồn tẩm nước đường, đặt vào đĩa petri trong lổng) Cho muỗi cái hút máu từ chuột bạch bằng cách cho hút máu trên
thân hay trên đuơi chuột
Muỗi cái đẻ trứng trên tờ giấy thấm ẩm quấn quanh mặt trong của bocal chứa nước
Sau khi tờ giấy đầy trứng, lấy ra để khơ và cĩ thể giữ được trứng như vậy trong thời -
gian dài Nếu số lượng muỗi ít, cĩ thể cho muỗi đẻ trên tờ giấy thấm cắt trịn, đặt trên bơng thấm nước trong đĩa petri
Đặt giấy thấm cĩ trứng vào đĩa hay bocal nước để nở thành ấu trùng Khi loạt ấu trùng đầu tiên được nở, lấy giấy ra cho vào đĩa khác để nở tiếp đợt 2
Nuơi ấu trùng tốt nhất bằng nước mưa, cĩ thể dùng nước máy để bay hết chlor khoảng 1 - 2 ngày Thức ăn cho ấu trùng là loại thức ăn đành cho súc vật thí nghiệm, ngâm bánh thức ăn trong nước cho mềm rồi thả vào đĩa
Au tring Aedes aegypti ưa nước sạch, nên trong qúa trình nuơi cần thay nước thường ˆ xuyên Nước đục do chất thải của ấu trùng và thức ăn cĩ thể lên men để đĩng thành
một lớp màng phía trên ngăn cẩn khơng khí Thay nước bằng cách hút ấu trùng (dùng
ống đếm giọf) sang 1 đĩa mới cĩ sẵn nước và thức ăn
Ấu trùng thử nghiệm đủ tiêu chuẩn nhất là ấu trùng giai đoạn lột xác thứ 3 (vào khỏang
ngày thư 5) Đây là giai đoạn ấu trùng trưởng thành nhất và tính để kháng cũng cao
hơn so với các giai đoạn trước
Nhộng để riêng trong một chén nước sạch và cho vào léng Mudi lần lượt được nở ra
trong vịng 1 đến 2 ngày
Culex :
Trang 16Phan ll _ lubMg pháp nghi2n clu 12
5.2.2 Dụng cụ và hĩa chất thí nghiệm
Dụng cụ và vật liệu thủ nghiệm
Au tring mudi Culex va Aedes (Culicidae) giai đoạn lột xác thứ 3
Hộp petri, ống đếm giọt
Bocal nuơi ấu trùng
Burette và một số dụng cụ thơng thường của phịng thí nghiệm Cao được liệu: cao nước và cao methanol
DMSO
Diéu kién
Trước khi thí nghiệm, ấu trùng được chuyển sang nước cất để loại bổ ảnh hưởng của thức ăn, tạp chất và một số sản phẩm hữu cơ trong nước đến kết qủa thí nghiệm Thực hiện trong phịng thí nghiệm nhiệt độ thường
Tiến hành đối chiếu với mẫu chứng trong cùng điều kiện của mẫu thử
Tiến hành
Dung dịch thử được pha trhành những nồng độ 1mg/ml; 0,1 mg/ml và 0,01 mg/ml Đối với cao chiết methanol pha trong DMSO rỗi tiếp tục hịa tan nước cất, hàm lượng DMSO khơng quá 0,5%
8.2.3 Nguyên tắc thử nghiệm và cách tính kết qủa
Nguyên tắc :
Xác định tỉ lệ tử vong của ấu trùng thí nghiệm trong dung địch cao thử ở các nỗng độ
khác nhau Từ đĩ sơ bộ đánh gía độc tính đối với ấu trùng và tác dụng sinh học của được liệu
Cho 20 mi dung dịch thử vào đĩa petri thêm vào mỗi hộp petri mỗi hộp 10 ấu trùng Thực:hiện những mẫu chứng song song với thử nghiệm trong những điều kiện tương tự nhưng thay dung dịch thử bằng dung mơi dùng để pha dung dịch thử Đếm số ấu trùng
chết sau 6, 12, 24 giờ
Cao nước và cao methanol của được liệu được thử ở nơng độ 1; 0.5 và 0.1 mg/ml Mỗi dung dịch thử được thực hiện trên 3 hộp petri với tổng số 30 ấu trùng
Tính tốn kết qủa
xác định % ấu trùng chết trong thử nghiệm ở mỗi nồng độ thử Nếu mẫu chứng cĩ số
ấu trùng chết từ 5 - 20% thì kết qủa sẽ được điều chỉnh theo cơng thức Abbott :
Tổng số chết trong lơ thử - Tổng số chết trong lơ chứng
Tỉ lệ chết = x 100 ?
Trang 17Bhan ll Phuong phd nghién atu 13
5.3 Độc tính trên trùn chỉ
5.3.1 Nguyên tắc chung
Thơng thường, để khảo sát các thuốc cĩ tác dụng trên giun sán, cĩ hai mơ hình thực
nghiệm :
1 Mơ hình tiếp xúc : là một mơ hình thử nghiệm đơn giản bằng cách cho giun thử
nghiệm tiếp xúc trực tiếp chất cần thử trong điểu kiện sống bình thường của giun Xác định độc tính của thuốc (gây chết, làm tê liệt v ) với giun ;
2 Thử nghiệm 3 mite d6 té bao : Nghién giun sdn để được hỗn dịch tế bào Những tế
bào này sẽ được tiếp xúc với thuốc và đánh giá tác đụng bằng máy Warburg
Tuỳ theo loại giun cần thử nghiệm mà điều kiện-thí nghiệm cĩ thể được thay đổi cho phù hợp Những mơ hình thử nghiệm như vậy phản ánh đúng tác dụng của thuốc trên
loại ký sinh trùng muốn tiêu diệt Tuy nhiên để thử nghiệm với một lượng lớn các mẫu
chưa biết rõ tác dụng, phục vụ cho việc sàng lọc các cây thuốc thì nhửng mơ hình như vậy tổ ra khơng thích hợp vì việc nuơi các ký sinh trùng gây bệnh trên động vật địi hỏi
những điều kiện đặc biệt về mơi trường đinh đưỡng và nhiệt độ để duy trì sự sống của
ký sinh trùng Vì thế việc tìm ra một mơ hình thử nghiệm đơn giản hơn, dễ thực hiện và
cĩ thể tiến hành hàng loạt trong phịng thí nghiệm mà vẫn cĩ mối liên hệ với tác dụng
trị giun là một điều cần thiết
Đã cĩ những cơng trình nghiên cứu sử dụng các lồi giun đất cho những thử nghiệm
ban đầu này Tuy nhiên việc sử dụng giun đất để thử nghiệm vẫn cịn nhiễu trở ngại
trong điều kiện phịng thí nghiệm Qua tìm hiểu, chúng tơi đã khảo sát việc sử dụng một loại giun trịn nhỏ sống trong nước thường được gọi là “trùn chỉ” cĩ tên khoa học là Limnodrilus hofaoisiery đỂ phục vụ cho thử nghiệm
Trùn chỉ là lồi giun trịn nhỏ màu đỏ nâu, sống trên bể mặt lớp bùn của các dịng
sơng, kênh rạch cĩ dịng nước chảy, khơng sống được ở những nơi ao tù, nước đọng
Chúng bám vào bể mặt lớp bùn hoặc tụ với nhau thành đám Thức ăn là đất bùn cĩ lẫn réu va 14 muc
Kết quả khảo sát (xem phần II-5.3.3 và II-5) cho thấy đây là một mơ hình cĩ đáp ứng
tốt với các hĩa chất điểu trị gìun, cĩ mối tương quan giữa tác dụng và nỗng độ hố chất
sử dụng, thích hợp cho việc sàng lọc các cao chiết từ được liệu
Ưu điểm của việc sử dụng trùn chỉ là :
- Kích thước nhỏ (đường kính thân từ 0,1 - 0,5 mm, chiêu đài con trưởng thành từ 3 - 6cm) nên thuận tiện cho việc thử trong hộp petri với một lượng lớn mẫu thử và sinh vật thử (10 con hay nhiều hơn), đễ dàng cho việc tính tốn thống kê
- Sống trong nước nên rất thuận tiện cho việc thử nghiệm với mơ hình thử tiếp xúc
- Kích thước trùn nhỏ nên thể tích đung dịch thử nhỏ, ít tốn hoạt chất
Trang 18Phan i Phuong phap nghien atu 14
động về sinh vật thử nghiệm Hơn nữa, rất dễ dàng mua được trùn chỉ tại các cơ sé mua
bán cá cảnh
5.3.2 Dụng cụ và phương tiện và vật liệu thử
—_ Trùn chỉ được mua tại các cơ sở nuơi cá cảnh tại Tp HCM Chọn lơ trùn mới được vớt từ đưới sơng Trùn mua về được nuơi trong nước sạch cĩ địng nước động thường xuyên Trùn chỉ sau khi đã được nuơi ổn định và khỏe mạnh trong vịng từ 2 tuần được dùng cho thử nghiệm
— Mebendazol : Viên nén chứa 500mg mebendazol — Vinacor : Viên nén chứa 150mg levamisol
—_ Dung dịch thử là các cao chiết dược liệu được c pha và dùng ngay hoặc bảo quản
trong tủ lạnh trong vịng 12 giờ
- DMSO : Prolabo loại tinh khiết phân tích
—_ Các dụng cụ khác : đĩa petri cĩ nắp đậy, pipet, bình định mtfc 50, 100 ml v.v 8.3.3 Phương pháp thử
Khảo sát sự đáp ứng của mơ hình thử nghiệm
Để khảo sát sự đáp ứng của trùn chỉ với chất thử nghiệm và khả năng tương thích với các thử nghiệm trên các lồi giun ký sinh trên người, thử nghiệm được tiến hành với hai
hoạt chất trị giun thơng thường là mebendazoli và levamisol
Mebendazol được chiết bằng methanol trên bếp cách thủy trong vịng 15' ở 40°C lọc
và điều chỉnh thể tích dung dịch bằng methanol để cĩ nơng độ 10mg/ml Lấy chính xác 10ml dung dịch này vào chén sứ và cơ trên bếp cách thủy đến khơ Thêm vào cắn 0,5ml DMSO để giúp hồ tan và sau đĩ là 70 mÌ nước cất Cho dung địch vào bình định
mức 100ml, tráng chén sứ bằng nước cất và cho địch tráng vào bình định mức, bổ sung
nước cho đủ 100ml Dung dịch thu được cĩ nồng độ 1mg/ml Lấy dung dich này pha lỗng thành dung địch cĩ các nồng độ : 0,1mg/ml; 0,01mg/ml và 0,001mg/mI
Dung dịch levamisol được chuẩn bị tương tự như dung dịch mebendazol
Cả hai loại thuốc này được thử trên trùn chỉ so sánh với dung dịch chứng là nước cĩ
nỗng độ DMSO tương tự như dung dịch thử
Kết quả Xem phần II- 5) cho thấy trùn chỉ cĩ đáp ứng với hai loại thuốc trên, vì thế
nĩ được sử đụng để sàng lọc các hoạt chất trong được liệu Thử tác dụng của các cao chiết trên trùn chỉ
Chuẩn bị dung dịch thử
Trang 19‘Rhian Nt -Rhuong phdp nghien atu 15
pha lỗng 10 lần để được dung dịch 0,1mg/ml Dung dich 0,lmg/ml duoc pha lỗng thêm 10 lần để cĩ dung dịch 0,01mg/ml
Cao nước
Dung dịch thử từ cao chiết dược liệu được pha tương tự như cao methanol nhưng khơng cho têm DMSO
Dung dịch đối chứng
Với mẫu thử là cao methanol thì dung dịch đối chứng là nước cất cĩ chứa 0.5% DMSO Với mẫu thử là cao nước thì mẫu chứng là nước cất
Các cao chiết được thử ở 3 nồng độ lmg/mi; 0.img/ml và 0.01mg/ml trong các đĩa
petri Mỗi đĩa thử chứa 30ml dung dịch thử (cao chiết methanol, cao chiết nước và mẫu
trắng chỉ gồm dung mơi, khơng cĩ cao chiết) và 10 trùn chỉ
Mỗi nỗng độ được thử trên 3 đĩa petri với tổng số 30 con trùn chỉ Chọn những con trùn
trung bình, kích thước đều nhau, khoẻ mạnh, khơng bị đứt, khơng cĩ phần thân mới tái
sinh, đùng giấy thấm gạt nhẹ những giọt nước bám theo Thả trùn vào các đĩa petri cĩ chứa dịch thử Đậy hờ nắp, để yên nơi mát
Thử nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ phịng Các đĩa petri được đặt ở nơi mát, thống khí, khơng bị ánh nắng trực tiếp
Đánh gía kết quả
Đếm số lượng ấu trùng chết sau 6, 12 và 24 giờ Những số liệu này được sử dụng để
đánh giá hoạt tính của dược liệu Màu sắc và hình dạng của trùn bị chết cũng được ghi nhận
Kết quả % trùn chỉ chết ở mỗi nộng độ thử nghiệm được tính tốn từ số lượng trùn chỉ chết trong mẫu thử và mẫu trắng theo cơng thức Abbott :
Tổng số chết trong lơ thử - Tổng số chết trong lơ chứng % Chết = x100 Số cịn sống trong lơ chứng Các được liệu được xem là cĩ tác dụng mạnh tai néng độ thử nghiệm khi trên 60% trùn chỉ bị chết sau 24 giờ 5.4 Thử độc tính và tác dụng gây chán ăn trên tằm 5.4.1 Đại cương
Cũng như các mơ hình thử nghiệm trên Ar/eria salina; ấu trùng muỗi; giun trịn, một số
Trang 20Rhdn Ul -Rhuong phdp nghién atu 16
thực vật cĩ tác dụng trên các lồi cơn trùng truyền bệnh hoặc cơn trùng gây hại trong
nơng nghiệp Trong để tài này chúng tơi thử tác dụng của các cao thuốc trên tăm với 2
hướng :
- Thử nghiệm độc tính của các cao thuốc trên tim như các mơ hình thử nghiệm trên
Artemia salina, trên trùn chỉ và trên ấu trùng muỗi Thử nghiệm loại này chưa thấy
được sử đụng trong các mơ hình thử nghiệm của các tấc giả trước đây - Thử nghiệm tác dụng gây chán ăn (antifeedant) của các cao thuốc trên tầm
Thứ nghiệm tác dung gây chán ăn của các chất đã được nhiều tác giả trên thế giới thực hiện Các tác giả Yasuhifo Kojima và Natsuki Kato (1981) đã thử nghiệm hoạt tính gây
chán ăn trên ấu tring Spodoptera litura F Blaney và cộng sự (1988) đã thử nghiệm khả năng gây chán ăn của chất excelsin (phân lập từ cây Ailanthus excelsa) trên Spilosoma obliqua (lồi sâu hại phát triển trên cây thâu đầu) Các tác giả Steven V Ley; James
C Anderson (1989) đã thử nghiệm khả năng ức chế tăng trưởng và gây chán ăn của chất azadirachtin và vài đmonoid (được phân lập từ cây Azadirachta indica) trên các ấu
trùng Spodoptera litoralis và Spodoptera frugiperda Kubo và cs ở Đại học California thì dé nghị sử dụng các lồi Pectinophora gossipiella (Sauder) (một lồi sâu hại bơng ở
nhiều vùng củ nước Mỹ) và Heliothis virescens (Fabr.) (lồi sâu hại trên nhiều loại cây trồng như bơng, thuốc lá, cà chua, đậu v.v ) cho các thử nghiệm antifeedant Các loại
sâu khác cũng được sử dụng trong thử nghiệm antifeedant là : Epilachna varivests, Spodoptera exempta, Eldana saccharina, Heliothis zea, Spodoptera eridania, Tribolium castaneum (ấu trùng của một lồi sâu lúa) và Siophylus zeamais Người ta cũng sử
dụng Epilachna varivestis - lồi bọ cánh cứng Mexico hay ấu trùng lồi đế Locusia migratoria lam sinh vat thi nghiém
Theo Kubo, khéng cĩ giới hạn trong việc chọn loại cơn trùng thử nghiệm Tuy nhiên,
cĩ 3 yếu tố cần được quan tâm khi chọn là : (1) Cĩ ý nghĩa về mặt kinh tế - kết qủa
khảo sát cĩ thể sử dụng vào thực tế; (2) Dễ thu thập trứng hoặc nuơi giữ cơn trùng - nguồn sinh vật thử cĩ sấn và ổn định, việc nuơi cơn trùng trong phịng thí nghiệm qua
nhiều thế hệ cĩ thể dẫn tới những thay đổi về mặt di truyển; và (3) Nhạy cảm với nhiều loại hố chất Một điều cũng khơng kém quan trọng trong việc chọn cơn trùng là
chúng khơng mang vào phịng thí nghiệm bệnh truyền nhiễm và các ký sinh trùng gây
bệnh
Tất cả các tác giả trên đều khơng ding tim Bombyx mori (L.) lam cén tring thiv nghiém Tuy nhién, theo Kubo, tim cĩ thể được đùng để nghiên cứu các chất khác như
chất dẫn dụ sinh học hoặc chất kích thích ăn ở cơn trùng
* Trong đề tài nghiên cứu này chúng tơi khảo sát việc sử dụng tầm cho việc thử độc tính
và khả năng gây chán ăn của các cao chiết dựa trên những ưu điểm sau : - Tầm là lồi cơn trùng đã được thuần hĩa, khơng gây hại cho người
- Sinh vật thử nghiệm rất ổn định về mặt sinh học : giống tầm, quy trình nuơi dưỡng, tuổi tầm
Trang 21Phan Phuong pha nghien atu 17
nghiệm cùng một lúc nhiễu mẫu thử 8.4.2 Giới thiệu Tằm Bombyx mori L Đặc điểm chung của tằm
Tầm là loại cơn trùng được nuơi để lấy tơ - vịng đời của tầm từ 6-8 tuần lễ, tùy theo điều kiện khí hậu từng vùng nuơi và từng giống tầm lai khác nhau
Mọi giống tầm đều trải qua bốn giai đoạn biến thái rõ rệt gọi là vịng đời của tầm: Trứng tăm -> tăm => nhộng => ngài => trứng tầm
Mỗi giai đoạn biến thái, tầm cĩ thời gian sống và đặc điểm hình thái khác nhau
Đặc điểm sinh học của Tằm
Tim cĩ đạng một con sâu tổn tại trong khoảng từ 22 đến 23 ngày, và được chia làm 5 độ tuổi khác nhau : tuổi 1, 2, 3, 4, 5 Tồn thân con tăm được phủ một lớp kidn mồng, đẻo, cĩ khả năng căng đài ra một cách đáng kể khi tầm lớn nhanh giữa các độ tuổi
Tầm cĩ 6 đốt đầu; 3 đốt ngực và 11 đốt thân
* Ở phân đầu: các đốt thứ 2; 4; 5 mang các phần phụ, biến dạng tuân tự thành: râu, ham trén ham đưới và mơi Hàm trên phát triển rất khỏe
* Ở phân ngực: về phía bụng, mỗi đết mang một cặp chân hình nĩn Mỗi chân cĩ 3 đốt và mang một cái vuốt sắc nhọn ở đốt cuối :
* Ở phần bụng: 3 đốt cuối lẫn vào nhau hình thành đốt thứ 9 Đốt thứ 8, mặt lưng cĩ
mang gai đuơi Phần bụng mang 4 đơi chân
Tầm thể thơng qua 9 đơi lỗ thở nhỏ nằm đọc hai bên hơng ở giữa các đốt
Thức ăn của tằm là lá dâu tầm ( Morus aiba L.) Tăm phát triển rất nhanh từ tuổi này
sang tuổi khác Giữa hai độ tuổi kế nhau là một thời kỳ ngủ và lột xác (Bảng 1)
5.4.3 Thử nghiệm độc tính của cao dược liệu trên tằm Mục đích
Thăm dị độc tính của cao dược liệu ở những nồng độ khác nhau trên tằm, thơng qua các biểu hiện ngộ độc, gây chết
Nguyên tắc
Dùng vợt nhúng tằm thử nghiệm vào các dung dịch cao chiết ở các nổng độ 2mg/mi; 1mg/ml; 0,5mg/ml và 0,01mg/ml Sau đĩ, cho tầm lên một tấm giấy lọc khơ đặt trong
rổ nhựa để theo dõi Kết quả theo đõi được ghi nhận tại các thời điểm 30 phút, 60 phút,
Trang 22‘Bhan Il -Rhuong phdp nghien atu 2
Becher, pipet khắc độ 1ml, pipet chinh x4c 5ml, 10ml; bình định mức 50ml, 100ml,
phếu, chai đựng dịch pha, đũa khuấy
Phương pháp thực hiện
Chuẩn bị dung dịch thử
* Các cao chiết methanol và cao chiết nước của dược liệu được pha trong nước với nồng độ ban đầu là 2mg/ml Đối với các cao methanol khĩ tan trong nước, đùng DMSO
pha trước sau đĩ pha koăng với nước Lượng DMSO sử dụng khơng quá 0,5% trong dịch
thử
* Cao nào cĩ tác dụng gây chết sinh vật thử nghiệm ở nồng độ 2mg/ml, được pha lỗng
tiếp thành các nơng độ 1mg/ml; 0,5mg/ml; 0,1mg/ml; 0,01mg/ml để tiếp tục thử
* Số lượng mẫu thử nghiệm : 108 mẫu cao methanol và 113 mẫu cao nước từ các bộ phận khác nhau của 42 cây thuốc
Chọn phương pháp thử nghiệm
Qua khảo sát nhiều phương pháp gây độc cho tầm bằng các dung địch thử nghiệm, phương pháp nhúng được chọn sử dụng để thử cho tất cả các mẫu thử
Dùng vợt nhúng tầm (với mỗi lơ 10 con tằm) ngập hẳn trong dung địch thử, nhúng vào
10 lần, mỗi lân 5 giây, thời gian nghỉ giữa hai lần nhúng kế tiếp là 5 giây Sau đĩ cho tầm lên tờ giấy lọc khơ đặt trong rổ nhựa Đặt rổ vào đĩa nhựa rồi để lên kệ theo dõi
Đây là phương pháp khả thí nhất trong các phương pháp đã thử vì tỉ lệ tầm chết do chịu -
tác động của thuốc là cao nhất ,
Khảo sát tính đáp ứng của mơ hình thử nghiệm
Tầm được thử với các dung dịch chứng như nước cất và DMSO 0,5%, cùng với ¡ dung mơi dùng để chiết xuất là methanol 50% và 2 chất bảo vệ thực vật thơng dụng là dung địch rotenon và wofatox ở những nơng độ khác nhau để khảo sát tính đáp ứng của tầm
với chất thử, tính phụ thuộc của độc tính vào nồng độ sử dụng của các chất thử Kết quả (xem phần II — 6) cho thấy mơ hình thử nghiệm cĩ đáp ứng tốt với chất thử nghiệm Tầm khơng bị chết trong các dung dịch chứng và khả năng gây độc của rotenon và - wofatox trên tầm phụ thuộc vào nồng độ dung dịch thử
Khảo sát ảnh hướng của tuổi tầm lên mơ hình thử nghiệm
Để chọn tuổi tầm thích hợp nhất sử đụng cho thử nghiệm, tầm ở các độ tuổi 1, 2, 4, 5 được sử đụng để thử trong cùng một điều kiện Kết quả (Phần II - 6) cho thấy tầm tuổi 1 hoặc tuổi 2 cĩ đáp ứng tốt nhất trên mơ hình thử độc tính Trong các thử nghiệm về
sau tằm tuổi 1 (tầm sau khi nở 2 ngày) được sử đụng chính thức cho mơ hình thử
Đánh gía kết quả
Trong thử nghiệm độc tính, kết quả thử nghiệm được ảnh giá theo quy ước như sau :
Trang 23‘Phan ll Phuong phdp nghien atu 20
+ đáp ứng khơng rõ (cĩ biểu hiện ngộ độc: tầm gục đầu; kém linh hoạt hoặc bất động; ĩi dịch mầu vàng lục; hoặc khơng nhưng tất cả đều khơng
chết)
+: Tầm chết với tỷ lệ < 2/10 trong lơ thử
++ : Tầm chết với tỷ lệ từ 3/10 đến 5/10 trong lơ thử +++ : Tầm chết với tỷ lệ từ 6/10 đến 10/10 trong lơ thử
5.4.4 Thử nghiệm tác động gây chán ăn của cao dược liệu trên tằm 5.4.4.1 Mục đích
Khảo sát khả năng gây chán ăn của một số cao được liệu 6 néng độ xác định trên con tầm đối với loại thức ăn bình thường của nĩ
5.4.4.2 Nguyên tắc
Dùng các diện tích lá đâu bằng nhau, cĩ khối lượng xác định, nhúng vào trong dịch pha lỗng của cao được liệu hoặc dịch chứng trong một thời gian nhất định như nhau Sau khi để ráo lá dâu đã nhúng, đồng loạt cho lượng tằm như nhau ăn Sau một thời gian
theo dõi, khi thức ăn ở lơ chứng bị giảm khoảng 50%, đồng loạt bắt tầm ra khỏi tất cả các lơ Cân xác định khối lượng lá dâu cịn lại ở các lơ, suy ra lượng lá dâu bị tầm ăn ở từng lơ Trên cơ sở đĩ rút ra kết luận cho mục đích thử nghiệm
5.4.4.3 Vật liệu thử nghiệm
Nguyên liệu thử
Sử dụng 79 mẫu cao methanol, 80 mẫu cao nước và 2 mẫu cao chloroform từ các bộ
phận khác nhau của 35 cây thuốc
Tam
Tầm sử dụng cho thử nghiệm cĩ tiêu chuẩn tương tự như phần thử độc tinh Dung tụ
Trang 24Bhd l| -9lupug pháp nghiếm alt 21
methanol khĩ tan, đùng chất trợ tan DMSO pha trước Lượng DMSO khơng quá 0,5%
trong dịch thử nghiệm
Khảo sát ảnh hưởng của tuổi tằm trên mơ hình thử nghiệm
Khảo sát tăm ở các độ tuổi khác nhau trong cùng một điều kiện cho kết quả là tầm tuổi
5 là thích hợp nhất cho thử nghiệm tính gây chán ăn của các mẫu thử Tằm ở tuổi này
khỏe mạnh và ăn nhiều nên đáp ứng tốt hơn với thử nghiệm Chuẩn bị thức ăn thử nghiệm
Lá dâu tươi mới hái về, sạch sẽ khơng bị sâu, khơng bị ướt được cắt thành những
khoanh trịn đường kính 25mm bằng đổ khoan nút chai Cân và xác định khối lượng cụ
thể cho từng lơ thức ăn trên, với độ chính xác 0,01g
Ở mỗi lơ thử nghiệm cũng như các lơ chứng, sử dụng 15 phiến lá trịn đã cắt ở trên để làm thức ăn cho tầm -
Ngâm từng lơ lá dâu trên trong từng dịch thử 2mg/ml hoặc đung dịch chứng (nước cất hoặc DMSO 0,5%) trong 30 phút Sau đĩ vớt ra và trải trên từng đĩa nhựa riêng biệt cĩ đánh dấu Để táo nước một cách tự nhiên trong phịng thống
Tiến hành thử nghiệm
Khi lá dâu đã ráo nước, đồng loạt cho vào mỗi lơ 5 tăm tuổi 5 được xác định khối lượng trung bình và khơng cho ăn trong thời gian 8 giờ trước khi thử nghiệm Ngồi các lơ thử
, ba mau chứng được tiến hành song song là :
- Chứng nước: lá dâu ngâm nước cất và cho tằm ăn trong cùng điều kiện thử nghiệm - Chứng DMSO 0,5%: ngâm lá dâu trong dung dịch DMSO 0,5% rồi cho tim ăn
- Chứng trắng: là lơ lá đâu ngâm nước cất nhưng khơng cho tằm ăn để xác định độ hụt khối lượng tự nhiên của lá dâu trong điều kiện thử nghiệm
Mỗi loại cao chiết dược liệu và các mẫu chứng tiến hành trong cùng đợt thử nghiệm
được thực hiện 3 lơ trong cùng một điều kiện
Theo dõi cho đến khi lá đâu ở lơ chứng bị nước ăn khoảng 50% thì đẳng loạt bắt tầm ra ở tất cả các lơ Cân khối lượng lá dâu cịn lại trong từng lơ Tính lượng lá dâu tương ứng đã bị con tầm ăn trong mỗi lơ Khối lượng thức ăn bị giảm được tính theo giá trị
trung bình của 3 lơ thử nghiệm của mỗi mẫu thử 5.4.4.5 Đánh giá kết quả
Một cao dược liệu được đánh giá là cĩ khả năng gây chán ăn, nếu chỉ số gây chán ăn
C-T,
C+T,
% > 75% Chỉ số này được xây dựng như sau : k: hệ số giảm khối lượng tự nhiên của lá dâu
Trang 25‘Dhan I -Phuong phap nghién atu 22
C¡: khối lượng lá dâu của lơ trắng ở thời điểm kết thúc thử nghiệm: k= =
9
O
Cọ: là khối lượng thức ăn của lơ chứng nước đã bị ăn C =kCoT—Ct
Toọ.¡: là khối lượng lá dâu của lơ thử trước khi ngâm cao 1
T¡¡: là khối lượng lá đâu của lơ thử cao ¡ ở thời điểm kết thúc thử nghiệm
T¡ : là khối lượng thức ăn của lơ thử cao i đã bị ăn: Ti =kTo4 - Tri
Để tiện theo đõi,trong các bắng kết quả, quy ước:
(+) : Mẫu thử cĩ tính gây chán ăn đối với tầm thử nghiệm trong mơ hình nay (-) : Mau thử khơng cĩ tinh gây chán ăn đối với tầm thử nghiệm trong mơ hình này
(*) : thức ăn hồn tồn khơng bị ăn
(**) : sinh vật ngộ độc và chết 100%
k: hệ số giảm khối lượng tự nhiên của thức ăn C : khối lượng thức ăn ở lơ chứng nước bị ăn
Ti : khối lượng thức ăn ở lơ thử dược Hệu i bi an
M, : khối lượng trung bình của 5 tầm trong các lơ
8.5 Thử tác dụng chống phân bào trên mơ phân sinh rễ hành
Ung thư là một loại bệnh nan y mà y học thế giới cho đến ngày nay tuy đã cĩ nhiều
thành tựu trong điều trị bệnh, nhưng số người mắc bệnh và chết vì bệnh ung thư cịn rất
cao, chiếm tỉ lệ 20% tổng số trường hợp tử vong vì bệnh tật Theo thống kê của WHO, mỗi năm cĩ khoảng 7 triệu người trên thế giới mắc bệnh ung thư và khoảng 5 triệu
người chết vì ung thư Ở Việt Nam ước tính vào khoảng 70.000 — 100.000 người mắc bệnh ung thư hàng năm
Các phác đồ điều trị ung thư hiện nay thường là kết hợp giữa phẫu thuật và hĩa trị liệu hoặc 3a trị và hĩa trị để tăng hiệu quả chống lại tế bào ung thư Các thuốc dùng để
điểu trị ung thư biện tại cĩ hai loại chính :
Các chất độc đối với tế bào : Thuốc ngăn chặn sự sinh trưởng hoặc sự sinh sản của tế bào với nhiều cơ chế khác nhau trong đĩ cĩ ngăn chặn sự phân bào (như các chất
chống phân bào : colchicin, vinblastin, vincristin)
Các thuốc kích thích miễn địch : Kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chống lại các tế bào ung thư
Để nghiên cứu các thuốc trị ung thư bằng cơ chế độc với tế bào, các mơ hình thử
nghiệm tác dụng của thuốc trên các dịng tế bào, các tổ chức của cơ thể sinh vật được sử dụng Một trong những thử nghiệm đơn giản trên sự sinh sản tế bào được sử dụng :
Trang 26Rhan ll Phuong phdp nghién atu 23
trên tế bào mơ phân rễ hành So với những mơ hình thử nghiệm xây dựng sau này, phương pháp này cĩ ưu điểm là rất đơn giản và dễ thực hiện trong các phịng thí
nghiệm mà khơng địi hỏi trang thiết bị, điểu kiện phịng thí nghiệm hay con người được đào tạo đặc biệt
5.5.1 Dai Cuong
Chu trình sinh sản và phát triển của tế bào
Các tế bào sinh dưỡng động vật và thực vật đều trải qua quá trình sinh sản giống nhau để hình thành thế hệ tế bào mới giống hệt tế bào mẹ, đảm bảo thơng tin di truyền được ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác Tế bào ung thư cũng cĩ cùng chu trình sinh sản
như vậy nhưng sinh sản, vơ tổ chức và khơng theo nhu cầu của cơ thể, tạo nên khối tế
bào ung thư chèn ép và xâm lấn các mơ, các tổ chức xung quanh, làm ảnh hưởng đến
các chức năng sinh lý bình thường của các tổ chức này
Quá trình sinh sản của tế bào gồm một chuỗi các sự việc lặp lại được gọi là chu kỳ tế
bào (Hình 2)
(i) Pha Gy
Pha G¡ là pha nghỉ của chu trình tế bào sau khi tế bào thực hiện sự phân chia thành hai
tế bào con ở pha M Thời gian kéo dài của pha này là yếu tố chủ yếu để xác định thời gian của một chu kỳ tế bào Trong suốt pha G¡ khơng cĩ sự tổng hợp ADN, nhưng sự g hợp ARN và protein diễn ra bình thường và sau đĩ tế bào chuyển sang pha S
(ii) Pha S
Pha S là pha tổng hợp ADN được đánh dấu bằng sự gia tăng mức độ tổng hợp ARN Kết quá là sự nhân đơi lượng ADN của tế bào và tạo ra tiền nhiễm sắc thể Tổng hợp ADN e Tiền nguyên phân M Nguyên phân Gy Tién sao chép Go
Trang 27Bhan il “Rhuong phdp nghicn ctu 24
(iii) Pha Go
G2 la một pha nghỉ tiền phân bào xây ra ngay sau pha S Sự tổng hợp ADN đã dừng lại trong khi sự tổng hợp ARN và protein vẫn tiếp tục
(iv) Pha M (nguyean phaan)
La giai đoạn tế bào phân chia thành hai tế bào con Trong suốt quá trình nguyên phân mức độ tổng hợp ARN và protein giảm Nhiễm sắc chất tụ lại thành nhiễm sắc thể và
sợi tiên nhiễm sắc thể tách ra, tế bào phân chia Tế bào thực hiện xong một chu trình tế
bào và lại bước vào pha nghỉ G¡ :
(v) Pha Go
Sau giai đoạn nguyên phân các tế bào cĩ thể bước vào một giai đoạn nghỉ khác gọi là pha Go Pha này thực ra khơng phải là một pha thực sự của chu trình tế bào Ở giai đoạn này, tế bào khơng phân chia, khơng chuyển hĩa tích cực nhưng vẫn cĩ khả năng tăng sinh Các thuốc chống ung thư ít tác động vào giai đoạn này Để cĩ thể tác động lên tế bào ở pha Gọ, các thuốc chống ung thư phải kích thích các tế bào này bước vào giai
đoạn phân chia bằng cách giết một lượng tế bào đang phân chia
Các thuốc cĩ độc tính trên tế bào khác nhau cĩ thể ảnh hưởng lên các pha khác nhau
của vịng tế bào
Giai đoạn nguyên phân (gián phân) - pha M là quá trình tế bào tách ra thành hai tế bào con, pha này được chia thành : tiền kỳ (prophase), biến kỳ (metaphase); tiến kỳ
(anaphase) và hậu kỳ (telophase)
Tién kỳ : nhiễm sắc chất trong nhân đần dần rõ dạng, đầu giai đoạn này cĩ dang chấm nhuyễn mịn đều, sau là chấm sậm hoặc dấu phẩy sợi đài tương ứng với nhiễm sắc thể Mỗi nhiễm sắc thể gồm 2 thành phần gọi là nhiễm sắc tử (chromatid) sát nhau ở vùng đặc biệt gọi là tâm động, vị trí tâm động rõ vào cuối tiền kỳ, nhiễm sắc thể xoắn tương đối xoắn nhiều Nhân cịn đạng trịn, hạch nhân mờ dân, màng nhân biến mất và cĩ sự thành lập thoi vơ sắc
Biến kỳ: các nhiễm sắc thể nằm cùng một mặt phẳng thẳng gĩc với thoi vơ sắc gọi là tấm xích đạo Nhiễm sắc thể ở trạng thái cực xoắn cĩ hình thái đặc trưng nhờ vị trí eo thắt
Tiến kỳ : giai đoạn này bắt đầu lúc tâm động tách đơi Hai nhiễm sắc tử của mỗi nhiễm
sắc thể hồn tồn tách rời hẳn nhau và mỗi nhiễm sắc tử trở thành một nhiễm sắc thể * Các nhiễm sắc thể con trượt trên thoi vơ sắc di chuyển về một trong hai cực mỗi cực cĩ
đúng số nhiễm sắc thể mà tế bào cĩ Sau đĩ thoi vơ sắc biến mất dân
Hậu kỳ : tế bào cĩ 2 bộ nhiễm sắc thể là hai bộ giống nhau, cĩ sự hình thành trở lại
màng nhân bao quanh mỗi bộ nhiễm sắc thể tạo hai tế bào con Hạch nhân rõ đạng dần Màng tế bào mới xuất hiện khoảng giữa tế bào và ngăn tế bào mẹ thành hai tế bào con
Trang 28‘Bhan II - lu pháp mạ hiền atu 25
của tế bào mẹ Tuy nhiên, vì một lý do nào đĩ (như hĩa chất, tia xạ v.v ) cĩ thể xẩy ra
những bất thường trong quá trình phân bào làm cho số lượng nhiễm sắc thể ở tế bào con nhiều hơn hay ít hơn so với tế bào mẹ Khi đĩ sẽ dẫn đến những sai lệch rõ rệt chức năng tế bào so với bình thường, thậm chí cĩ thể dẫn tới làm chết tế bào
Những bất thường xảy ra trong quá trình phân cắt tế bào thực vật và mối liên
quan đến việc tìm ra các chất chống phân bào
Hai bất thường thường gặp trong qúa trình gián phân là : nội gián phân và phân bào
chậm
Nội gián phân
Trong nhiều tế bào, nhất là tế bào đang biệt hĩa, nhiễm sắc chất tăng lên vì một sự phân cắt đặc biệt của nhân Màng nhân vẫn nguyên song nhiễm thể tự chẻ một hay nhiều lân Nhân nội gián phân chứa số nhiễm sắc thể là 4n, ồn,
Sự phân bào chậm
Sự phân bào chậm dẫn đến sự hình thành nhân đa bội bởi một cơ chế đặc biệt mà chủ
yếu là việc khơng hình thành thoi vơ sắc
Sự phân bào chậm được biết lần đầu tiên ở mơ động vật hay thực vật dưới tác động của colchicin Sau đĩ, người ta đã tìm ra những chất khác cĩ khả năng gây bất thường tương
tự như colchicin Chúng được gọi là “chất làm phân bào chậm” hay “chất phá hủy
phân bào”
Dưới tác dụng colchicin, nhiễm sắc thể trong tiến trình phân bào vẫn tái bẩn và hình
thành nhiễm sắc tử Tuy nhiên, do thoi vơ sắc khơng xuất hiện khi bước vào biến kỳ
nên dù cĩ tâm động các nhiễm sắc thể vẫn nằm rải rác khắp tế bào Các nhiễm sắc tử vẫn nằm kể cận cĩ dạng song song từng đơi gọi là giả tiến kỳ Vào giai đoạn cuối,
màng nhân được hình thành bao quanh bộ nhiễm sắc thể đã nhân đơi nên nhân tứ bội
cĩ kích to chiếm gần hết tế bào
Dưới tác dụng của colchicin quá trình này được lặp lại Nhân tứ bội phân chia như trước
đĩ và một nhân bát bội hình thành Người ta cĩ thể quan sát và đếm được l6n nhiễm
sắc thể, nhân này tăng lên thành đa bội và nhân này thường là khơng đều, cĩ thùy hay đạng amib
Ngồi ra cịn cĩ thể quan sát những rối loạn khác : ở tiền kỳ 1 thoi vơ sắc thơ sơ tạo
thành, tế bào cĩ 2 nhân nối nhau bởi cầu nhiễm sắc thể, hay thoi cĩ 3 cực tạo nên tế
bào với 3 nhân khơng đều sau phân chia, hay vách ngăn khơng hình thành giữa các „nhân khác nhau tạo tế bào cĩ 2 nhân đính và tạo các tế bào với 2 nhân hoặc 3 nhân,
Song song với những bất thường phân bào này, người ta quan sát thấy rễ ngắn lại, đầu
rễ phổng to hơn dạng lưỡng bội, là do tế bào lẽ ra phải kéo dài song song với trục rễ lại
phát triển ra mọi hướng như nhau
Tất cả các hiện tượng trên đều cĩ thể phục hổi ngay sau khi ngưng tác động của hoạt
Trang 29‘Phan ll Phuong phap nghien atu 26
Các tác nhân vật lý hay hố học cịn cĩ thể ra gây ra sự thay đổi nhiễm sắc thể như đứt
đoạn ngẫu nhiên, đứt ở điểm cuối hoặc khoảng giữa nhiễm sắc thể, hay gây ra dồn và
dính nhiễm sắc thể do ảnh hưởng đến sự giải trùng hợp ADN làm cản trở sự phân chia
của nhân
Tìm kiếm những chất cĩ tác đụng chống phân bào, người ta cĩ thể hy vọng đến việc sử dụng những chất ức chế phân bào trong việc chống lại bệnh ung thư, bệnh bạch huyết Colchicin, podophylEn, các dẫn chất amin, trimethylen melanin là những chất đã cho kết qủa đáng khích lệ
5.5.2 Thử nghiệm tác dụng chống phân bào của các cao chiết dược liệu
trên mơ phân sinh rễ hành ta Allium ascalonicum L Phương pháp và điều kiện thử nghiệm
Sử dụng mé phan sinh ré hanh ta Allium ascalonicưn L để thử tác dụng của các cao chiết được liệu trên sự phân bào theo phương pháp Deysson Củ hành ta sau khi được chọn lọc cẩn thận cho vào lọ nuơi với dung dịch nuơi dưỡng Knop 1⁄2 trong 24 giờ cho những rễ cĩ chiểu dài thích hợp để thử nghiệm (khoảng 1-1.5 cm) những cao chiết metanol hay nước của các được liệu được thử nghiệm ở các nồng độ : Img/ml, 0 1mg/ml, 0.01mg/ml Mỗi mẫu thử nghiệm đều cĩ mỗi đối chứng song song Mỗi nồng
độ và mỗi thử / nghiệm được thử trên nhiều bụi hành Những củ được chọn là những củ
cho ra nhiều rễ đều nhau và khi quan sát sinh mơ khơng thấy cĩ những tế bào bất bình
thường
Các thử nghiệm được thực hiện trên tế bào mơ phân sinh rễ hành ta ở điều kiện nhiệt độ phịng thí nghiệm và pH của các dung dịch cho phép từ 5 - 5.5 (đo bằng chỉ thị vạn năng)
Ở mỗi thứ nghiệm củ hành được đặt vào lọ nuơi đựng dung dịch thử Sau 4 giờ, 24 giờ
cắt mơ phân sinh chĩp rễ đem nhuộm trong orcéin rồi quan sát, nhận xét sự phân bào đơng thời quan sát hình thái và đo chiều dài của rễ Sau thời gian tác động của thuốc, mẫu được nuơi lại trong dung dịch Knop 1⁄2 để quan sát lại sự phân bào sau khi ngừng tác động của thuốc
Phương pháp của Deysson sử dụng cĩ các ưu điểm :
— Đơn giản, khơng đồi hỏi trang thiết bị, dụng cụ phức tạp — Nhanh
~ C6 thể áp dụng trong điều kiện phịng thí nghiệm của trường
—_ Đủ chính xác để chỉ rõ mối liên quan giữa các thành phân và tác dụng tới tế bào sinh vật
Củ hành ta được chọn để thử là do dễ kiếm, số lượng nhiễm sắc thể ít (2n = 16), nhiễm -
Trang 30Bhan il -Phuong phao nghién alu 27
Cach tién hanh
Dụng cụ và nguyên liệu thử nghiệm
—_ Cao được liệu (cao chiết methanol và nước)
—_ Củ hành, được chọn lọc cẩn thận cho phù hợp với yêu cầu thứ nghiệm
—_ Lọ nuơi bằng thủy tỉnh
— Chén sứ nhỏ —_ Kính hiển vi
— Lame va lamelle -
—_ Một số dụng cụ khác như : bình định mức, pipette 1ml; 5ml; 10ml, giấy thấm, giấy
bìa cứng, thước đo phân vạch đến ram
—_ Metanol: loại cơng nghiệp ( Singapore ), được cất lại theo phương pháp thường, lấy
ở phân đoạn cĩ nhiệt độ sơi là 64-67°C Bỏ phân đoạn đầu và cuối
~ DMSO (dimethyl sulfoxide ) S& dung loai tinh khiét phan tich (Fluka A.G) — Tween 80: loai ding trong bao ché
—_ Các muối: canxi nitrat, kali nitrat, kali đihydro phosphat, magie sulfat, kali clorid, s&t III clorid
—_ Nước cất
— Phẩm nhuộm orcein - Acid acetic, acid clohydric
Chuẩn bị các vật liệu thử
Thanh phan cho i lit dung dịch Knop nguyên
Canxi nitrat lg Kali clorid 0.12g
Kali nitrat 0.25¢ SAt III clorid 5% 1 giot Kali dihydro phosphat 0.25g Nuc cat vd 1 lít
Magie sulfat 0.25g PH = 5-5.5 (chi thi van nang)
Pha thuốc nhuộm theo cơng thúc
Orcéin 1g
Acid acetic 45ml
Nước cất 54ml
+ Chuẩn bị củ hành
Củ hành được chọn lựa xong, lột vỏ bao bên ngồi, rửa sạch, rửa lại 3 lần với nước cất
và 2 lần trong Knop 1⁄2 Đặt trong bình nuơi với dung dịch Knop 1⁄2 24 giờ sau chọn
những củ hành cĩ đa số rễ dài từ 1-1.5cm và trong sinh mơ quan sát khơng thấy tế bào
bất thường để thử
Trang 31Tả ll Phuong pha nghien cay - 28
Cao metanol : cân chính xác 50mg cao trên mặt kính đồng hỗ, thêm 0.25mi DMSO,
khuấy kỹ cho đến khi cao tan hết Cho vào bình định mức 50ml, thêm nước cất vừa đủ 50ml, lắc đều được dung địch cĩ nơng độ 1mg/ml Nếu cao khĩ tan diing Tween 80 để héa tan (lugng cho vao 1a 0.1% so theo thể tích) Từ dung dịch Img/ml pha lofng vdi nước cất để được các dung địch cĩ nồng độ lỗng 0 1mg/ml và 0.01mg/mI
Cao nước : chuẩn bị như cao metanol, nhưng khơng cĩ DMSO hoặc Tween 80
Dung dich ching : cĩ nồng độ DMSO hay Tween 80 tương ứng với nơng độ của chúng
trong dung dịch thử
Tiến hành th nghiệm
Các mẫu được thử ở nễng độ 1mg/mI, nếu cĩ tác dụng sẽ được thử ở nồng độ thấp hơn Củ hành được đặt vào đung địch thử ở nồng độ quy định Sau 4 và 24 giờ, quan sát hình thái và đo chiểu dài rễ so với chiều dài rễ trước khi thử nghiệm Cắt ít nhất là 3 chĩp rễ ở mỗi mẫu thử nghiện, nhuộm với 0.5ml dung dich orcéin va 1 giot HCl IN trong 1-2 giờ Quan sát sự phân bào dưới kính hiển vi quang học (soi trong dung dich orcein) Đếm tổng số tế bào ở metaphase và ở anaphase, đếm tổng số những tế bào cĩ bất thường ở metaphase và ở anaphase Quan sát những bất thường khác trong sự phân chia tế bào Sau thử nghiệm, củ hành được nuơi lại trong dung địch knop 1⁄2 và theo đối sự hồi phục của rễ
Tiến bành tương tự với mẫu trắng Đánh giá kết quả
- Xác định tỉ lệ tăng trưởng của rễ ở mẫu thử so với mẫu trắng khơng chứa cao thử
- Đánh gía sự phục hồi của rễ sau khi nuơi lại trong dung dịch Knop 1⁄2 và những bất thường về hình thái của rễ, nếu cĩ, trong quá trình thử nghiệm
- Xác định tỉ lệ tế bào bất thường ở metaphase và ở anaphase của mẫu thử so với tổng số tế bào của mẫu thử ở metaphase và ở anaphase So sánh tỉ lệ này với mẫu trắng
khơng chứa cao thử
- Đánh giá những bất thường của tế bào trong quá trình phân bào
6 NGHIÊN CỨU HỐ HỌC
Sau khi thử nghiệm và đánh giá tác động của các cao chiết trên các mơ hình thử sinh “học iz viro, chọn những cây thuốc cĩ tác dụng tốt, cĩ nhiễu hứa hẹn để tiếp tục nghiên
cứu hĩa học
Trang 32Rhdn it _ P9Jpwg pháp nghien atu 29
Các phân đoạn cĩ tác dụng được tiếp tục phân tách thành những phân đoạn đơn giản
hơn và sau cùng là các chất tinh khiết băng các phương pháp sắc ký như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng điều chế v.v trên silica gel và các vật liệu đảo pha (Quy trình chiết xuất
và phân lập các hợp chất sẽ được mơ tả cụ thể trong phan IV 9)
Trang 33PHAN III
Trang 34‘Bhan ll - Ket gud nghien atu 30
1 DANH SÁCH MẪU NGHIÊN CỨU
Các dược liệu được sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê theo thứ tự tên Việt nam
gồm: Tên Việt nam, tên la tỉnh, họ thực vật, nơi và thời gian thu thập mẫu, bộ phận dùng trong thử nghiệm và đặc điểm bột được liệu
Ba dĩt - Eupatorium triplinerve Vahl., Asteraceae (Tp HCM 3/ 1998)
Cành mang lá - Bột màu xanh rêu
Ba bénh - Euricoma longifolia Jack Subsp longifolia, Simaroubaceae (Mua tai Tp HCM) Thân - Bột mau vàng, vị rất đắng Bach hoa xa - Plumbago zeylanica L., Plumbaginaceae (Tp HCM - 3/1997) Lá - Bột màu lục nhạt ` Thân - Bột màu lục nhạt
Rễ - Bột màu đỏ nâu, mùi hắc, buơn nơn
Bach trinh - Hymenocallis speciosa Salisb., Amarillidaceae (Tp HCM - 3/ 1997) Lá - Bột màu vàng lục Thân hành - Bột màu trắng xám Rễ - Bột màu trắng xám Bang - Terminalia catappa L., Combretaceae (Tp HCM - 6/1997) Lá - Bột mau lục đậm Vỏ thân - Bột mầu nâu Berberin
Muối berberin chlorid, Bột khơ tơi màu vàng
Bi d6 - Cucurbita maxima Duch ex Lam., Cucurbitaceae (Tp HCM - 6/1997) Thân lá - Bột màu nâu, cĩ nhiều xơ
Hạt - Bột màu xám nhạt
Binh bat - Annona reticulata L., Annonaceae (TpHCM - 3/1998)
Lá - Bột màu xanh rêu
Vỏ thân - Nâu, ít xơ
Vỏ rễ - Màu nâu
Gỗ thân - Mầu vàng Gỗ rễ - Màu vàng Hạt - Màu nâu, đính ướt
Binh Véi Bién - Stephania pierrei Diels, Menispermaceae (Phan thiét - 1990)
Củ — Bột màu trắng xám nhạt
Bình Vơi Đồng Nai - Stephania sp., Menispermaceae (Đồng Nai - 4/1988)
Trang 35Phan i Ket gud nghien ou 31 Thân - Bột màu vàng
Củ — Bột màu vàng xám
Béng né - Fluggea virosa Wall., Euphorbiaceae +4 - Bột màu lục nhạt
Thân - Bột màu nâu nhạt
Bễ kết tây (Cịng) — Albizia lebbeck (L.) Benth., Fabaceae (Tp HCM ~ 3/1998) Lá - Bột màu xanh đậm, mịn Vỏ thân - Bột màu vàng, cĩ xơ Vỏ rễ - Bột mầu vàng Gỗ thân - Bột màu vàng, cĩ xơ Gỗ rễ - Bột mầu vàng, cĩ xơ Quả - Bột màu nâu đen Hạt - Bột màu nâu Bu Dé La Lén - Uvaria cordata Dunal) Wall ex Alston, Annonaceae (An giang — 8/1995) :
Lá — Bột mau nâu đậm, nhiều xơ
"Thân cành - Bột màu nâu đỏ
Bưởi - Cữrus grandis Osbeck, Rutaceae (Bến tre ~ 3/1998) Lá —- Bột màu xanh Vỏ thân - Bột mầu vàng nhạt Vỏ rễ — Bột màu vàng nhạt Gỗ thân — Bột màu vàng ngà Gỗ rễ — Bột màu vàng ngà Vỏ quả — Bột màu vàng, mùi thơm Hạt— Bột vàng nga Cam - Citrus nobilis L, Rutaceae (BEn tre — 3/1998) Lá —- Bột mầu xanh Vỏ thân ~ Bột màu vàng nhạt Vỏ rễ ~ Bột mầu vàng nhạt Gỗ thân — Bột màu vàng ngà Gỗ rễ - Bột màu vàng ngà Vỏ quả — Bột màu vàng, mùi thơm Hạt - Bột màu xám Cam thảo đây - Abrus precatorius Fabaceae (TpHCM - 7/1997) Lá - Bột màu xanh nhạt, vị rất ngọt
Thân - Bột nhiễu xơ, vị hơi ngọt
Cam thảo nam - Scoparia dulcis L., Scrophulariaceae (Tp HCM - 6/1997)
Trang 36Quy Ni - Ket gud nghien atu 32
Cu Ding - Uncaria sp., Rubiaceae (An giang - 8/1 996)
Thân cĩ mĩc câu - Bột cĩ màu nâu đồ Cau ding — Uncaria sp., Rubiaceae
Than — Bột màu nâu dé (mua tai Tp HCM — 3/1998, Xuất xứ : Trung quốc)
Thân — Bột màu nâu đỏ (mua tại An giang - 7/1995, Xuất xứ : Việt nam)
Chanh - Citrus aurantifolia Swingle, Rutaceae (Bén tre ~ 3/1998) Lá — Bột màu xanh Vỏ thân — Bột màu vàng nhạt Vỏ rễ — Bột màu vàng nhạt Gỗ thân - Bột màu vàng ngà Gỗ rễ — Bột màu vàng ngà Vỏ quả — Bột màu vàng, mùi thơm Hạt - Bột trắng ngà
Chĩ đẻ răng cưa - Phyllanthus urinaria L Euphorbiaceae (Thủ Đức - 3/1997),
Tồn cây cả rễ - Bột cĩ màu xanh lá với nhiều xơ
Chim ruét - Phyllanthus acidus (L.) Skeels, Euphorbiaceae (An Giang - 3/1997) Vỏ thân chùm ruột - Bột cĩ màu nâu đỗ cĩ mùi thơm,
Vỏ rễ chàm ruột - Bột cĩ mầu nâu đen Gỗ rễ chùm ruột - Bột cĩ mầu xám nâu, Gỗ thân chàm ruột - Bột cĩ mầu nâu nhạt
Cị sen - Miiliusa velutina (Dunal) Hook et Thoms., Annonaceae (An giang - 7/ 1995)
Lá - Bột màu lục đậm :
Gỗ thân - Bột màu vàng
Gỗ rễ - Bột màu nâu nhạt
Cơ lào (Yên bạch) - Eupatorium odoratum L., Asteraceae (Tp HCM - 6/1997) Lá - Bột màu nâu nhạt, thơm nhẹ
Thân - Bột màunâu nhạt
Rễ - Bột màu vàng nhạt
Cĩ seo gà (Cổ luỗng) — Peris ensformis Burm., Pteridaccae (Tp HCM -~ 3/1998) Lá - Bột màu lục
Cĩ sữa 14 16n - Euphorbia hirta L Euphorbiaceae (TPHCM - 3/1997)
`_ Tồn cây cả rễ - Bột cĩ màu xanh lá nhạt
Cổ sữa lá nhỗ - Euphorbia thymifolia L Euphorbiaceae (TPHCM - 3/1997)
Toờn cây cả rễ - Bột cĩ mầu nâu nhạt
Cĩ xước — Achiranthes aspera , Acanthaceae (mua tại Tp HCM)
Rễ củ - Nâu nhạt
Trang 37Phan Il Ket gua nghien cu 33 Cối xay - Abutilon indicum Malvaceae (Tp HCM - 6/1997) Lá - Bột màu nâu nhạt Cốt khí củ - Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc., Polygonaceae (Mua tại Tp HCM - 5/1997) Củ - màu đồ nâu Cúc chỉ thiên mềm (Chân voi cao) - Elephantopus mollis H.B.K., Asteraceae (An giang - 8/1995) Phần trên mặt đất - Bột màuxanh nâu, dễ gây hắt hơi Rễ - bột màu nâu nhạt Dây cĩc (Dây ký ninh) - Tinospora crispa Menispermaceae (An giang - 5/1997) Lá-
Thân - Bột cĩ nhiều xơ, vị đắng
Dén gai - Amaranthus spinosus L., Amaranthaceae (Tp HCM - 5/1997) Phần trên mặt đất - Bột màu vàng Rễ - Bột màu trắng ngà Đuối (ruối) - Strebulus asper Moraceae (Tp HCM - 2/1997) Rễ - Bột nhiễu xơ, vị đắng Vỏ thân - Bột nhiều xơ Lá - Bột màu lục Dừa cạn - Catharanthus roseus G Don Apocynaceae (Tp HCM - 6/1997) Lá - Bột màu lục, vị hơi đắng Thân - Bột màu nâu nhạt, vị đắng Âễ - Bột màu nâu, vị đắng
Đừng lạc - Pisonia umbellifera (J et G Forst.) Seem., Nyctaginaceae (An giang - 5/1997)
Thân - Bột cĩ màu vàng chanh, nhiều xơ
Lá - Bột cĩ màu lục nâu
Đa đa — Harrisonia perforafa , Simaroubaceae (Đồng nai — 3/1998)
Lá —- Bột màu đỏ nâu
Thân - Bột màu nâu
Đại bí (Từ bì) - Buunea balsamifera D.C., Asteraceae (Tp HCM - 3/1997)
Lá - Bột màu vàng lục, mùi băng phiến Thân - Bột màu nâu, nhiều xơ
Đại hoa d6 - Plumeria rubra Apocynaceae (Tp HCM - 7/1997)
[4 - B6t mau nau, vi hoi ngot
Vỏ thân - Bột cĩ nhiều xơ, vị đắng
Hoa - Bột màu đỏ sậm, rất thơm
Đại hoa trắng - Plumeria rubra var acutifolia Apocynaceae (Tp HCM - 7/1997) :
Trang 38Rhdn I Ret gud nghicn ott 34 Võ thân - Bột cĩ nhiều xơ, vị đắng
Hoa - Bot rat thom
Đại Phong Tu - Hydnocarpus anthelmintica Pierre ex Laness, Flacourticaceae (Mua tai
Tp HCM — 3/1998) Vỏ hạt - Bột mầu nâu
Nhân hạt - Bột nhiều đầu, màu vàng nâu, mùi đạc biệt Dầu hạt ~ Dầu sánh mầu vàng, mùi đặc biệt
Don ld 46 — Excoecaria cochichinesis , Euphorbiaceae (An giang — 3/1998) La
Đơn lá đỏ -Excoecaria bicolor Hass Euphorbiaceae (L4i Thiéu - 4/1997)
Lá đơn lá đỏ : bột cĩ mầu xanh đồ lẫn lộn Thân cành : bột cĩ mầu nâu
Du di - Carica papaya L., Caricaceae (Tp HCM - 4/1997) Phiến lá - Bột màu lục
Thân - Bột màu vàng nhạt, cĩ xơ Rễ - Bột trắng ngà, cĩ xơ
Hạt - Bột màu nâu đen
Eicus sp Moraceae (Quảng ngãi) L4 và cành nhỏ - Bột mầu xanh xám G&c - Momordica cochichinensis (Lour.) Spreng., Cucurbitaceae (Tp HCM - 3/1997) Thân lá - Dùng dạng tươi Vỏ thân - Dùng dạng tươi Vỏ rễ - Dùng dạng tươi Lõi thân - Dùng dạng tươi Lõi rễ - Dùng dạng tươi
Gáo vàng - Nauclea orientalis Rubiaceae (Hải Dương - 5/1997) Vỏ thân - Bột cĩ nhiều xơ, vị đắng
Giác đế - Goniothalamus giabracianus (Baill.) Ast., Annonaceae (An giang - 5/1995)
Lá - Bột màu nâu Rễ - Bột màu vàng đậm
Gối hạc - Leea rubra Leaceae (Tp HCM - 6/1997)
Lá - Bột mau lục, khơng mùi vị
Trang 39‘Rhdn il Ket gud nghién ctu 35
Lá - Dùng dạng tươi Hoa - Dùng dạng tươi Hạt - Bột màu xám
Hồng bì - Murraya koenigii (L.) Spreng., Rutaceae (Tp HCM — 7/1997)
Lá - Bột màu rêu, cĩ mùi thơm đặc trưng, vị đắng hơi cay Vỏ thân - Bột mầu xám nâu vị đắng hơi cay
Hồng lan (Ngoc Ian tay, Ylang y lang) - Cananga odorata (Lam.) Hook f Et Thoms.,
Annonaceae (Tp HCM - 5/1997) Lá - Bột màu nâu đen, cĩ mùi thơm
Vỏ thân - Bột màu nâu đen, cĩ mùi thơm
Vỏ rễ - Bột mầu nầu đen, cĩ mùi thơm
Hoang lién - Coptis chinensis., Ranulculaceae (Mua tai Tp HCM - 5/1997) Rễ - Bột màu vàng Hué - Polyanthes tuberosa L Liliaceae (Tp HCM - 3/1997) Củ - Dùng dạng tươi Huệ đỏ (Huệ xẻ dd) - Zephyranthes rosea (Spreng.) Lindl., Amaryllidaceae (Bến tre - 4/1997) Củ - Dùng dạgn tươi Rễ - Dùng đạng tươi
Ké đầu ngựa — ÄXanthium strumarium L., Asteraceae (mua tai Tp HCM) Quả - Bột màu nâu
Khién nguu (Bin bim, Hic stu) - Ivomea hederaceae J: acq., Convolvulaceae (An giang - 5/1997)
Hạt - Bột màu nâu đen, nhiều chất béo
Lưỡi rắn (Tp HCM - 1/1997)
Tồn cây - bột màu lục nhạt
Mạn kinh tử - Vitex trifolia Lin Verbenaceae
Hat - (Trung tâm dược liệu Quận 5, Nha Trang - 4/1997)
Mãng cẫu ta - Annona squamosa L., Annonaceae (TpHCM - 3/1998)
+ Lá Màu xám
Vỏ thân Mầu nâu, nhiều xơ V6 ré Màu nâu, cĩ xơ
Gỗ thân Vàng nhạt Gỗ rễ Màu vàng nhạt Hạt Xám trắng, dính tay
Mãng cầu xiêm - Annona reticulataL., Annonaceae (Bến tre - 4/1998)
Trang 40Bhan lil Ket gud nghién atu 36 Vỏ rễ - Màu nâu, nhiều xơ
Gỗ thân - Màu nâu xám Gỗ rễ - Màu xám Hạt - Nâu đen, ướt
Me - Tamarindus indica L., Fabaceae (Tp HCM - 6/1997) Lá - Bột mầu vàng lục Vỏ thân - Bột màu vàng nâu Gỗ thân - Bột màu vàng Vỏ rễ - Bột màu nâu sậm Gỗ rễ - Bột màu vàng nhạt Méc hung - Sausurea lappa Clarke, Asteraceae (Nguén géc Trung quéc, mua tai Tp HCM - 3/1997)
Rễ - Bột màu nâu, mùi thơm gắt
Miu u - Calophyllum inophyllum , (Tp HCM — 3/1998) Lá - Bột lá màu lục
Vỏ thân
Nhân hạt
Murdania — Muzdania sp , Comeliaceae (Kiên giang — 8/1997),
Tồn cây trên mặt đất — Bột màu lục nâu
Mướp đắng - Momordica charamia L., Cucurbitaceae (Tp HCM - 3/1997) Lá - Dùng dạng tươi
Thân - Dùng dạng tươi Quả - Dùng dạng tươi Hạt - Dùng dạng tươi
Náng hoa đồ - Crinum defixum Ker Gawl, Amaryllidaceae (Tp HCM - 3/1997)
Lá - Bột màu xanh nâu
Thân hành - Bột màu trắng hơi nâu
Nang hoa Trang (Đại tướng quân) - Criun Asiaticum L Amaryllidaceae (Tp HCM - 3/1997)
Lá - Bột màu xanh nâu
Thân hành - Bột màu trắng hơi nâu
Nga truật - Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe, Zingiberaceae (Mua tai Tp HCM -
3/1997)
Than ré - B6t mau vang chanh, c6 mii dac trung, vị hơi đắng
Ngai luc binh - Zurycies amboinensis (L.) Loudon, Amarillidaceae (An giang - 7/1995)
Thân hành - Bột màu trắng ngà
Nghệ - Curcuma longa L., Zingiberaceae (Tién giang - 3/1997)