3.1.1. Xác định hoạt độ enzym
Cân chính xác được 2,2 mg enzym rắn hòa tan vào 3ml đệm borat được dung dịch enzym D1. Pha loãng D1 hai lần được dung dịch D2.Xác định hoạt độ của dung dịch enzym D2.
Kết quả: ΔA = 1,258
Hoạt độ của dung dịch enzym D2 là:
Hoạt độ của enzym rắn là:
3.1.2. Lựa chọn nồng độ enzym
Cố định nồng độ cơ chất ở 536µM. Pha loãng enzym ra thành 5 nồng độ khác nhau là D1=5032U/ml, D2=2516U/ml, D3=1258U/ml, D4=629U/ml và D5=314,5U/ml. Tiến hành đo để lựa chọn nồng độ enzym tối ưu. Kết quả phép đo được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 5 nồng độ enzym Thời gian (phút) D1 D2 D3 D4 D5 0,5 0,120 0,072 0,039 0,055 0,042 1,0 0,348 0,165 0,060 0,057 0,048 1,5 0,642 0,327 0,088 0,064 0,054 2,0 0,998 0,430 0,122 0,076 0,059 2,5 0,595 0,148 0,090 0,069 3,0 0,717 0,175 0,106 0,079 3,5 0,858 0,209 0,123 0,088 4,0 1,013 0,254 0,141 0,097 4,5 1,110 0,290 0,161 0,106 5,0 1,258 0,344 0,181 0,116 5,5 0,395 0,198 0,127 6,0 0,435 0,222 0,138 6,5 0,466 0,242 0,152 7,0 0,511 0,265 0,172 7,5 0,565 0,284 0,186 8,0 0,632 0,305 0,194 8,5 0,692 0,324 0,206 9,0 0,723 0,342 0,219 9,5 0,754 0,364 0,231 10,0 0,792 0,380 0,251 10,5 0,841 0,399 0,263 11,0 0,893 0,417 0,268 11,5 0,933 0,435 0,278 12,0 0,955 0,454 0,289 12,5 0,471 0,304 13,0 0,488 0,316 13,5 0,507 0,325
14,0 0,526 0,336
14,5 0,546 0,346
15,0 0,564 0,360
Chú thích: Trong các ô , giá trị độ hấp thụ nằm trong khoảng tuân theo định luật Lambert – Beer.
Nhận xét: Ở nồng độ D1 và D2, độ hấp thụ tăng lên quá nhanh, khoảng tuân theo định luật Lambert – Beer ngắn nên không chọn 2 nồng độ này. Ở nồng độ D5 độ hấp thụ tăng quá chậm, enzym hoạt động yếu nên cũng không chọn nồng độ này.
Có thể chọn nồng độ D3 hoặc D4.
Nếu chọn nồng độ enzym cao hơn (D3) thì lượng chất ức chế cũng phải cần nhiều hơn. Trong nghiên cứu này,chất ức chế là dịch chiết thực vật chứ chưa phải là chất tinh khiết, nếu lượng dịch chiết nhiều thì dung dịch sẽ có màu, đo quang sẽ không ổn định ở bước sóng 234nm. Do đó chúng tôi chọn nồng độ D4=629U/ml để khảo sát các điều kiện thí nghiệm tiếp theo.
3.1.3. Lựa chọn nồng độ cơ chất
Cố định nồng độ enzym là D4=629U/ml. Pha loãng cơ chất ra thành 6 dung dịch với các nồng độ: C1=536µM, C2=268µM, C3=134µM, C4=67µM, C5=33,5µM và C6=16,75µM. Tiến hành đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 6 nồng độ cơ chất. Kết quả đo được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 6 nồng độ cơ chất Thời gian (phút) C1 C2 C3 C4 C5 C6 0,5 0,055 0,057 0,059 0,058 0,055 0,059 1,0 0,057 0,067 0,069 0,070 0,066 0,079 1,5 0,064 0,076 0,086 0,086 0,080 0,098 2,0 0,076 0,084 0,095 0,098 0,097 0,122 2,5 0,090 0,090 0,109 0,118 0,125 0,142 3,0 0,106 0,108 0,123 0,131 0,145 0,157 3,5 0,123 0,133 0,138 0,157 0,162 0,167 4,0 0,141 0,151 0,159 0,184 0,179 0,186 4,5 0,161 0,171 0,177 0,207 0,198 0,198 5,0 0,181 0,195 0,197 0,233 0,212 0,210 5,5 0,198 0,213 0,211 0,264 0,252 0,225 6,0 0,222 0,233 0,233 0,302 0,285 0,238 6,5 0,242 0,249 0,256 0,337 0,309 0,256 7,0 0,265 0,272 0,276 0,372 0,337 0,271 7,5 0,284 0,292 0,297 0,390 0,356 0,289 8,0 0,305 0,318 0320 0,417 0,379 0,313 8,5 0,324 0,338 0,342 0,445 0,405 0,330 9,0 0,342 0,362 0,361 0,476 0,441 0,343 9,5 0,364 0,382 0,381 0,506 0,464 0,358 10,0 0,380 0,407 0,406 0,538 0,494 0,373 10,5 0,399 0,425 0,428 0,557 0,509 0,386 11,0 0,417 0,447 0,446 0,578 0,527 0,398 11,5 0,435 0,467 0,464 0,610 0,546 0,410 12,0 0,454 0,488 0,487 0,641 0,564 0,423 12,5 0,471 0,512 0,504 0,663 0,588 0,433 13,0 0,488 0,532 0,532 0,691 0,610 0,447 13,5 0,507 0,554 0,549 0,712 0,627 0,459 14,0 0,526 0,575 0,572 0,751 0,651 0,470 14,5 0,546 0,588 0,593 0,777 0,670 0,480 15,0 0,564 0,620 0,610 0,806 0,697 0,492 15,5 0,581 0,636 0,636 0,825 0,709 0,502 16,0 0,599 0,660 0,660 0,847 0,729 0,513 16,5 0,621 0,669 0,679 0,864 0,746 0,524 17,0 0,643 0,694 0,705 0,887 0,762 0,534 17,5 0,660 0,708 0,734 0,911 0,773 0,543 18,0 0,677 0,727 0,752 0,934 0,790 0,552
Chú thích: Trong các ô , giá trị độ hấp thụ nằm trong khoảng tuân theo định luật Lambert – Beer.
Nhận xét: Xét khoảng thời gian từ 5 phút đến 18 phút ( khoảng thời gian mà hầuhết các giá trị độ hấp thụ nằm trong khoảng tuân theo định luật Lambert – Beer 0,2 – 0,8). Thử bắt đầu từ nồng độ cơ chất thấp nhất C6 và tăng dần nồng độ cơ chất lên C5, C4, C3, C2, C1. Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở nồng độ C6 là thấp nhất, độ hấp thụ tăng dần khi tăng dần nồng độ lên C5, C4 và độ hấp thụ không tăng thêm nữa khi tăng nồng độ lên C3, C2, C1. Như vậyở nồng độ enzym D4 = 629U/ml, khi nồng độ cơ chất ≥ C4 = 67µM thì thí nghiệm ở trạng thái bão hòa cơ chất.
Kết luận: Chọn nồng độ cơ chất C4 = 67µM.
3.1.4. Lựa chọn thời gian ủ
Cố định nồng độ enzym là D4=629U/ml và nồng độ cơ chất là C4=67µM. Tiến hành đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng trong 15 phút. Kết quả đo được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng theo thời gian ủ Thời gian (phút) A thử A trắng 1 0,085 2 0,130 3 0,185 4 0,238 5 0,293 6 0,349 7 0,405 8 0,459 9 0,512 10 0,564 11 0,614 12 0,662 13 0,710 14 0,755 15 0,780
Nhận xét: Tại thời điểm 8 phút, A thử A trắng = 0,459 gần với giá trị 0,435 nhất. Vì vậy chúng tôi lựa chọn thời gian ủ là 8 phút.
Kết luận:Sau khi khảo sát, chúng tôi đã xác định được hoạt độ enzym rắn là 6862U/mg. Chúng tôi đã lựa chọn được các điều kiện nghiên cứu như sau: Nồng độ enzym là D4=629U/ml, nồng độ cơ chất là C4=67µM, thời gian ủ là 8 phút. Các điều kiện nghiên cứu này được áp dụng cho toàn bộnghiên cứu phía sau.
3.2. Khảo sát tương tác enzym – chất ức chế
Kết quả khảo sát tương tác enzym – chất ức chế được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tương tác enzym – chất ức chế STT Chất ức chế ΔA thử ΔA trắng Kết luận
1 Rutin 0,094 0,023 Có tương tác 2 Chè dây 0,139 Có tương tác 3 Dâu tằm 0,116 Có tương tác 4 Lá móng 0,073 Có tương tác
5 Kim ngân 0,056 Có tương tác 6 Cườm rụng 0,147 Có tương tác
7 Cúc áo 0,082 Có tương tác
8 Mã đề 0,072 Có tương tác
9 Xạ đen 0,035 Có tương tác
Kết luận: Enzym kết hợp với các chất ức chế đều tạo thành sản phẩm hấp thụ ánh sáng ở 234nm. Do đómô hình sử dụng để thử tác dụng ức chế LOX của các mẫu nghiên cứu sẽ là mô hình 6 cuvet.
3.3. Thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu theo mô hình 6 cuvet
Kết quả thử tác dụng ức chế LOX của các mẫu nghiên cứu theo mô hình 6 cuvet được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của các mẫu nghiên cứu STT Chất ức chế trắng ΔA 5 Nồng độ chất ức chế (mg/ml) 6 7 8 9 10 1 Rutin 0,459 ΔAthử1 0,242 ΔAthử2 0,094 % ƯC 67,8 2 Chè dây 0,459 ΔAthử1 0,192 0,154 ΔAthử2 0,139 0,154 % ƯC 88,5 100
3 Dâu tằm 0,460 ΔAthử1 0,369 0,359 0,275 0,239 0,236 0,188 ΔAthử2 0,116 0,117 0,124 0,128 0,128 0,133
% ƯC 45,0 47,3 67,1 75,9 76,5 88,0 4 Lá móng 0,451 ΔAthử1 0,388 0,383 0,379 0,298 0,292 0,249 ΔAthử2 0,073 0,073 0,097 0,107 0,108 0,116 % ƯC 30,2 31,3 37,5 57,6 59,2 70,5 5 Kim ngân 0,459 ΔAthử1 0,339 0,331 0,305 0,284 0,258 0,206 ΔAthử2 0,056 0,056 0,057 0,058 0,059 0,061 % ƯC 38,3 40,1 45,9 50,8 56,6 68,4 6 Cườm rụng 0,446 ΔAthử1 0,481 0,478 0,449 0,445 0,440 0,351 ΔAthử2 0,147 0,147 0,166 0,167 0,168 0,188 % ƯC 25,1 25,8 36,5 37,7 39,0 63,5 7 Cúc áo 0,450 ΔAthử1 0,438 0,433 0,433 0,424 0,423 0,422 ΔAthử2 0,082 0,082 0,083 0,105 0,105 0,105 % ƯC 20,9 22,0 22,2 29,1 29,3 29,6 8 Mã đề 0,458 ΔAthử1 0,434 0,433 0,433 0,433 0,422 0,382 ΔAthử2 0,072 0,072 0,072 0,073 0,085 0,088 % ƯC 21,0 21,2 21,2 21,4 26,4 35,8 9 Xạ đen 0,448 ΔAthử1 0,447 0,446 0,440 0,440 0,437 0,411 ΔAthử2 0,035 0,035 0,063 0,063 0,064 0,067 % ƯC 8,0 8,3 14,7 14,7 16,7 23,2
Khả năng ức chế LOX của chè dây ở nồng độ >5mg/ml rất mạnh nên chúng tôi thử thêm tác dụng ức chế LOX của chè dây ở các nồng độ từ 1mg/ml đến 4mg/ml. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của chè dây
Chất ức chế ΔAtrắng Nồng độ chất ức chế (mg/ml) 1 2 3 4 5 6 Chè dây 0,459 ΔAthử1 0,319 0,309 0,287 0,293 0,192 0,154 ΔAthử2 0,090 0,089 0,082 0,120 0,139 0,154 % ƯC 50,1 52,1 55,3 62,3 88,5 100 3.4. Bàn luận
3.4.1. Về mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang
- Ưu nhược điểm của mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang:
Ưu điểm: Mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang là một mô hình đơn giản và tiết kiệm, phù hợp với sàng lọc nhanh nhiều mẫu dược liệu để thuận lợi cho việc chọn lựa dược liệu có tác dụng mạnh cho các nghiên cứu phân lập ra hoạt chất có tác dụng ức chế LOX. Kết quả nghiên cứu cũng chính xác vì mô hình không máy móc áp dụng bất kì nghiên cứu nào mà khảo sát tất cả các yếu tố liên quan đến thí nghiệm như thời gian ủ, nồng độ enzym và cơ chất thích hợp, cũng như tương tác giữa enzym và chất ức chế nhằm đưa ra một điều kiện nghiên cứu thích hợp nhất. Đặc biệt mô hình này có khảo sát lại hoạt độ enzym, đây là một bước rất quan
trọng nhằm kiểm tra lại hoạt độ enzym vì có thể hoạt độ enzym thực tế không đúng như hoạt độ ghi trên nhãn sau quá trình vận chuyển, mở niêm phong, bảo quản.
Nhược điểm: Thiết bị sử dụng là Máy quang phổ Spectrophotometer U – 1900 UV/VIS model 3J0 – 0003 không có chức năng cố định nhiệt độ 25o
C trong buồng chứa cuvet. Mặc dù phòng thí nghiệm được điều hòa ở 25o
C tuy nhiên buồng chứa cuvet có thể nhiệt độ sẽ khác 25o
C trong quá trình máy vận hành. Mẫu nghiên cứu cũng không có chức năng chiếu hai tia sáng qua mẫu trắng và mẫu thử cùng lúc, mẫu trắng sau khi Autozero mới đo mẫu thử, chênh lệch thời gian đo 2 mẫu khoảng 5 giây.
- Về quá trình khảo sát các điều kiện nghiên cứu:
So sánh hoạt độ enzym xác địnhđược với hoạt độ ghi trên nhãn: Hoạt độ enzym ghi trên nhãn 221700U/mg. Sau khi khảo sát lại cho kết quả hoạt độ là 6862U/mg. Như vậy hoạt độ của enzym thực tế thấp hơn 32 lần so với hoạt độ ghi trên nhãn. Điều này có thể do quá trình vận chuyển, thời gian sử dụng, bảo quản làm hoạt độ của enzym giảm đi.
Về quá trình lựa chọn nồng độ enzym, có hai nồng độ có thể lựa chọn là D3=1258U/ml và D4=629U/ml. So với nồng độ D4, ở nồng độ D3, enzym hoạt động mạnh hơn nên thời gian ủ ngắn hơn. Thời gian ủ ngắn hơn sẽ chính xác hơn vì thời gian ủ tăng lên, hoạt độ của enzym dần giảm đi do môi trường thay đổi (sản phẩm liên tục được tạo ra) không còn là môi trường tối ưu cho enzym hoạt động.Như vậy nếu lựa chọn nồng độ D3 thì kết quả nghiên cứu sẽ chính xác hơn. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chất ức chế là dịch chiết thực vật chứ chưa phải là chất tinh khiết, nếu chọn nồng độ enzym cao hơn (D3) thì lượng chất ức chế cũng phải cần nhiều hơn, nếu lượng dịch chiết nhiều thì dung dịch sẽ có màu, đo quang sẽ không ổn định ở bước sóng 234 nm. Do đó nồng độ D4 đã được lựa chọn . Trong những nghiên cứu sau này,
khi đã phân lập ra được hoạt chất tinh khiết, có thể áp dụng mô hình với nồng độ enzym D3.
Về quá trình lựa chọn nồng độ cơ chất, theo lý thuyết, khi giữ nguyên nồng độ enzym và tăng dần nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ tăng dần, đến một nồng độ cơ chất nào đó sẽ có sự bão hòa cơ chất đối với enzym, tức là nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chấtthì tốc độ phản ứng không thể tăng lên nữa [11].Trong nghiên cứu này, khi tăng dần nồng độ cơ chất từ C6 lên C5, C4, tốc độ phản ứng tăng dần và đạt cực đại ở nồng độ C4. Khi đã bão hòa cơ chất, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng không những không tăng,mà còn giảm. Điều này có thểdo nồng độ cơ chất quá lớn so với nồng độ bão hòa enzym tạo nên một môi trường không phù hợp cho enzym hoạt động. Như vậy việc lựa chọn nồng độ cơ chất có 3 ưu điểm: Thứ nhất, tiết kiệm được cơ chất (vì lựa chọn được nồng độ cơ chất thấp nhất để ứng với nồng độ enzym đã lựa chọn thí nghiệm vẫn ở trạng thái bão hòa cơ chất). Thứ hai, khi đã bão hòa cơ chất lựa chọn được nồng độ bão hòa cơ chất mà môi trường phản ứng tạo ra là tối ưu cho enzym hoạt động. Thứ ba, tránh được việc khi nồng độ cơ chất quá cao enzym đã bị bất hoạt bởi chất ức chế lại trở nên có hoạt tính trở lại(Theo kết quả nghiên cứu về khả năng ức chế LOX của quercetin, ở một nồng độ cơ chất nhất định, enzym bị ức chế bới quercetin, nhưng khi tăng nồng độ cơ chất thì enzym lại có hoạt tính trở lại [62]). Khi đó, để ức chế được enzym sẽ cần một lượng dịch chiết nhiều hơn, dung dịch sẽ có màu, đo quang sẽ không ổn định ở bước sóng 234nm. Các nghiên cứu sau này có thể khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đối với khả năng ức chế LOX của chất ức chế.
- Về dung môi và pH của đệm:
Do điều kiện nghiên cứu có hạn, chúng tôi không khảo sát mà cố định đệm sử dụng là đệm borat pH9,0 . Theo như kết quả của các nghiên cứu khác,
có thêm 3 loại đệm có thể sử dụng là đệm phosphat pH9,0, đệm Tris-HCl pH8,5 và đệm Tris-buffer pH7,4 (xem tổng quan). Như vậy ở các nghiên cứu sau này, có thể khảo sát để chọn ra loại đệm tối ưu hòa tan enzym và cơ chất để enzym có hoạt tính tối đa. Đồng thời, dung môi chiết xuất dược liệu và dung môi hòa tan cắn chúng tôi đều sử dụng methanol. Theo như kết quả của các nghiên cứu khác (xem tổng quan), dung môi chiết xuất có thể là methanol, ethanol, ethyl acetat. Còn dung môi hòa tan cắn có thể là đệm borat pH9,0, đệm Tris-HCl pH8,5, đệm Tris-buffer pH7,4, DMSO, ethanol, methanol. Như vậy có thể tiếp tục nghiên cứu sàng lọc các dung môi để tìm được dung môi chiết xuất và hòa tan cắn sao cho tỷ lệ phần trăm ức chế LOX là lớn nhất.
3.4.2. Về kết quảthử tác dụng ức chế LOX của dược liệu
Cả 8 dược liệu đều có tác dụng ức chế LOX. Ở cùng một nồng độ dịch chiết, khả năng ức chế LOX của 8 dược liệu giảm dần theo thứ tự sau: Chè dây > dâu tằm > lá móng > kim ngân > cườm rụng > cúc áo > mã đề >xạ đen.
Chúng tôi chia 8 dược liệu thành 4 nhóm:
- Nhóm 1: khả năng ức chế rất mạnh: Chè dây (Ampelopsis cantoniensis
Planch.)
- Nhóm 2: khả năng ức chế mạnh: Dâu tằm(Morus alba L.)
- Nhóm 3: khả năng ức chế trung bình: Lá móng(Lawsonia inermis L.), kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), cườm rụng (Ehretia acuminata
P. Br.).
- Nhóm 4: khả năng ức chếyếu: cúc áo(Spilanthes acmella L. Murr.), mã đề (Plantago asiatica L.), xạ đen (Ehretia asperula Zoll. et Mor.).
Dịch chiết chè dây có khả năng ức chế LOX rất mạnh, mạnh hơn cả hoạt chất tinh khiết là rutin. Ở nồng độ 1mg/ml, dịch chiết chè dây ức chế trên 50% enzym và ở nồng độ ≥ 6 mg/ml thì ức chế 100% enzym. Nồng độ mà khả năng ức chế lipoxygenase trên 50% của dâu tằm là 6,5mg/ml, lá móng và
kim ngân là 8mg/ml, cườm rụng là 10mg/ml.Cúc áo, mã đề và xạ đen ở nồng độ 10mg/ml khả năng ức chế LOX vẫn < 50%.