Phương pháp thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu là phương pháp đo quang. Cắn dược liệu pha trong methanol là dung dịch chất ức chế cần thử. Sau khi khảo sát được tương tác enzym – chất ức chế theo phương pháp đã trình bày trong mục 2.3.3, việc thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu sẽ được lựa chọntừ một trong 2 mô hình sau:
2.3.4.1.Mô hình 4 cuvet
Mô hình 4 cuvet được áp dụng nếu enzym kết hợp với chất ức chế không tạo thành sản phẩm hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 234nm. 4 cuvet chứa: mẫu thử, mẫu trắng của thử, mẫu trắng và mẫu trắng của trắng.
- Mẫu thửbao gồm 875µl đệm borat, 100µl dung dịch enzym, 25µl dung dịch chất ức chế. Sau 5 phút, thêm 2ml dung dịch cơ chất.
- Mẫu trắng của thửbao gồm 975µl đệm borat, 25µl dung dịch chất ức chế và 2ml dung dịch cơ chất.
- Mẫu trắng bao gồm 900µl đệm borat, 100µl dung dịch enzym và 2ml dung dịch cơ chất.
- Mẫu trắng của trắng bao gồm 1ml đệm borat và 2ml dung dịch cơ chất.
Ở 25oC, đo độ hấp thụ tại bước sóng 234nm của mẫu thửso với mẫu
trắng của thử (ΔA thử), và độ hấp thụ của mẫu trắngso với mẫu trắng của trắng(ΔA trắng). Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình
2.3.4.2. Mô hình 6 cuvet
Mô hình 6 cuvet được áp dụng nếu enzym kết hợp với chất ức chế tạo thành sản phẩm hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 234nm. Khi đó độ hấp thụ của mẫu thử (gồm đệm borat, dung dịch enzym, dung dịch chất ức chế và dung dịch cơ chất) sẽ bằng tổng độ hấp thụ của hydroperoxide tạo thành trong phản ứng enzym – cơ chất và sản phẩm của tương tác enzym – chất ức chế.
6 cuvet chứa: mẫu thử 1, mẫu trắng của thử 1, mẫu thử 2, mẫu trắng của thử 2, mẫu trắng và mẫu trắng của trắng.
- Mẫu thử 1bao gồm 875µl đệm borat, 100µl dung dịch enzym, 25µl dung dịch chất ức chế. Sau 5 phút, thêm 2ml dung dịch cơ chất.
- Mẫu trắng của thử 1bao gồm 975µl đệm borat, 25µl dung dịch chất ức chế và 2ml dung dịch cơ chất.
- Mẫu thử 2 bao gồm 2875µl đệm borat, 100µl dung dịch enzym, 25µl dung dịch chất ức chế. Đợi 5 phút.
- Mẫu trắng của thử 2 bao gồm 2975µl đệm borat, 25µl dung dịch chất ức chế.
- Mẫu trắng bao gồm 900µl đệm borat, 100µl dung dịch enzym và 2ml dung dịch cơ chất.
- Mẫu trắng của trắng bao gồm 1ml đệm borat và 2ml dung dịch cơ chất.
Ở 25o
C, đo độ hấp thụ tại bước sóng 234nm của mẫu thử 1 so với mẫu
thử 2 (ΔA thử 2)và độ hấp thụ của mẫu trắngso với mẫu trắng của trắng(ΔA trắng). Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình.
Phần trăm ức chế được tính theo công thức:
Chú ý: ΔA trắng được xác định vào đầu và cuối mỗi buổi đo, kết quả phải giống nhau để đảm bảo hoạt độ enzym không thay đổi trong suốt quá trình thí nghiệm. Enzym đã pha chia nhỏ vào nhiều lọ nhỏ, bảo quản trong đá, khi nào dùng thì ngâm 1 lọ nhỏ vào nước 25o
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN