- Ưu nhược điểm của mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang:
Ưu điểm: Mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang là một mô hình đơn giản và tiết kiệm, phù hợp với sàng lọc nhanh nhiều mẫu dược liệu để thuận lợi cho việc chọn lựa dược liệu có tác dụng mạnh cho các nghiên cứu phân lập ra hoạt chất có tác dụng ức chế LOX. Kết quả nghiên cứu cũng chính xác vì mô hình không máy móc áp dụng bất kì nghiên cứu nào mà khảo sát tất cả các yếu tố liên quan đến thí nghiệm như thời gian ủ, nồng độ enzym và cơ chất thích hợp, cũng như tương tác giữa enzym và chất ức chế nhằm đưa ra một điều kiện nghiên cứu thích hợp nhất. Đặc biệt mô hình này có khảo sát lại hoạt độ enzym, đây là một bước rất quan
trọng nhằm kiểm tra lại hoạt độ enzym vì có thể hoạt độ enzym thực tế không đúng như hoạt độ ghi trên nhãn sau quá trình vận chuyển, mở niêm phong, bảo quản.
Nhược điểm: Thiết bị sử dụng là Máy quang phổ Spectrophotometer U – 1900 UV/VIS model 3J0 – 0003 không có chức năng cố định nhiệt độ 25o
C trong buồng chứa cuvet. Mặc dù phòng thí nghiệm được điều hòa ở 25o
C tuy nhiên buồng chứa cuvet có thể nhiệt độ sẽ khác 25o
C trong quá trình máy vận hành. Mẫu nghiên cứu cũng không có chức năng chiếu hai tia sáng qua mẫu trắng và mẫu thử cùng lúc, mẫu trắng sau khi Autozero mới đo mẫu thử, chênh lệch thời gian đo 2 mẫu khoảng 5 giây.
- Về quá trình khảo sát các điều kiện nghiên cứu:
So sánh hoạt độ enzym xác địnhđược với hoạt độ ghi trên nhãn: Hoạt độ enzym ghi trên nhãn 221700U/mg. Sau khi khảo sát lại cho kết quả hoạt độ là 6862U/mg. Như vậy hoạt độ của enzym thực tế thấp hơn 32 lần so với hoạt độ ghi trên nhãn. Điều này có thể do quá trình vận chuyển, thời gian sử dụng, bảo quản làm hoạt độ của enzym giảm đi.
Về quá trình lựa chọn nồng độ enzym, có hai nồng độ có thể lựa chọn là D3=1258U/ml và D4=629U/ml. So với nồng độ D4, ở nồng độ D3, enzym hoạt động mạnh hơn nên thời gian ủ ngắn hơn. Thời gian ủ ngắn hơn sẽ chính xác hơn vì thời gian ủ tăng lên, hoạt độ của enzym dần giảm đi do môi trường thay đổi (sản phẩm liên tục được tạo ra) không còn là môi trường tối ưu cho enzym hoạt động.Như vậy nếu lựa chọn nồng độ D3 thì kết quả nghiên cứu sẽ chính xác hơn. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chất ức chế là dịch chiết thực vật chứ chưa phải là chất tinh khiết, nếu chọn nồng độ enzym cao hơn (D3) thì lượng chất ức chế cũng phải cần nhiều hơn, nếu lượng dịch chiết nhiều thì dung dịch sẽ có màu, đo quang sẽ không ổn định ở bước sóng 234 nm. Do đó nồng độ D4 đã được lựa chọn . Trong những nghiên cứu sau này,
khi đã phân lập ra được hoạt chất tinh khiết, có thể áp dụng mô hình với nồng độ enzym D3.
Về quá trình lựa chọn nồng độ cơ chất, theo lý thuyết, khi giữ nguyên nồng độ enzym và tăng dần nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ tăng dần, đến một nồng độ cơ chất nào đó sẽ có sự bão hòa cơ chất đối với enzym, tức là nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chấtthì tốc độ phản ứng không thể tăng lên nữa [11].Trong nghiên cứu này, khi tăng dần nồng độ cơ chất từ C6 lên C5, C4, tốc độ phản ứng tăng dần và đạt cực đại ở nồng độ C4. Khi đã bão hòa cơ chất, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng không những không tăng,mà còn giảm. Điều này có thểdo nồng độ cơ chất quá lớn so với nồng độ bão hòa enzym tạo nên một môi trường không phù hợp cho enzym hoạt động. Như vậy việc lựa chọn nồng độ cơ chất có 3 ưu điểm: Thứ nhất, tiết kiệm được cơ chất (vì lựa chọn được nồng độ cơ chất thấp nhất để ứng với nồng độ enzym đã lựa chọn thí nghiệm vẫn ở trạng thái bão hòa cơ chất). Thứ hai, khi đã bão hòa cơ chất lựa chọn được nồng độ bão hòa cơ chất mà môi trường phản ứng tạo ra là tối ưu cho enzym hoạt động. Thứ ba, tránh được việc khi nồng độ cơ chất quá cao enzym đã bị bất hoạt bởi chất ức chế lại trở nên có hoạt tính trở lại(Theo kết quả nghiên cứu về khả năng ức chế LOX của quercetin, ở một nồng độ cơ chất nhất định, enzym bị ức chế bới quercetin, nhưng khi tăng nồng độ cơ chất thì enzym lại có hoạt tính trở lại [62]). Khi đó, để ức chế được enzym sẽ cần một lượng dịch chiết nhiều hơn, dung dịch sẽ có màu, đo quang sẽ không ổn định ở bước sóng 234nm. Các nghiên cứu sau này có thể khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đối với khả năng ức chế LOX của chất ức chế.
- Về dung môi và pH của đệm:
Do điều kiện nghiên cứu có hạn, chúng tôi không khảo sát mà cố định đệm sử dụng là đệm borat pH9,0 . Theo như kết quả của các nghiên cứu khác,
có thêm 3 loại đệm có thể sử dụng là đệm phosphat pH9,0, đệm Tris-HCl pH8,5 và đệm Tris-buffer pH7,4 (xem tổng quan). Như vậy ở các nghiên cứu sau này, có thể khảo sát để chọn ra loại đệm tối ưu hòa tan enzym và cơ chất để enzym có hoạt tính tối đa. Đồng thời, dung môi chiết xuất dược liệu và dung môi hòa tan cắn chúng tôi đều sử dụng methanol. Theo như kết quả của các nghiên cứu khác (xem tổng quan), dung môi chiết xuất có thể là methanol, ethanol, ethyl acetat. Còn dung môi hòa tan cắn có thể là đệm borat pH9,0, đệm Tris-HCl pH8,5, đệm Tris-buffer pH7,4, DMSO, ethanol, methanol. Như vậy có thể tiếp tục nghiên cứu sàng lọc các dung môi để tìm được dung môi chiết xuất và hòa tan cắn sao cho tỷ lệ phần trăm ức chế LOX là lớn nhất.
3.4.2. Về kết quảthử tác dụng ức chế LOX của dược liệu
Cả 8 dược liệu đều có tác dụng ức chế LOX. Ở cùng một nồng độ dịch chiết, khả năng ức chế LOX của 8 dược liệu giảm dần theo thứ tự sau: Chè dây > dâu tằm > lá móng > kim ngân > cườm rụng > cúc áo > mã đề >xạ đen.
Chúng tôi chia 8 dược liệu thành 4 nhóm:
- Nhóm 1: khả năng ức chế rất mạnh: Chè dây (Ampelopsis cantoniensis
Planch.)
- Nhóm 2: khả năng ức chế mạnh: Dâu tằm(Morus alba L.)
- Nhóm 3: khả năng ức chế trung bình: Lá móng(Lawsonia inermis L.), kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), cườm rụng (Ehretia acuminata
P. Br.).
- Nhóm 4: khả năng ức chếyếu: cúc áo(Spilanthes acmella L. Murr.), mã đề (Plantago asiatica L.), xạ đen (Ehretia asperula Zoll. et Mor.).
Dịch chiết chè dây có khả năng ức chế LOX rất mạnh, mạnh hơn cả hoạt chất tinh khiết là rutin. Ở nồng độ 1mg/ml, dịch chiết chè dây ức chế trên 50% enzym và ở nồng độ ≥ 6 mg/ml thì ức chế 100% enzym. Nồng độ mà khả năng ức chế lipoxygenase trên 50% của dâu tằm là 6,5mg/ml, lá móng và
kim ngân là 8mg/ml, cườm rụng là 10mg/ml.Cúc áo, mã đề và xạ đen ở nồng độ 10mg/ml khả năng ức chế LOX vẫn < 50%.
Khả năng ức chế LOX của cả 8 dược liệu đều phụ thuộc vào nồng độ. Khi nồng độ dịch chiết tăng thì khả năng ức chế cũng tăng, tuy nhiên lại không tăng theo một tỷ lệ nhất định.
Như vậy có thể thực hiện các nghiên cứu sâu hơn đối với chè dây và dâu tằm để phân lập ra hoạt chất có tác dụng ức chế LOX, thử tác dụng ức chế LOX của các bộ phận khác nhau của cây để tìm ra bộ phận có hàm lượng hoạt chất cao nhất. Bên cạnh đó, cần sàng lọc thêm nhiều dược liệu để chọn ra những dược liệu có khả năng ức chế LOX mạnh nhất trước khi tiến hành phân lập ra hoạt chất có tác dụng. Sau khi phân lập được hoạt chất, dung dịch hoạt chất có thể pha thành nhiều nồng độ rất gần nhau để từ đó vẽ đồ thị biểu diễn khả năng ức chế để xác định IC50, IC100 một cách chính xác nhất.
Chè dây có tác dụng ức chế LOX rất mạnh. Các nghiên cứu khác (xem tổng quan) đã chứng minh được rằng chè dây có khả năng chống oxy hóa mạnh và chống viêm tốt, là 2 tác dụng có được khi ức chế LOX. Như vậy tác dụng ức chế LOX rất mạnh của chè dây phù hợp với kết quả các nghiên cứu khác.
Dâu tằm có khả năng ức chế LOX mạnh, điều nàu cũng phù hợp với kết luận của các nghiên cứu trước đó rằng dâu tằm có tác dụng chống oxy hóa mạnh (xem tổng quan).
Xạ đen được biết đến như một vị thuốc điều trị ung thư hiệu quả (xem tổng quan). Tuy nhiên trong số 8 dược liệu trên, xạ đen có tác dụng ức chế LOX kém nhất. Như vậy tác dụng điều trị ung thư tốt của xạ đen chủ yếu là do các cơ chế khác.Các gốc tự do tạo ra trong quá trình peroxy hóa lipid là một trong những nguyên nhân gây ung thư. Có thể thực hiện thêm các nghiên cứu sau này để thử khả năng khử các gốc tự do của xạ đen.
Cùng thuộc họ Vòi Voi (Boraginaceae) nhưng tác dụng ức chế LOX của cườm rụng tốt hơn hẳn xạ đen. Ở nồng độ 5mg/ml, phần trăm ức chế của Cườm Rụng là 25,1% gấp khoảng 3 lần của xạ đen là 8,0%. Như vậy mặc dù trong cùng chi nhưng loài khác nhau thì tác dụng ức chế LOX khác nhau.
Cúc áo có tác dụng chống viêm hiệu quả, đặc biệt là trong viêm răng. Tuy nhiên khả năng ức chế LOX của cúc áo yếu. Như vậy tác dụng chống viêm hiệu quả của cúc áo chủ yếu là do cơ chế khác ví dụ ức chế COX-2, cần tiến hành thêm các nghiên cứu thử tác dụng ức chế COX-2 của cúc áo.
Tác dụng ức chế LOX có thể liên quan đến thành phần flavonoid và tanin của dược liệu. Kết quả thử tác dụng ức chế LOX của 8 dược liệu cho thấy chè dây có tác dụng ức chế LOX rất mạnh phù hợp với việc lá chè dây có hàm lượng flavonoid và tanin cao, dâu tằm có khả năng ức chế LOX mạnh phù hợp với việc dâu tằm có đến 4 loại flavonoid và tanin. Trong thành phần của lá móng, kim ngân, cườm rụng - những dược liệu ức chế LOX trung bình cũng đều có flavonoid và tanin (xem tổng quan). Bên cạnh đó, Phần 1.1.5 tổng quan đã tổng hợp được các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên đã được chứng minh có tác dụng ức chế LOX. Trong đó, flavonoid và tanin chiếm đa số: Các flavonoid bao gồm rutin, quercetin, baicalein, esculetin, artemetin, casticin và tanin là epigallocatechin gallate. Như vậy, những nghiên cứu sau có thể định lượng hàm lượng flavonoid và tanin của 8 dược liệu để khẳng định xem tác dụng ức chế LOX có liên quan đến hàm lượng flavonoid và tannin trong dược liệu hay không. Nếu có, khi phân lập ra hoạt chất có tác dụng ức chế LOX sẽ theo chiều hướng phân lập ra các thành phần flavonoid và tanin trong dược liệu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
- Đã xây dựng được mô hình thử tác dụng ức chế enzym LOX – 1bằng phương pháp đo quang với các điều kiện nghiên cứu như sau: Nồng độ enzym LOX – 1 là 629 U/ml, nồng độ cơ chất acid linoleic là 67 µM, thời gian ủ là 8 phút, đo quang ở bước sóng 234 nm, điều kiện nhiệt độ 25o
C.
- Đã áp dụng mô hình thử tác dụng ức chế enzym LOX bằng phương pháp đo quang để thử tác dụng ức chế enzym LOX-1 của 9 mẫu nghiên cứu gồm: Rutin, chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.), dâu tằm (Morus alba
L.), lá móng (Lawsonia inermis L.), kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), cườm rụng (Ehretia acuminata P. Br.), cúc áo (Spilanthes acmella L. Murr.), mã đề (Plantago asiaticaL.), xạ đen (Ehretia asperula Zoll. et Mor).Xác định được khả năng ức chế LOX của các mẫu nghiên cứu ở 6 nồng độ 5, 6, 7, 8, 9, 10 mg/ml. Trong đó, ở nồng độ 5mg/ml, phần trăm ức chế LOX của rutin là 67,8%, của chè dây là 88,5%, của dâu tằm là 45,0%, của lá móng là 30,2%, của kim ngân là 38,3%, của cườm rụng là 25,1%, của cúc áo là 20,9%, của mã đề là 21,0%, và của xạ đen là 8,0%.
KIẾN NGHỊ
- Sử dụng máy quang phổ UV – VIS 2 chùm tia có chức năng kiểm soát nhiệt độ bên trong buồng đovới cuvet thạch anh hoặc máy quang phổ Elisa microplate reader với đĩa thạch anh để phép đo chính xác hơn.
- Phân lập ra hoạt chất có tác dụng ức chế LOX của chè dây và dâu tằm, thử với các bộ phận khác nhau của cây để tìm ra bộ phận có hàm lượng hoạt chất cao nhất. Bên cạnh đó, cần sàng lọc thêm nhiều cây thuốc để chọn ra những cây thuốc có khả năng ức chế LOX mạnh.
- Sử dụng dung môi chiết khác nhau (methanol, ethanol, ethyl acetat), dung môi hòa tan cắn khác nhau (đệm borat pH9,0, đệm Tris-HCl pH8,5, đệm Tris-buffer pH7,4, DMSO) và các loại đệm khác nhau (đệm borat pH9,0, đệm Tris-HCl pH8,5, đệm Tris-buffer pH7,4), từ đó chọn ra dung môi chiết, dung môi hòa tan cắn và đệm phù hợp để khả năng ức chế LOX là mạnh nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt:
1. Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc, NXB khoa học kỹ thuật, tập I, tr.423 – 425.
2. Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc, NXB khoa học kỹ thuật, tập II.
3. Nguyễn Thị Bình (2008), Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của lá và rễ cây lá móng (Lawsonia internis L.Họ Tử vi Lythcaceae), Luận án thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.51 – 52.
4. Nguyễn Minh Hằng (2006), “Ảnh hưởng của các phần chiết giàu flavonoid của hoa kim ngân lên hoạt độ peroxidase trong máu người và sự peroxy hóa lipid màng”,Tạp chí dược học, số 1, tr. 18 – 22.
5. Hoàng Quỳnh Hoa (2010), Nghiên cứu một số cây thuốc chi cườm rụng (Ehretia P.Br.), họ Vòi Voi (Boraginaceae) ở miền Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ dược học, tr.82 – 85.
6. Lưu Thị Diễm Hồng, Nguyễn Xuân Thắng (2005), “Tác dụng chống viêm của flavonoid cây kim ngân khi kết hợp với amylase”, Tạp chí dược học,số 3, tr. 8 – 11.
7. Ninh Ngọc Bảo Kim (2012), Cây thuốc người Dao Ba Vì,Quỹ Châu Á – Trung tâm môi trườngvà phát triển cộng đồng, tr. 90.
8. Đỗ Tất Lợi (2005), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB y học.
9. Trương Minh Lương, Nguyễn Thị Thu Hạnh (2009), “Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của thân và lá của cây kim ngân (Lonicera japonica
10. Vũ Thị Ngọc Thanh, Phan Thị Vân Anh và cs. (2005), “Bước đầu nghiên cứu tác dụng của flavonoid từ hoa kim ngân lên một số chỉ số lipid máu”, Tạp chí dược học, số 1, tr.15 – 18.
11. Nguyễn Xuân Thắng (2005), Hóa sinh học, NXB y học, tr. 139-140. 12. Phùng Thị Vinh (1995), Nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch., Vitaceae), Luận án phó tiến sỹ khoa học y dược, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Tiếng Anh:
13. Ali Shah S.M. et al. (2013), “Anti-lipoxygenase activity of some indigenous medical plants”, Journal of Medicinal Plants Reseach, 7(6), pp.219-222.
14. Axelrol B. et al.(1981), “Lipoxygenase from soybeans”, Methods in Enzymology, 71, pp.441-451.
15. Berger W. et al. (2007), “Zileuton: clinical implications of 5- lipoxygenase inhibition in severe airway disease”, International Journal of Clinical Practice, 61, pp.663-676.
16. Berkeley H. D., Galliard T. (1976), “Measurement of lipoxygenase activity in crude and partially purified potato extracts”, Phytochemistry, 15, pp.1475-1479.
17. Bhattacharjee Soumen (2007), “Reactive oxygen species and oxidative burst: roles in stress, senescence and signal transduction in plants”, Current science, 89(7), pp.1113 – 1121.
18. Caroline Charlier, Catherine Michaux (2003), “Dual inhibition of cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LOX) as a new strategy to
provide safer non-steroidal anti-inflammatory drugs”, European Journal of Medicinal Chemistry, 38, pp.645-659.
19. Cayman Chemical Company (2011), Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay Kit, Item No. 760700, pp5.
20. Choudhary M.I. et al. (2009), “Antiinflammatory and lipoxygenase inhibitory compounds from Vitex agnus castus”, Phytotherapy Reseach,