Nghiên cứu sự phân bố và tác dụng kháng ung thư của kháng thể đơn dòng nimotuzumab gắn 131i trên chuột mang khối ung thư đầu cổ người (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN THỊ KIM HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ VÀ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG NIMOTUZUMAB GẮN 131I TRÊN CHUỘT MANG KHỐI UNG THƯ ĐẦU CỔ NGƯỜI Chuyên ngành : KHOA HỌC Y SINH Mã sớ : 9720101 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Huy Quyến PGS.TS Hồ Anh Sơn Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Văn Ba Phản biện 2: GS.TS Văn Đình Hoa Phản biện 3: PGS.TS Lê Ngọc Hà Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Học viện Qn Y vào hồi: ngày Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc Gia Thư viện Học viện Quân y ………………………… tháng năm ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư là bệnh ác tính có tỷ lệ mắc và tử vong cao Ở Việt Nam, năm có khoảng 8.500 bệnh nhân ung thư đầu cổ mắc mới, ung thư biểu mơ vảy chiểm khoảng 90% Các phương pháp điều trị ung thư đầu cổ bao gồm: phẫu thuật, xạ trị và hóa chất Tuy nhiên độc tính hóa chất chớng ung thư, tác dụng không mong muốn xạ trị gây nên biến chứng nặng nề, làm giảm chất lượng sớng cho người bệnh Các kháng thể đơn dịng đã nghiên cứu, phát triển và áp dụng vào điều trị cho bệnh nhân ung thư, với hy vọng kháng thể đơn dịng tìm tới tiêu diệt xác tế bào ác tính đặc hiệu mà không gây ảnh hưởng tới tế bào lành Các nghiên cứu cho thấy kết điều trị có cải thiện, chưa kỳ vọng Để đạt hiệu điều trị tối ưu, nhà khoa học đã ứng dụng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (gắn đồng vị phóng xạ với kháng thể đơn dòng), và tế bào ung thư bị tiêu diệt chế kép: kháng thể kháng lại và xạ ion hóa đồng vị phóng xạ phát Kháng thể đơn dòng Nimotuzumab ức chế tế bào ung thư cách chống tăng sinh mạch, chống phân bào 131 I là đồng vị phóng xạ có khả xạ ion hóa gây tổn thương khơng hồi phục và bẻ gãy AND nhân tế bào Kết hợp 131 I với Nimotuzumab làm tăng hiệu tiêu diệt tế bào ung thư Mục tiêu đề tài: Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu mơ vảy đầu cổ người dịng Hep-2 phức hợp 131I-nimotuzumab in vitro Đánh giá phân bố tác dụng kháng ung thư phức hợp 131 I-nimotuzumab chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ người dịng Hep-2 Ý NGHĨA THỰC TIỄN VÀ ĐĨNG GĨP MỚI Nghiên cứu có giá trị khoa học, có đóng góp là: lần nước ta chế phẩm kháng thể đơn dòng Nimotuzumab gắn đồng vị phóng xạ 131 I đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu mô vảy đầu cổ theo chế chết theo chương trình và chế phẩm có tác dụng điều trị ung thư đầu cổ mơ hình thực nghiệm và cho kết bước đầu tốt: khối u phát triển chậm rõ rệt có ý nghĩa thớng kê chuột điều trị so với nhóm chứng và tỷ lệ chuột nhóm điều trị sớng sót cao rõ rệt so với chuột khơng điều trị Đó là liệu khoa học có giá trị nghiên cứu điều trị ung thư thực nghiệm chế phẩm kháng thể đơn dịng gắn đồng vị phóng xạ, đồng thời đề tài có ý nghĩa thực tiễn chỗ là tiền đề cho nghiên cứu nhằm ứng dụng liệu pháp điều trị nhắm đích đới với loại ung thư biểu mô đầu cổ người kháng thể đơn dịng gắn đồng vị phóng xạ lâm sàng CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 109 trang: - Đặt vấn đề: 02 trang - Tổng quan tài liệu: 30 trang - Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 20 trang - Kết nghiên cứu: 28 trang - Bàn luận: 26 trang - Kết luận: 02 trang Luận án có: - 26 bảng, biểu đồ, 22 hình - 108 tài liệu tham khảo: + 04 tài liệu tiếng Việt + 104 tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình ung thư đầu cổ Ung thư đầu cổ là số loại ung thư phổ biến giới với ước tính khoảng 686.328 trường hợp năm 2012, bao gồm 300.373 trường hợp ung thư môi và khoang miệng, 156.877 quản, 142.387 họng và 86.691 ung thư hầu mũi Tỉ lệ mắc loại ung thư vùng đầu cổ khác tùy thuộc vào vùng địa lý, và mức độ tiếp xúc khác với đa dạng yếu tố nguy Ở Việt Nam bệnh thường gặp nhiều nam (80%) thường vào lứa tuổi 40-60 tuổi xu hướng tỉ lệ người trẻ mắc bệnh ngày càng tăng gây nhiều thiệt hại cho cộng đồng và cho xã hội và là gánh nặng cho bệnh nhân y tế nói chung 1.2 Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ Thụ thể yếu tớ tăng trưởng biểu bì (EGFR) đặc biệt quan trọng bệnh sinh ung thư biểu mô vảy đầu cổ Hơn 90% trường hợp ung thư đầu cổ có biểu mức EGFR Sự biểu mức EGFR và phới tử TGF-α (transforming growth factor alpha) xuất phổ biến HNSCC, xuất RNA thông tin (mRNA) EGFR và TGF-α mức cao tương ứng là 92% và 87% khối ung thư Hơn nữa, biểu EGFR tăng cao khối u giai đoạn tiến triển khới u biệt hóa, đồng thời có tăng biểu EGFR tế bào biểu mơ bình thường tổ chức liền kề với khối u Điều này ủng hộ cho giả thuyết vai trị EGFR hình thành khới u ác tính Sự tăng đáng kể biểu EGFR quan sát thấy trình thay đổi từ dị sản đến ung thư biểu mô tế bào vảy 1.3 Kháng thể đơn dòng (nimotuzumab) gắn đồng vị phóng xạ (131I) điều trị ung thư 1.3.1 Kháng thể đơn dòng nimotuzumab Nimotuzumab là kháng thể đơn dòng IgG1 nhắm mục tiêu cụ thể đến EGFR, tạo cách ghép vùng trình diện kháng nguyên egf/r3 (epidermal growth factor/ region3) chuột với kháng thể người Kháng thể này gắn đặc hiệu với EGFR vùng ngoại bào Nimotuzumab là kháng thể đơn dịng nhân hóa chớng EGFR đã sử dụng rộng rãi điều trị ung thư Một số nghiên cứu lâm sàng đã nimotuzumab có thời gian bán hủy lâu hơn, độc tính với da nghiêm trọng so với chất ức chế EGFR khác Cơ chế điều trị kháng ung thư nimotuzumab là cạnh tranh với EGF, làm giảm chuyển hóa và chết tế bào bệnh, cảm ứng tế bào chết theo chương trình (apoptosis) Nên tế bào tăng nhạy cảm với hóa trị và xạ trị Nimotuzumab nghiên cứu và phát triển trung tâm Miễn Dịch học phân tử Cu Ba 1.3.2 Đồng vị phóng xạ 131I Iod là ngun tớ hố học, có sớ ngun tử là 53 hệ thống tuần hoàn nguyên tớ hóa học, ký hiệu là I Về mặt hố học, iod hoạt động và có độ âm điện thấp halogen Giống halogen nhóm ngun tớ VII bảng tuần hoàn, Iod thường có mặt dạng phân tử hai ngun tử Khới lượng nguyên tử là 126,90447g/mol, cấu hình electron [Kr] 4d10 5s2 5p5, số electron vỏ điện tử: 2, 8, 18, 18, Có 37 đồng vị iod, có 127I là bền Đồng vị phóng xạ 131I có chu kỳ bán rã khoảng ngày 131 I phân rã phát tia β và gama (γ), lượng phát tia γ cho chụp hình để chẩn đoán để điều trị là 606 keV 131 I là 364 keV, lượng phát tia β 1.3.3 Tác dụng 131I gắn với kháng thể đơn dòng điều trị ung thư Liệu pháp miễn dịch phóng xạ (Radioimmunotherapy -RIT) sử dụng kháng thể đơn dịng gắn với đồng vị phóng xạ nhằm xác định vị trí khới ung thư và điều trị đích Phức hợp miễn dịch phóng xạ tiêm vào tĩnh mạch tiêm trực tiếp vào khối u, vào khoang thể khoang màng bụng, màng phổi… Sau tiêm vào thể phức hợp phân phới theo dịng chảy máu, khuếch tán đới lưu dẫn đến đích tự nhiên mang dấu ấn, là kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể đơn dòng bề mặt tế bào khối u Các xạ từ phức hợp miễn dịch phóng xạ giết chết tế bào ung thư DNA bị hư hỏng vượt khả sửa chửa chúng Các đồng vị phóng xạ sử dụng để điều trị ung thư thường phát hạt xạ (hạt α, hạt β) truyền lượng lượng đáng kể vào khối u Hàng trăm thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh hiệu khới u ác tính máu và thể đặc 131 131 I điều trị I cịn có lợi tương đới rẻ tiền, sử dụng để chụp ảnh xác định vị trí khới u và sử dụng để trị liệu, đã có lịch sử lâu dài điều trị thành công khới u ác tính Năm 1990 Hnatowich đã có đánh giá tớt việc gắn đồng vị phóng xạ 131 I vào kháng thể đơn dòng y học hạt nhân đặc tính phát xạ thuận lợi và gắn chặt ổn định với kháng thể (đặc biệt là kháng thể đơn dòng) CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Tế bào ung thư biểu mơ vảy đầu cổ người dịng Hep-2 - Chuột thiếu hụt miễn dịch BALB/c 6-8 tuần tuổi, khối lượng 1822g Số lượng sử dụng nghiên cứu là 63 chuột: + 33 con: đánh giá phân bố 131 I-nimotuzumab chuột mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ + 30 con: đánh giá tác dụng điều trị ung thư 131 I- nimotuzumab chuột mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ 2.2 Địa điểm nghiên cứu - Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y - Trung tâm Y Dược học Quân - Học viện Quân y - Khoa Y học hạt nhân Bệnh viện 103 - HVQY - Khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện 103 - HVQY - Phịng thí nghiệm trọng điểm Gen-Protein ĐHKHTN, Đại học quốc gia Hà Nội 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành theo phương pháp thực nghiệm, tiến cứu, chọn thời điểm so sánh đánh giá trước, và sau điều trị 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 2.3.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào Hep-2 phức hợp 131 I- nimotuzumab in vitro - Đánh giá tác dụng ức chế tế bào Hep-2 thử nghiệm MTT: tế bào Hep-2 tiếp xúc với 131 I-nimotuzumab nồng độ 400, 200, 100 và 25 µg/ml, sau 48 quan sát tác dụng - Đánh giá tác dụng apoptosis tế bào Hep-2 sau tiếp xúc với nimotuzumab: xác định tỉ lệ tế bào Hep-2 chết theo chương trình 131 I- 2.3.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu mơ vảy đầu cổ người dịng Hep-2 phức hợp 131I-nimotuzumab in vivo - Đánh giá phân bố sinh học 131 I-nimotuzumab chuột mang khối ung thư biểu mơ vảy đầu cổ người dịng Hep-2 + Đánh giá phân bố 131 I-nimotuzumab máu mô - quan: chuột mang khối ung thư tiêm 131 I-nimotuzumab: sau 24, 48 và 72 chuột lấy máu, mô và tạng đếm xung gama + Đánh giá phân bố toàn thân chuột: chuột mang khối ung thư tiêm 131 I-nimotuzumab 131 I-nimotuzumab: sau 24, 48 và 72 chuột chụp xạ hình SPECT - Đánh giá hiệu điều trị 131 I-nimotuzumab: chuột mang khới ung thư với kích thước khới u chuột từ 5-6 mm chia nhóm: + Nhóm 1: tiêm tĩnh mạch 131 I-nimotuzumab liều điều trị 5,55 MBq/0,1ml/con + Nhóm 2: tiêm tĩnh mạch Nimotuzumab liều điều trị 100µg/0,1ml/con + Nhóm 3: tiêm tĩnh mạch 0,1ml NaCl 0,9%/con Sau tiêm chuột theo dõi chuột hàng ngày và đo kích thước khới u và khới lượng lần/tuần Cả nhóm chuột theo dõi và đánh giá thêm thời gian sống và tỷ lệ sống/chết Các tiêu theo dõi: - Toàn trạng (ăn, uống, phân) chuột - Kích thước khới u: theo cơng thức: V = D x R x 0,5 [V: thể tích khối u (mm 3); D: chiều dài khối u (mm); R: chiều rộng khối u (mm)] - Khối lượng chuột: cân tuần/lần - Theo dõi u và khối lượng chuột dừng lại chuột nhóm điều trị bị chết - Tính sớ lượng chuột sớng/chết sau điều trị 2.3.3 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 2.3.3.1 Đánh giá tác dụng kháng ung thư thử nghiệm MTT 2.3.3.2 Đánh giá tác dụng gây chết tế bào theo chương trình 2.3.3.3 Kiểm tra hoạt tính phức hợp 131 I-nimotuzumab thời điểm thực nghiệm 2.3.3.4 Đánh giá phân bố 131 I-nimotuzumab phương pháp đếm hoạt độ phóng xạ mô quan chuột 2.3.3.5 Đánh giá phân bố 131 I-nimotuzumab phương pháp chụp SPECT 2.4 Xử lý số liệu - Xử lý số liệu phần mềm SPSS 21.0 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào Hep-2 Nimotuzumab 131 I-nimotuzumab in vitro Bảng 3.1 : Kết tỷ lệ % ức chế tế bào Hep-2 thời điểm 48 tác dụng Nimotuzumab 131I-Nimotuzumab %OD Nồng độ (µg/ml) 131 Nimotuzumab I-Nimotuzumab control 100 100 400 65,43 ± 0,92 67,61± 0,27 200 80,49 ± 1,21 88,91± 0,89 100 94,07 ± 0,96 97,61 ± 1,30 25 94,32 ± 1,12 Tác dụng Nimotuzumab và phức hợp 105,65 ± 1,08 131 I-Nimotuzumab với dải nồng độ 400µg/ml, 200µg/ml, 100µg/ml và 25 µg/ml giếng nuôi tế bào Hep-2 cho thấy nồng độ hóa chất càng cao sớ lượng tế bào ung thư sớng sót càng giảm 12 Sau 24 tiêm, phức hợp 131 I-nimotuzumab tập trung chủ yếu máu, u thấp hơn, với p < 0,0001 Bảng 3.3: So sánh phân bố 131I-nimotuzumab u so với mô quan chuột thời điểm 24 sau tiêm Hoạt độ Hoạt độ trung bình trung Mơ - quan Trung U (số bình p (n = 6) vị đếm/mg) mô (n = 6) quan Phổi (2) 351,78 352,28 p1,2 = 0,026 221,83 (1) Thận (3) 217,31 188,88 p1,3 = 0,589 Tim (4) 204,65 190,84 p1,4 = 0,394 Tuyến giáp (5) 189,76 217,77 p1,5 = 0,394 Lách (6) 189,12 165,04 p1,6 = 0,180 Gan (7) 167,69 176,38 p1,7 = 0,240 Ruột (8) 163,99 142,83 p1,8 = 0,065 Cơ (9) 95,94 19,44 p1,9 = 0,002 Sau 24 giờ, phức hợp 131I-nimotuzumab đã đến tất mô và quan, phân bố tương đối đồng Bảng 3.4: So sánh phân bố 131I-nimotuzumab u so với máu thời điểm 48 sau tiêm Mô - quan Hoạt độ trung bình (số đếm/mg) Trung vị U (n = 6) Máu (n = 6) 350,32 852,70 343,04 866,43 13 p 0,002 Sau 48 tiêm, phức hợp 131 I-nimotuzumab u tăng lên máu giảm, nhiên, u thấp máu, với p < 0,05 Bảng 3.5: So sánh phân bố 131I-nimotuzumab u so với mô quan chuột sau 48 Hoạt độ trung bình U (số đếm/mg) (n = 6) 350,32 (1) Mô - quan (n = 6) Hoạt độ trung bình Trung mơ vị quan p Phổi (2) 215,30 290,11 p1,2 = 0,002 Tim (3) 163,20 156,61 p1,3 = 0,002 Thận (4) 142,18 146,0 p1,4 = 0,002 Gan (5) 137,46 134,07 p1,5 = 0,002 Tuyến giáp (6) 137,22 135,06 p1,6 = 0,002 Lách (7) 120,98 128,35 p1,7 = 0,002 Cơ (8) 63,32 64,76 p1,8 = 0,002 Ruột (9) 59,53 55,66 p1,9 = 0,002 Sau 48 giờ, phức hợp 131 I-nimotuzumab đã tập trung đến u cao tất mô và quan, với p < 0,05 Bảng 3.6: So sánh phân bố 131I-nimotuzumab u so với máu thời điểm 72 sau tiêm Mơ - quan Hoạt độ trung bình (số đếm/mg) Trung vị U (n = 6) Máu (n = 6) 253,63 320,01 208,34 358,0 14 p 0,24 Sau 72 giờ, phân bố 131 I-nimotuzumab u và máu gần tương đương nhau, khơng có khác biệt với p > 0,05 Bảng 3.7: So sánh phân bố 131I-nimotuzumab u so với mô quan chuột thời điểm 72 sau tiêm Hoạt độ Hoạt độ trung bình Mơ - quan trung bình Trung U (số p (n = 6) mô vị đếm/mg) quan (n = 6) Phổi (2) 128,67 132,0 p1,2 = 0,002 253,63 (1) Tuyến giáp (3) 86,36 82,61 p1,3 = 0,002 Tim (4) 75,84 74,16 p1,4 = 0,002 Thận (5) 71,17 72,41 p1,5 = 0,002 Gan (6) 48,25 48,75 p1,6 = 0,002 Lách (7) 44,04 44,62 p1,7 = 0,002 Ruột (8) 34,87 31,69 p1,8 = 0,002 32,95 25,86 p1,9 = 0,002 Cơ (9) Sau 72 giờ, phức hợp 131 I-nimotuzumab đã tập trung u cao nhiều, tạng/cơ quan giảm, với p < 0,05 Bảng 3.8: So sánh tỷ lệ % số đếm xung gamma mô - quan so với máu nhóm chuột thí nghiệm Cơ quan-mơ U Cơ Tim Phổi Thận Gan 24 tiêm (%) 48 tiêm (%) 72 tiêm (%) 19,91 8,61 18,36 31,57 19,50 15,05 41,08 7,42 19,14 25,25 16,67 16,12 79,26 10,30 23,70 40,21 22,24 15,08 15 Ruột Tuyến Giáp Lách 14,72 17,03 16,97 6,98 16,09 14,19 10,90 26,99 13,76 Sau 24 tiêm 131I-nimotuzumab, tỉ lệ số đếm xung gamma cao là phổi (31,57%), tạng khác có tỉ lệ tương đới giống là u (19,91%), thận (19,5%), tim (18,36%) thấp là (8,61%) Thời điểm 48 và 72 tỷ sớ đếm xung gamma so với máu u là cao so với mô, quan khác Bảng 3.9: So sánh hoạt độ phóng xạ chụp SPECT vùng đầu cổ khối u chuột sau 24 tiêm 131I-nimotuzumab Vị trí Đầu cổ (n = 5) U (n = 5) Số đếm trung bình 6,70 11,22 SD 0,57 0,36 p 0,0001 * Thuật toán One way ANOVA Bảng 3.10: So sánh hoạt độ phóng xạ chụp SPECT vùng đầu cổ khối u chuột sau 48 tiêm 131I-nimotuzumab Vị trí Đầu cổ (n = 5) U (n = 5) Số đếm trung bình 2,16 4,55 SD 0,70 1,53 p 0,017 *Thuật toán One way ANOVA Bảng 3.11: So sánh hoạt độ phóng xạ chụp SPECT vùng đầu cổ khối u chuột sau 72 tiêm 131I-nimotuzumab Vị trí Đầu cổ (n = 5) U (n = 5) Số đếm trung bình 5,62 11,07 16 SD p 2,84 5,07 0,012 *Thuật toán One way ANOVA 3.3 Kết tác dụng kháng ung thư phức hợp 131 I- nimotuzumab thể động vật mang ung thư 3.3.1 Thể tích khối u chuột thí nghiệm tuần điều trị Biểu đồ 3.6: Thể tích trung bình khới u chuột tuần điều trị Thể tích trung bình khới u nhóm chuột sau tuần điều trị tăng dần lên nhiên nhóm chứng tích khới u tăng nhanh và cao cịn nhóm điều trị 131 I-Nimotuzumab tích khới u tăng chậm, thấp Từ tuần thứ đến tuần thứ 8: nhóm chuột điều trị 131 I-Nimotuzumab tích trung bình khới u nhỏ nhóm chứng; có khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 3.3.2 Đánh giá khối lượng chuột thí nghiệm sau điều trị 17 Biểu đồ 3.7: Khới lượng chuột nhóm sau tuần điều trị Khới lượng trung bình nhóm chuột điều trị 131 I- nimotuzumab thấp so với hai nhóm chuột cịn lại, với p > 0,05 3.3.3 Thời gian sống trung bình nhóm chuột điều trị Bảng 3.24: Thời gian sống sót trung bình nhóm chuột Nhóm chuột điều trị Thời gian sống sót % Số chuột sống trung bình NaCl 0,9% 99,6 50 I-nimotuzumab 110,8 90 Nimotuzumab 109,6 90 131 p < 0,05 Thời gian sống trung bình nhóm chứng (99,6 ngày) thấp nhóm chuột điều trị 131I-Nimotuzumab (110,8 ngày) Với p < 0,05 cho thấy có khác biệt phác đồ điều trị có có ý nghĩa thơng kê * Sử dụng kiểm định LOG RANK CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Tác dụng kháng tế bào Hep-2 131I-Nimotuzumab in vitro 4.1.1 Khả ức chế tế bào Hep-2 qua thử nghiệm MTT Với thử nghiệm MTT nhằm tính nồng độ ức chế 50% Nimotuzumab đơn và phức hợp 131 I-Nimotuzumab với tế bào Hep-2 Kết cho thấy IC50 Nimotuzumab và phức hợp 131INimotuzumab là 0,004mmol/l và 0,0039mmol/l Như kết hợp 131I với Nimotuzumab có xu hướng làm tăng khả ức chế tế bào Hep-2 phát triển so với sử dụng Nimotuzumab đơn Mặc dù khác biệt này chưa lớn và chưa có ý nghĩa thớng kê, 18 thấy dấu hiệu tích cực tăng hiệu điều trị ung thư có phối hợp hai yếu tố kể điều kiện in vitro 4.1.2 Bước đầu xác định chế gây chết tế bào Hep-2 theo đường apoptosis Chúng tiến hành đánh giá khả gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) phức hợp 131 I-Nimotuzumab so sánh với chất đơn lẻ và nhóm khơng dùng th́c (nhóm chứng) dịng tế bào Hep-2 nuôi cấy thời điểm 24 giờ, 48 giờ, và 72 131 sau thử thuốc Kết cho thấy sử dụng phức hợp I- Nimotuzumab làm tăng tỉ lệ apoptosis tế bào Hep-2 so với nhóm chứng không dùng thuốc (chỉ dùng NaCl 0,9%) và với 131 I Nimotuzumab đơn thời điểm 24 và 72 Ở thời điểm 48 phức hợp 131 I-Nimotuzumab có hiệu gây chết tế bào theo chương trình thấp Nimotuzumab cao 131 I và nhóm chứng khơng dùng chất thử nào, nhiên khác biệt chưa có ý nghĩa thớng kê 4.2 Sự phân bố 131 I-nimotuzumab chuột mang khối ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ người dòng Hep-2 4.2.1 Phân bố sinh học 131I-Nimotuzumab tạng chuột Phân bố sinh học phức hợp 131I-Nimotuzumab mô và quan và khối u xác định phương pháp đếm xung tia gamma thời điểm 24, 48 và 72 sau tiêm Kết mô và quan ngoài khối u cho thấy 131 I- nimotuzumab phân bố cao máu, và gần tương đương mô và quan khác, thấp và có xu hướng giảm dần theo thời gian khảo sát Trong nghiên cứu này chúng tơi cịn tiến hành khảo sát phân bố 131 I- nimotuzumab mô và quan chuột thí nghiệm, cụ thể tỷ sớ đếm xung tia gamma cao thời điểm 48 và trì mức 19 cao đến 72 sau tiêm Khi so sánh tỷ số đếm xung tia gamma khối u và quan khác với máu, kết cho thấy thời điểm 48 và 72 tỷ số đếm u là cao so với mô khác Từ kết cho thấy, 131 I- nimotuzumab phân bố tập tập trung và gắn đặc hiệu vào vị trí có khối ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ, đào thải nhanh chóng khỏi quan khác thể sau tiêm 4.2.2 Sử dụng SPECT đánh giá phân bố sinh học 131 I- Nimotuzumab chuột Đánh giá phân bố 131 I-nimotuzumab khối u so với vùng đầu chuột phương pháp chụp xạ hình SPECT để làm rõ hiệu gắn đặc hiệu phức hợp này khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ người thời điểm sau tiêm 24, 48 và 72 Kết cho thấy phức hợp phân bố mật độ cao khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ ba thời điểm thực nghiệm, với hoạt độ trung bình tập trung tia xạ vùng u cao vùng đầu (vùng thể không mang khới u) Trong khác biệt lớn thấy thời điểm 24 giờ, và trì khác biệt có ý nghĩa thớng kê là đến 72 sau tiêm Đến có câu hỏi đặt ra: phức hợp 131 I- nimotuzumab tập trung bề mặt khối u hay vào sâu khới u Vì phức hợp này đưa càng sâu khới u làm cho sớ lượng tế bào ung thư sớng sót càng giảm Trên chuột có vùng diện tích vùng khoảng 250 - 300 pixel: vùng đặt vị trí đầu cổ, vùng là khối u chuột và máy xạ hình SPECT chụp bề mặt vị trí này dùng phần mềm tính mật độ trung bình tập trung hoạt độ tia xạ Vậy chụp xạ hình SPECT đo và tính được độ tập trung phóng xạ bề mặt vị trí này Vì đã biết ưu và nhược điểm phương pháp này nên phẫu tích chuột 20 để đánh giá phân bố sinh học phức hợp 131 I-Nimotuzumab mô, quan và khối u chuột, khơng lấy khới u mà cắt lấy vị trí trung tâm khối u để đưa vào ống eppendrof đếm hoạt độ tia gamma Kết cho thấy phức hợp 131 I-Nimotuzumab đã tập trung đến u cao mơ và quan khác thể chuột có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 thời điểm 48 và 72 Qua nhận thấy 131 I-Nimotuzumab không tập trung bề mặt khới u mà cịn xun sâu vào tổ chức khối u Hiệu phương pháp điều trị kháng thể đơn dịng có gắn đồng vị phóng xạ ( 131Inimotuzumab) có tiềm và hứa hẹn hiệu cao ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ 4.3 Hiệu điều trị 131 I-nimotuzumab chuột mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ người 4.3.1 Phức hợp 131 I-nimotuzumab có tác dụng hạn chế phát triển khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ người Để đánh giá tác dụng kháng ung thư 131 I-Nimotuzumab tiến hành đo thể tích khới u nhóm chuột sau tiêm liều 131 I-Nimotuzumab, đồng thời có so sánh nhóm chuột tiêm Nimotuzumab đơn và nhóm chuột tiêm NaCl 0,9% (nhóm chứng) thời điểm khác sau tiêm Kết cho thấy thời điểm tuần tiêm, thể tích khới u nhóm chuột là tương đương và khơng có khác biệt, khơng có ý nghĩa thớng kê Tuy nhiên đến tuần thứ hai sau tiêm, thể tích khới u nhóm chuột tiêm 131I-Nimotuzumab nhỏ có ý nghĩa thớng kê (p < 0,05) so với nhóm chứng Trong thể tích trung bình khới u nhóm chuột tiêm Nimotuzumab nhỏ nhóm chứng khơng có khác biệt, khơng có ý nghĩa thớng kê hai nhóm này, khơng có khác biệt nhóm tiêm 131 I-Nimotuzumab và 21 nhóm tiêm Nimotuzumab Tiếp tục theo dõi thời điểm sau cho thấy nhóm điều trị 131I-Nimotuzumab tích trung bình khới u nhỏ có ý nghĩa thớng kê so với nhóm chứng hầu hết thời điểm theo dõi tuần thứ tám (với p < 0,05 - 0,01), khơng có khác biệt, khơng có ý nghĩa thớng kê nhóm cịn lại (khi so sánh nhóm 131 I-Nimotuzumab với Nimotuzumab và nhóm Nimotuzumab với nhóm chứng) Kết cho thấy thời điểm tuần sau tiêm, thể tích trung bình khới u nhóm chuột điều trị 131 I-Nimotuzumab nhỏ nhóm chứng (nhóm tiêm NaCl 0,9%) có khác biệt có ý nghĩa thớng kê (p = 0,021) so với nhóm chứng Trong thể tích trung bình khới u nhóm chuột tiêm Nimotuzumab nhỏ nhóm chứng khơng có khác biệt, khơng có ý nghĩa thớng kê hai nhóm này, khơng có khác biệt nhóm tiêm 131 I-Nimotuzumab và nhóm tiêm Nimotuzumab Tiếp tục theo dõi thời điểm sau cho thấy nhóm điều trị 131 I-Nimotuzumab tích trung bình khới u nhỏ có ý nghĩa thớng kê so với nhóm chứng hầu hết thời điểm theo dõi tuần thứ tám (với p < 0,01 - 0,008) Tơi khơng thấy có khác biệt, khơng có ý nghĩa thớng kê nhóm 131 I-Nimotuzumab với Nimotuzumab Khi so sánh thể tích trung bình khới u từ tuần đầu đến hết tuần năm nhóm chuột điều trị Nimotuzumab đơn so với nhóm chứng khơng thấy có khác biệt Mặc dù thể tích trung bình khới u đo tất nhóm chuột thí nghiệm tăng qua thời điểm theo dõi, tăng dần kích thước khới u chuột thí nghiệm, thơng qua đo thể tích khới u nhóm chuột, là khơng giớng so sánh thời điểm Ở thời điểm tương ứng kết thể tích 22 trung bình khới u nhóm chuột điều trị 131I-Nimotuzumab nhỏ rõ rệt so với nhóm chứng (có ý nghĩa thớng kê) và nhỏ so với nhóm điều trị chế phẩm Nimotuzumab đơn Điều này thể rõ thơng qua biểu đồ biến đổi thể tích trung bình khới u nhóm chuột chứng khơng điều trị (chỉ tiêm dung dịch NaCl 0,9%) từ thể tích khới u trung bình nhóm này ngày đầu theo dõi là 79,78 mm3 đã tăng lên 819,91 mm3 thời điểm sau tuần theo dõi Trong nhóm chuột điều trị 131 I-Nimotuzumab ngày đầu theo dõi tích khới u tương đương với nhóm chứng là 80,6 mm tăng lên dần qua thời điểm theo dõi chậm so với nhóm chuột chứng với thể tích khới u trung bình sau tuần điều trị và theo dõi là 438,72 mm3 4.3.2 Phức hợp 131 I-nimotuzumab có tác dụng kéo dài thời gian sống chuột mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ người Tác dụng 131 I-Nimotuzumab cịn đánh giá thơng qua thời gian sớng trung bình và tỉ lệ sớng sót so sánh với nhóm chứng Chúng tơi đã tiến hành theo dõi và phân tích sớ hai nhóm chuột tham gia nghiên cứu Kết cho thấy nhóm chuột điều trị 131I-Nimotuzumab có thời gian sớng trung bình là 110,8 ngày; cao có ý nghĩa thớng kê so với nhóm chứng, với thời gian sớng sót trung bình là 99,6 ngày (với p = 0,043) Đồng thời tỉ lệ sớng sót tính đến thời điểm thời gian sớng trung bình nhóm điều trị 131 I-Nimotuzumab là 0,9 cao so với nhóm chứng, với tỉ lệ sớng sót là 0,5 Ngoài thời gian sớng trung bình nhóm chuột điều trị 131 I-nimotuzumab (110,8 ngày) dài so nhóm chuột điều trị Nimotuzumab đơn (109,6 ngày) Việc kết hợp 131 I và Nimotuzumab đã chứng minh hiệu bước đầu điều trị ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ người 23 mơ hình động vật Vậy phức hợp 131 I-Nimotuzumab đã Viện nghiên cứu y học hạt nhân, Đà Lạt - Việt Nam sản xuất Nghiên cứu đã mở triển vọng điều trị ung thư biểu mơ vảy đầu cổ và khới u có tăng biểu EGFR Kết nghiên cứu là sở quan trọng cho bước nghiên cứu để ứng dụng phức hợp 131I-Nimotuzumab điều trị khối ung thư đầu cổ lâm sàng KẾT LUẬN Tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu mơ vảy đầu cổ người dịng Hep-2 phức hợp 131I-nimotuzumab in vitro - Tìm liều IC50 sau 48 với Nimotuzumab đơn là 0,004mmol/l, phức hợp 131 I-nimotuzumab là 0,0039mmol/l, dòng tế bào ung thư biểu mô vảy đầu cổ người Hep-2 - Tỷ lệ % tế bào Hep-2 chết theo chương trình (apoptosis) tiếp xúc với chế phẩm 131 I-Nimotuzumab sau thời điểm theo dõi 24, 48 ,72 là 9,7%; 7,4%; 8,2% cao nhóm chứng là 4,06%; 4,06%; 4,0% và cao nhóm tiếp xúc với chế phẩm Nimotuzumab 6,56%; 8,6%; 8,2% thời điểm Sự phân bố tác dụng điều trị ung thư phức hợp 131 I- nimotuzumab chuột thí nghiệm - Sự phân bố tốt phức hợp 131I-nimotuzumab chuột: + Chế phẩm 131 I-Nimotuzumab có phân bớ tương đối đồng khối u và mô, quan khác thể chuột 24 sau tiêm Chế phẩm sau tập trung khới u với hoạt độ trung bình tăng dần thời điểm 48, 72 sau tiêm và cao nhiều so với mô, quan khác thể; cách đếm xung tia gamma, tỷ lệ % số đếm xung tia gamma khối u theo thời gian là 41,08%; 79,62% và cao tỷ lệ tương ứng quan 24 khác, cao là phổi 25,25%; 40,21% và thấp là 7,42%; 10,3% + Hoạt độ tia xạ chụp xạ hình SPECT khới u cao vùng đầu cổ thời điểm 24, 48 và 72 sau tiêm phức hợp 131 I- nimotuzumab có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 - Tác dụng điều trị ung thư phức hợp 131I-nimotuzumab: + Chế phẩm 131I-Nimotuzumab có tác dụng kháng ung thư biểu mơ vảy đầu cổ người dịng Hep-2 chuột thể hiện: làm chậm q trình phát triển khới u cách rõ rệt so với nhóm chứng, cụ thể: thể tích trung bình khới u ngày đầu điều trị là 80,6 mm tăng lên 438,72 mm3 sau tuần điều trị và nhỏ so với nhóm chứng tích trung bình khới u ngày đầu là 79,78 mm đã tăng lên 819,91 mm3 thời điểm, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p