Chúng tôi tiến hành khảo sát để lựa chọn điều kiện thí nghiệm bao gồm: xác định lại hoạt độ enzym, lựa chọn nồng độ enzym, lựa chọn nồng độ cơ chất và lựa chọn thời gian ủ.
2.3.2.1.Chuẩn bị hóa chất A. Đệm borat 200mM, pH 9,0
- Pha NaOH1M: cân khoảng 2g NaOH hòa tan trong vừa đủ 50ml nước cất 2 lần
- Cân chính xác khoảng 6,183g acid boric hòa tan trong ≈ 500ml nước cất 2 lần, điều chỉnh đến pH 9,0 bằng NaOH 1M vừa pha, bổ sung nước cất 2 lần vừa đủ 500ml.
B. Ethyl alcohol 95% (v/v)
Thêm nước cất 2 lần vào ethyl alcohol tuyệt đối đến khi cồn kế chỉ 95%
C. Dung dịch acid linoleic
Phối hợp 0,05ml ethyl alcohol 95% và 0,05ml acid linoleic, thêm từ từ đệm borat đến vừa đủ 50ml. Lắc ở máy vortex đến đồng nhất. Lấy 5ml dung dịch này thêm 20ml đệm borat và 5,0ml nước cất 2 lần được dung dịch acid linoleic có nồng độ 536µM
Chuẩn bị dung dịch enzyme khoảng 2000 – 5000U/ml bằng cách cân chính xác khoảng 2 mg enzym rắn rồi hòa tan enzyme rắn trong đệm borat.
2.3.2.2.Tiến hành khảo sát các điều kiện nghiên cứu
Phương pháp chung: Phương pháp đo quang. Phản ứng thực hiện trong cuvet. Có 2 cuvet: cuvet chứa mẫu thử và cuvet chứa mẫu trắng. Mẫu thử bao gồm 900µl đệm borat, 2ml dung dịch cơ chất, 100µl dung dịch enzym. Mẫu trắng bao gồm 1ml đệm borat và 2ml dung dịch cơ chất. Ở 25o
C, đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắngtại bước sóng 234nm.
a. Phương pháp xác định hoạt độ enzym
Chúng tôi sử dụng nồng độ cơ chất là 536µM và nồng độ enzyme ≈ 2000 – 5000U/ml. Đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng tại thời điểm 5 phút. Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình.
Đơn vị hoạt độ enzym là unit (U). Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng tăng lên mỗi phút là 0,001 tương ứng với 1 unit enzym.
Hoạt độ của dung dịch enzym được tính theo công thức:
Trong đó:
ΔA là độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng . df là độ pha loãng.
0,001 là độ hấp thụ tăng lên mỗi phút tương ứng với 1 unit enzym. 5 là 5 phút.
Hoạt độ của enzym rắn được tính theo công thức:
Trong đó:
Units/ml là hoạt độ của dung dịch enzym Units/mg là hoạt độ của enzym rắn.
mg/ml là nồng độ của dung dịch enzym rắn trong đệm borat.
b. Phương pháp lựa chọn nồng độ enzym
Cố định nồng độ cơ chất là 536µM. Với hoạt độ enzym đã xác định được ở mục 2.3.2.2a, pha loãng enzym ra thành 5 nồng độ khác nhau khoảng D1=5000U/ml, D2=2500U/ml, D3=1250U/ml, D4= 625U/ml và D5=312U/ml.Đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng. Ngừng đo khi giá trị độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng lớn hơn 0,9 hoặc sau thời gian 15phút.Cứ 30 giây đọc 1 lần. Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình.
Lựa chọn nồng độ enzym phù hợp để khoảng thời gian độ hấp thụ nằm nằm trong khoảng tuân theo định luật Lambert – Beer (0,2 – 0,8 và càng gần 0,435 càng tốt) không quá ngắn (enzym hoạt động quá mạnh) cũng không quá dài (enzym hoạt động quá yếu).
c. Phương pháp lựa chọn nồng độ cơ chất
Cố định nồng độ enzym đã lựa chọn ở mục 2.3.2.2 b. Pha loãng cơ chất ra thành 6 nồng độ C1= 536µM,C2= 268µM, C3=134µM, C4=67µM, C5=33,5µM và C6=16,75µM. Đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng trong 18 phút, cứ 30 giây đọc 1 lần. Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình.
Lựa chọn nồng độ cơ chất thấp nhất để với nồng độ enzym vừa lựa chọn ở mục 2.3.2.2 b thì thí nghiệm ở trạng thái bão hòa cơ chất.
d. Phương pháp lựa chọn thời gian ủ
Với nồng độ enzym đã lựa chọn ở mục 2.3.2.2 b và nồng độ cơ chất đã lựa chọn ở mục 2.3.2.2 c, đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng trong 15 phút, cứ 1 phút đọc 1 lần. Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình.
Chọn thời gian ủ phù hợp để độ hấp thụ nằm trong khoảng tuân theo định luật Lambert – Beer (0,2 – 0,8 và càng gần 0,435 càng tốt)
Sau khi khảo sát, hoạt độ enzym đã được xác định, lựa chọn được các điều kiện nghiên cứu bao gồm nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, thời gian ủ và áp dụng cho các nghiên cứu sàng lọc tiếp theo.