Nghiên cứu thành phần hóa học và thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư của lá cây mãng cầu xiêm ( annona muricata l ) họ annomaceae

Với kết quả thu được từ các nghiên cứu tập trung theo hướng nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào, Mãng cầu xiêm được coi như một dược liệu đầy tiềm năng trong điều trị ung thư [7].. Trong

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU TRANG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ

NGUYỄN THU TRANG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ

1 Bộ môn Dược liệu, trường ĐH Dược,

Hà Nội

2 Viện Hóa học, Viện hàn lâm khoa học

và công nghệ Việt Nam

Hà Nội, năm 2014

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Quyên, người

thầy đã ủng hộ, giúp đỡ, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình làm khoá luận

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS., TS Phạm Gia Điền, TS Bùi Kim

Anh, Th.S, NCS Hồ Đắc Hùng đã giúp đỡ, góp ý cho tôi trong quá trình

làm khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ ở Phòng Công nghệ các hoạt chất sinh học, Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận này

Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và cảm ơn tới Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo và các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn đồng hành, tạo điều kiện cho tôi được học tập, tiếp thu những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt 5 năm học

Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên tôi để tôi có thêm nghị lực và say mê nghiên cứu khoa học

Hà nội, ngày 14 tháng 4 năm 2014

Nguyễn Thu Trang

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN ii

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Annona muricata L 3

CHƯƠNG 2- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

14

2.1.3.2 Dùng cho xác định thông số vật lý và hóa học của các chất 15

2.3.1 Nghiên cứu về hoá học 16

3.1.3.1 Khảo sát sơ bộ cặn dịch chiết n-hexan bằng SKLM 22 3.1.3.2 Phân lập cặn dịch chiết n-hexan lá Mãng cầu xiêm bằng sắc

ký cột

24

PHỤ LỤC 46

C-NMR Cacbon (13) Nuclear magnetic resonance

ATCC American type culture collection

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DMEM Eagle's minimal essential medium

DMSO Dimethyl sulfoxide

EC 50 The term half maximal effective concentration

EI-MS Electron ionization – Mass sprectromery

IC 50 The half maximal inhibitory concentration

J (Hz) Hằng số tương tác tính bằng Hertz

MCF7 Human breast adenocarcinoma

RPMI Roswell Park Memorial Institute medium

SKLM Sắc ký lớp mỏng

Hình 1.1: Khung cấu trúc chung của acetogenin 4

Hình 1.2: Cấu trúc hoá học của acetogenin mạch thẳng 4

Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của acetogenin có nhóm epoxy 5

Hình 1.4: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 1 nhóm tetrahyrofuran 6

Hình 1.5: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 2 nhóm tetrahyrofuran 6

Hình 1.6: Khung cấu trúc cơ bản của 4 nhóm alcaloit 7

Hình 1.7: Khung cấu trúc cơ bản của sterol 8

Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất bột lá cây Mãng cầu xiêm 20

Hình 3.2: Sắc kí đồ của cặn dịch chiết n-hexan của lá mãng cầu xiêm

trong các hệ dung môi khác nhau quan sát ở AST

22

Hình 3.3: Sắc ký đồ cặn dịch chiết n-hexan trong hệ dung môi

Toluen:Etyl acetat:Acid acetic [40:10:1]

23

Hình 3.4: Sắc kí đồ của chất P27 trong hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH

[98:2], hiện màu bằng ceri sulfat

27

Hình 3.5: Sắc ký đồ của chất P71 trong hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH

[9:1], hiện màu bằng ceri sulfat

29

Hình 3.6: Sắc ký đồ của chất P55.7 trong hệ dung môi CH2Cl2 : EtOAc

[8:2], quan sát ở AST

30

Hình 3.7: Công thức cấu tạo β-sitosterol (P27) 31

Hình 3.8: Công thức cấu tạo của β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit

(P71)

33

Hình 3.9: Công thức cấu tạo của lutein (P55.7) 35

Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của cặn dịch chiết n-hexan từ

lá cây Mãng cầu xiêm

21

Bảng 3.3: Kết quả SKLM của cặn dịch chiết n-hexan trong hệ dung môi

Toluen:Etyl acetat:Acid acetic [40:10:1]

24

Bảng 3.4.1: Số liệu phổ NMR của hợp chất P55.7 và lutein [10] 34

Bảng 3.4.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất P55.7 và lutein [10] (tiếp) 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học có ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống Nhiều hợp chất thiên nhiên hoặc các sản phẩm được tổng hợp, bán tổng hợp từ các hợp chất thiên nhiên đã được sử dụng một cách hiệu quả trong việc điều trị, phòng ngừa một

số bệnh, đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo

Theo thống kê, mỗi năm tại Việt Nam, số bệnh nhân ung thư mắc mới

là 150.000 người và có 75.000 người tử vong [39] Các phương pháp điều trị ung thư thông thường như hóa trị và xạ trị hay để lại tác dụng phụ, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân Vì vậy, tìm ra các liệu pháp mới trong điều trị ung thư là một nhu cầu cấp thiết

Hiện nay, cây Mãng cầu xiêm (Annona muricata L.) đang thu hút sự

quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới Với kết quả thu được từ các nghiên cứu tập trung theo hướng nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào, Mãng cầu xiêm được coi như một dược liệu đầy tiềm năng trong điều trị ung thư [7]

Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về Mãng cầu xiêm trong khi loài thực vật này được trồng phổ biến để khai thác quả và đem lại hiệu quả kinh tế rất lớn Các bộ phận khác của cây hầu như không được tận dụng Vì vậy, để có thể đóng góp thêm những hiểu biết giúp làm tăng giá trị của nguồn nguyên liệu lớn, chúng tôi thực hiện đề tài : ‖Nghiên cứu thành phần hoá học và thử

hoạt tính ức chế tế bào ung thư của lá cây Mãng cầu xiêm (Annona muricata L.), họ Annonaceae‖ vơi hai mục tiêu chính:

- Nghiên cứu thành phần hoá học của lá cây Mãng cầu xiêm

- Thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư của dịch chiết lá cây Mãng cầu xiêm

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN

1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật

1.1.1 Vị trí phân loại của loài Mãng cầu xiêm

Theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan, loài Annona muricata

L thuộc chi Na (Annona), Họ Na (Annonaceae), Liên bộ Magnolianae, Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae), Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [32]

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae) Liên bộ Magnolianae

Bộ Na (Annonales)

Họ Na (Annonaceae) Chi Na (Annona)

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Annona

Mô tả: Cây gỗ hay cây bụi Vỏ thân mỏng, có những vùng lõm rộng và nông, hoặc những vết nứt nối với nhau, có vảy, từ những vết nứt này các chồi cây mọc ra Phiến lá mỏng, mềm dẻo, có lông hoặc không Cuống hoa mọc từ nách lá, đoi khi từ nách chồi, ở dạng hoa đơn hay chùm Ba hay bốn lá đài rụng sớm thường nhỏ hơn cánh hoa phía ngoài và không bao kín khi còn nụ Sáu hay tám cánh hoa nạc mọc thành hai vòng, các cánh hoa mọc ở vòng ngoài lớn hơn nhưng không bao kín; các cánh hoa mọc ở vòng trong nhỏ hơn Nhị nhiều, cuộn lại, dạng chuỳ, hoặc cong và có dạng túi, hoặc nhọn ở đầu kia bao phấn Nhuỵ nhiều, gắn trực tiếp phần đáy, riêng rẽ liên kết với đầu nhuỵ, với một hoặc hai noãn mỗi nhuỵ; vòi nhuỵ và đầu nhuỵ hình chuỳ hoặc hình nón hẹp Quả nạc, hình trứng hoặc hình cầu Mỗi quả bao gồm có nhiều quả

nhỏ riêng biệt hoặc quả tụ, với một quả tụ và hạt mỗi nhuỵ Hạt hình hạt đậu với lớp áo cứng; nhân hạt độc [13]

Chi Na (Annona) có khoảng 125 loài phân bố nhiều ở các vùng rừng

mưa nhiệt đới thuộc châu Mỹ, châu Phi… Ở Việt Nam có một số loài thuộc

chi Annona được phát hiện là: Annona cherimolia, Annona glabra, Annona

muricata, Annona reticulata, Annona squamosa [1]

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Annona muricata L

Mô tả: Cây cao 4-6m; nhánh cây có nhiều mấu, nhẵn Lá hình mũi trứng ngược, hơi nhọn ở gốc, nhọn hay tù ở ngọn, 2 mặt nhẵn, mặt trên nhạt màu và láng bóng, dài 12cm, rộng 5 cm; gân lá chia 8-10 cặp, mỏng, có thể nhìn thấy ở cả 2 mặt lá; gân con tạo thành mạng lưới; cuống lá chắc, dài 8mm Cuống hoa có 1 hoa đơn độc, có lông tơ ở 2 mặt Cánh hoa lớn, hình ovan, ngắn hơn bao hoa Lá đài hình tam giác, ngắn, dày, gần giống hình tim

mác-ở gốc, có lông tơ mác-ở 2 mặt Nhiều nhị, kéo dài đến trung đới hình vuông, cụt,

có gai thịt; các ô song song, liền kề nhau; chỉ nhị dài gần bằng các ô Lá noãn

có lông màu hung; vòi nhị dài bằng bầu, có gai thịt, hình lăng trụ, cụt Quả hình cầu hoặc hình tim, có rốn ở gốc, bao phủ bởi các gai hình nón từ lá noãn hàn lại tạo thành [38]

Ở nước ta cây Mãng cầu xiêm thường được trồng để lấy quả Cây có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, được trồng ở Miền Nam Việt Nam và các nước nhiệt đới châu Á, ở nước ta thường gặp ở các tỉnh Nam bộ và một phần Tây nguyên [2],[3]

1.2 Thành phần hóa học

1.2.1 Các hợp chất acetogenin

Acetogenin là nhóm chất chỉ được tìm thấy ở họ Annonaceae, do vậy

đây là nhóm chất đặc trưng của họ thực vật này Cấu trúc thường gặp của

acetogenin là acid béo có chứa 32 đến 34 cacbon, mạch thẳng không phân nhánh, kết thúc bằng một -lactone, có thể chứa một số nhóm thế có tính oxy hóa nhƣ hydroxyl, ketone, epoxide, tetrahydrofuran (THF), tetrahydropyran (THP) cùng các liên kết đôi, liên kết ba [7],[12] Hình 1.1 trình bày khung cấu trúc chung của acetogenin

Hình 1.1: Khung cấu trúc chung của acetogenin

Theo tổng kết về acetogenin của họ Na (2005) [7], tới nay đã có 70 acetogenin đƣợc phân lập từ cây Mãng cầu xiêm Dựa trên cấu trúc hoá học

có thể phân loại acetogenin có mặt trong cây Mãng cầu xiêm làm 4 nhóm: acetogenin mạch thẳng, acetogenin có nhóm epoxy, acetogenin có 1 nhóm tetrahydrofuran, acetogenin có 2 nhóm tetrahydrofuran

- Acetogenin mạch thẳng (đã phân lập đƣợc 12 chất) bao gồm các loại: giganin; muridienin-1 (hình 1.2)

Acetogenin loại giganin

Acetogenin loại muridienin-1

Hình 1.2: Cấu trúc hoá học của acetogenin mạch thẳng

- Acetogenin có nhóm epoxy (đã phân lập đƣợc 8 chất) bao gồm các loại: epoxymurin-A; diepomuricanin-A (hình 1.3)

Acetogenin loại epoxymurin-A

Acetogenin loại diepomuricanin-A Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của acetogenin có nhóm epoxy

- Acetogenin có 1 nhóm tetrahydrofuran (đã phân lập đƣợc 47 chất) bao gồm: mono-tetrahydrofuran , ’- dihydroxy acetogenin (gồm các loại: uvariamicin-I, murisolin, annonacin, annomonicin); mono-tetrahydrofuran / monohydroxy acetogenin (gồm các loại: gigantetrocin-A, gigantriocin); isoannonacin (hình 1.4)

- Acetogenin có 2 nhóm tetrahydrofuran (đã phân lập đƣợc 3 chất) bao gồm loại: goniodenin (hình 1.5)

Acetogenin loại mono-tetrahydrofuran , ’- dihydroxy acetogenin

Acetogenin loại mono-tetrahydrofuran / monohydroxy acetogenin

Acetogenin loại isoannonacin

Hình 1.4: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 1 nhóm tetrahyrofuran

Acetogenin loại goniodenin

Hình 1.5: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 2 nhóm tetrahyrofuran

1.2.2 Các hợp chất alkaloid

Đến nay đã có 14 alcaloit đƣợc phân lập từ cây Mãng cầu xiêm bao gồm: reticuline, coclaurine, coreximine, atherosperminine, anomurine,

anomuricine, stepharine [22]; annonaine, asimilobine, atherospermine,

muricine, muricinine [33]; annonamine [23]; nornuciferine [17] Các alcaloit này thuộc 4 nhóm: apomorphin, aporphin, benzyltetrahydroisoquinolin và

tetrahydroprotoberberin Hình 1.6 trình bày khung cấu trúc cơ bản của 4 nhóm alcaloit

1 2

3 4

Hình 1.6: Khung cấu trúc cơ bản của 4 nhóm alcaloit Trong đó: 1-apomorphin, 2-aporphin, 3-benzyltetrahydroisoquinolin, 4-tetrahydroprotoberberin 1.2.3 Tinh dầu Tinh dầu làm lá cây có mùi thơm dịu Trong một nghiên cứu về thành phần tinh dầu chiết từ lá cây Mãng cầu xiêm thu hái ở Benin, 82 hợp chất đƣợc xác định bằng GC/MS, chủ yếu là các dẫn xuất của sesquiterpenes: -elemen, isocaryophyllene, -caryophyllene, humulene, muurolene, selinene, muurolene, germacreneA, -cadiene; và alcol: elemol, (E)-nerolidol, spathulenol, globulol, epi-globulol,

1-N H

OH

NH

N

epi-cubenol, -epi-cadinol, -epi-muurolol, -cadinol 4 hợp chất có hàm lƣợng cao nhất là: -caryophyllene (13,6%), -cadiene (9,1%), -epi-cadinol (8,4%) và -cadinol (8,3%) [8]

Năm 2012, Moses S Owolabi và cộng sự đã nghiên cứu thành phần tinh dầu lá cây Mãng cầu xiêm trồng ở Nigeria và xác định đƣợc 18 thành phần, các thành phần có hàm lƣợng lớn nhất là (E)-caryophyllene (38,9%), eugenol (30,2%), δ-cadinene (6,0%), caryophyllene oxide (5,0%) và α-humulene (4,3%) [27]

1.2.4 Sterol

Đây là nhóm chất không đƣợc nghiên cứu nhiều trong cây Mãng cầu xiêm Theo tài liệu tổng quan về họ Na [21], trong lá cây mãng cầu xiêm có chứa sitosterol; trong hạt có chứa sitosterol, stigmasterol, campesterol, cholesterol đã đƣợc xác định hàm lƣợng Khung cấu trúc của sterol đƣợc trình bày ở hình 1.7

Hình 1.7: Khung cấu trúc cơ bản của sterol

1.2.5 Carotenoit

Là nhóm chất đóng vai trò nhƣ một chất dinh dƣỡng có trong quả Mãng cầu xiêm, Berlowski A và cộng sự đã xác định hàm lƣợng carotenoit toàn phần trong cây mãng cầu xiêm trồng ở Peru là 0.310 μg/1 g [6]; ngoài ra đã

OH

xác định được retinol (tiền chất của vitamin A) có trong vỏ cũng như thịt quả Mãng cầu xiêm thu hái ở đông nam Nigeria [26]

1.2.6 Các nhóm chất khác

Một số hợp chất thuộc các nhóm chất khác trong cây Mãng cầu xiêm là: cacbohydrat (glucose trong lá; sucrose, glucose, fructose trong quả; galactomannan trong hạt), lipid (dầu nửa khô với các acid béo trong hạt và lá), acid amin (prolin, -amino-butyric acid trong quả), polyphenol (acid caffeic, acid para-coumaric, procyanidin, tanins), vitamin (vitamin C trong

quả), glycosid cyano [21]

1.3 Tác dụng sinh học

- Tác dụng gây độc tế bào là tác dụng sinh học nổi bật của cây Mãng

cầu xiêm, hiện đang được tập trung nghiên cứu và khai thác Các thử nghiệm

về hoạt tính của dịch chiết hay các chất phân lập được từ cây Mãng cầu xiêm

đã được tiến hành trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau và đều cho hiệu quả rõ rệt

Tác dụng này chủ yếu do acetogenin gây ra Một số cơ chế tác dụng [33] là:

- Ức chế phức hợp I ( NADH : ubiquinone oxidoreductase ) trong hệ thống ti thể vận chuyển điện tử, ức chế phosphoryl hóa oxy hóa, kết quả làm giảm lượng ATP, do đó ức chế sự phát triển của tế bào ung thư

- Ức chế NADH oxidase trong màng plasma của tế bào ung thư

Enzyme này chỉ biểu hiện rất yếu trong các tế bào bình thường khỏe mạnh Bằng cách ức chế enzyme này, ATP của tế bào ung thư sẽ bị cạn kiệt

- Ức chế tế bào ung thư đa kháng Tăng hoạt động của bơm ở tế bào, P- glycoprotein, là yếu tố đóng góp vào sự đa kháng Bơm này loại bỏ các hợp chất chống ung thư trước khi nó có hiệu lực trên các tế bào ung thư Hai vị trí

gắn ATP nội bào được tìm thấy trên P-glycoprotein , và các bơm cần ATP để hoạt động Acetogenin , thông qua sự suy giảm của ATP , có thể làm giảm hoặc dừng hoạt động của các bơm này

- Tế bào ung thư ở giai đoạn S của chu kỳ tế bào dễ bị tổn thương bởi annonacin acetogenin Annonacin có thể ngăn chặn chu kỳ tế bào trong giai đoạn G1 và ức chế sự phát triển đến pha S Ngoài ra annonacin còn tăng

cường p53 và p21, các protein kiểm soát chu kỳ tế bào

- Các annonacin acetogenin có thể khiến tế bào chết do tự huỷ Nó tăng cường các biểu hiện của Bax và Bad , trừ BCL- 2 hoặc Bcl- xL

Nghiên cứu của trường Đại học De Purdue đã đưa ra kết luận về một số acetogenin của cây Mãng cầu xiêm có khả năng tiêu diệt được những tế bào ung thư, ngay cả những tế bào ung thư kháng thuốc điều trị ung thư trước đó [5] Nghiên cứu này chỉ ra rằng trong 14 hợp chất acetogenin của Mãng cầu xiêm có 13 chất có tác dụng mạnh đối với các dòng tế bào ung thư kháng ba loại thuốc chống ung thư là: adriamycine, vicristine và vinblastine [5],[12] Cis-annonacin có IC50 trên dòng tế bào HT-29 là 1,0x10-8 μg/ml, mạnh gấp

10000 lần so với adriamycin [28] Muricoreacin có tác dụng trên dòng tế bào PC-3 với ED50= 0,025 μg/ml trong khi adriamycin cho ED50= 0,11 μg/ml [18] Dẫn xuất acetonit của annomuricin C và muricatocin C có ED50 trên dòng tế bào MCF7 là 4,48x10-3

và 3,98x10-3 μg/ml; mạnh hơn adriamycin với

tác dụng gây độc tế bào trên dòng tế bào MCF7 với tỷ lệ tế bào chết ở nồng

độ 100 μg/ml là 99,2±0.1% [27]

- Tác dụng chống tăng glucose huyết: Nghiên cứu của nhóm nhà khoa

học ở Nigeria đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết của chiết xuất methanol từ cây Mãng cầu xiêm trên chuột mắc tiểu đường gây ra bởi streptozotocin [4]

- Tác dụng lên tim và huyết áp: Dịch chiết nước của lá tiêm tĩnh mạch

giảm huyết áp trên chuột Dịch chiết nước của vỏ cây cho tác dụng ức chế tim trên thỏ [33]

- Tác dụng chống loét: Dịch chiết ethanol từ lá có khả năng làm giảm

viêm loét trên chuột bị gây loét dạ dày bởi 1ml ethanol 99,5% [15]

- Tác dụng chống co thắt và giãn cơ: Dịch chiết ethanol và nước từ lá

và thân cây dùng đường uống với nồng độ 0,033 ml/l trên lợn guinea cho tác dụng chống co thắt Ở thỏ dịch chiết ethanol 3,3 ml/l làm giãn cơ [33]

- Tác động thần kinh

+ Dịch chiết ethanol của cây Mãng cầu xiêm, với liều dùng 100 mg/kg

và 300 mg/kg, làm giảm cơn co giật PZT-tonic và giảm tỉ lệ chết trên chuột được tiêm PZT (Lead zirconate titanate) [24]

+ Alcaloit từ cây Mãng cầu xiêm gồm asimilobine, nornuciferine, annonaine ức chế sự liên kết của chất chủ vận từng phần [3H] rauwolscine với thụ thể 5-HT1A, giá trị IC50 ( tương ứng là 3, 9, 5 [17]

- Tác dụng kháng vi sinh vật và kháng loài nguyên sinh:

+ Kháng sốt rét: Cặn dịch chiết tổng ethanol và các cặn dịch phân đoạn cloroform, methylene cloride, methanol của cây Mãng cầu xiêm, với hàm lượng 10 μg/ml, cho kết quả phần trăm ức chế sự phát triển của chủng

Plasmodium falciparum FcB1 tương ứng là 28%, 64%, 25%, 38 % Cặn dịch

chiết phân đoạn cloroform cho hoạt tính chống sốt rét mạnh nhất [25]

+ Kháng khuẩn: Chiết xuất từ lá, thân và vỏ cây còn có tác dụng kháng

khuẩn in vitro trên các loài E coli, P aeruginosa, S flexneri, S spp, S

marcescens, S aureus, S albus, S Newport, B Subtilis [33]

+ Kháng virus: Một phân đoạn chất tan trong nước thu được từ thân cây

có tác dụng chống lại sự tăng sinh của tế bào nhiễm HIV trong ống nghiệm tại

IC50 2 g/ml Chiết xuất ethanol của thân và vỏ cây ở nồng độ 1 mg/ml có

hoạt tính kháng vi rút Herpes simplex type 1 [33]

1.4 Công dụng

Từ lâu Mãng cầu xiêm đã được sử dụng trong y học truyền thống với nhiều trường hợp bệnh lý khác nhau như viêm phế quản, ho, suyễn, bệnh gan, bệnh túi mật, khó tiêu, lỵ, co thắt, tiêu chảy, đái tháo đường, cao huyết áp, nhiễm kí sinh trùng, cúm, sốt cao, sốt rét… Mãng cầu xiêm còn được sử dụng như thuốc an thần, giảm đau Lá còn được sử dụng với một số công dụng như làm thuốc lợi tiểu mạnh khi bị phù chân (Amazonia), trị bệnh khớp (thấp khớp, viêm khớp), đau dây thần kinh (Brazil), bệnh da liễu (ban da, nhiễm trùng da) (Đảo Cook), nhịp tim nhanh (Madagascar), làm thuốc trợ tim (Guyana), giúp se da và cầm máu (Malaysia) [33]

Ở Việt Nam, lá cây Mãng cầu xiêm đã được dùng để chữa bệnh ngoài

da, giun, thấp khớp [1], sốt rét [2] Tuy nhiên chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Mãng

cầu xiêm Vì thế cần thiết nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và tác

dụng sinh học của Mãng cầu xiêm để phục vụ việc khai thác, sử dụng hiệu quả loài cây này ở Việt Nam

Từ tổng quan đã trình bày, định hướng nghiên cứu được đưa ra:

- Về nghiên cứu hoá học, các nhóm chất có mặt trong Mãng cầu xiêm rất đa dạng, có các lớp chất từ kém phân cực đến phân cực Vì vậy, lựa chọn

dãy dung môi có độ phân cực tăng dần để chiết xuất mẫu lá, tạo thuận lợi cho việc phân lập và tinh chế sau này

- Về nghiên cứu tác dụng sinh học, tác dụng gây độc tế bào là tác dụng sinh học đƣợc quan tâm nhiều nhất Vì vậy, lựa chọn khảo sát tác dụng ức chế

tế bào ung thƣ của dịch chiết lá cây Mãng cầu xiêm sẽ làm tăng ý nghĩa của nghiên cứu

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá cây Mãng cầu xiêm được chúng tôi thu hái vào tháng 5/2013 tại xã Hoà Mỹ, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang, Việt nam Tên cây được nhà thực vật học Nguyễn Kim Đào (Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật) thẩm

định có tên khoa học là Annona muricata L., họ Annonaceae Tiêu bản được

lưu giữ tại phòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mẫu lá cây Mãng cầu xiêm sau khi thu hái về được rửa sạch hong khô

ở nơi thoáng mát, rồi sấy ở 45οC đến khi đạt hàm ẩm 10%, tiếp đó mẫu được xay thành bột mịn rồi chiết xuất ở nhiệt độ phòng

2.1.2 Dung môi, hóa chất:

- Dùng cho chiết xuất và phân lập: n-hexan, diclometan, etylaxetat, methanol, toluen, acid acetic Thuốc hiện dùng trong sắc ký lớp mỏng là dung dịch Ceri sulfat, dung dịch Vanillin sulfuric/H2SO4

- Dùng cho thử độc tính tế bào ung thư: huyết thanh phôi bò, môi trường RPMI, môi trường DMEM, MTT, DMSO

2.1.3 Thiết bị

2.1.3.1 Dùng cho chiết xuất, định tính và phân lập

- Phễu chiết xuất mẫu thực vật

- Phễu chiết phân lớp dung tích 1 lít

- Bộ máy quay cất cô chân không thu hồi dung môi (BUCHI waterbath B480-Đức)

- Bộ khảo sát sắc ký lớp mỏng

- Máy sấy

- Cân phân tích

- Đèn tử ngoại bước sóng 254 và 360 nm

- Phễu lọc và các bình chứa dung môi

- Cột sắc ký cao 80 cm đường kính 2,5 cm (Chạy phân đoạn)

- Cột sắc ký cao 50 cm đường kính 2,0 cm (Chạy phân đoạn)

- Cột sắc ký cao 30 cm đường kính 1cm (Tinh chế)

- Phễu chứa dung môi chạy sắc ký cột

2.1.3.2 Dùng cho xác định thông số vật lý và hóa học của các chất

- Điểm nóng chảy được đo trên máy Buchi melting poit B-545

- Phổ FT-IR được ghi trên máy FT-IR Impact-410 của hãng Carl Zeiss Jena tại Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam

- Phổ EI-MS được đo trên máy HP 5989BMS

- Phổ NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz với TMS là chất nội chuẩn

2.1.3.3 Dùng cho thử hoạt tính gây độc tế bào

- Thiết bị nghiên cứu: tủ ấm CO2(INNOVA CO-170)

- Tủ cấy sinh học an toàn cấp II

- Máy ly tâm (Universal 320R)

- Kính hiển vi ngược (Zeizz)

- Tủ lạnh sâu -250C, -80oC

- Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa Kỳ)

- Máy quang phổ (Genios Tecan)

- Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào

- Các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Chiết xuất mẫu nghiên cứu với các dung môi có độ phân cực khác nhau

- Phân lập và nhận dạng chất phân lập được từ phân đoạn dịch chiết n- hexan

- Thử tác dụng gây độc tế bào của phân đoạn dịch chiết n- hexan

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về hóa học

2.3.1.1 Chiết xuất

Bột lá được chiết xuất với các dung môi có độ phân cực khác nhau theo thứ tự độ phân cực tăng dần bằng phương pháp ngâm ngấm kiệt tại nhiệt độ phòng với thời gian mỗi lần là 24 giờ, mỗi loại dung môi ngâm chiết lặp lại 3 lần (Dung môi ngâm chiết phải ngập mẫu bột dược liệu 3cm đến 5cm) Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dưới áp suất giảm đến cắn Bảo quản cắn trong bình hút ẩm

Hàm lượng cắn các dịch chiết (theo phương pháp cân) được tính theo công thức sau:

- Kĩ thuật tinh chế: kết tinh hay sử dụng sắc ký cột

2.3.2.2 Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm huyết thanh phôi bò 10% (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối) Tuỳ thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian nuôi cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha log

sẽ được sử dụng để thử độc tính [14],[30]

Tiến hành: 200 dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3x104

tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế

bào MCF7, KB; môi trường DMEM cho LU-1, mẫu thử được xử lí với tế bào

ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 /ml, 32 /ml, 8 /ml, 2 /ml, 0,5 /ml, 0,125 /ml, 0,03125 /ml, 0,0078 /ml Ủ ở 370

C, 5% CO2 trong 3 ngày Giếng điều khiển gồm 200 dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml; thêm 50 MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ử 37o

C trong 4h, loại bỏ môi trường, thêm 100 DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometre Genios TECAN [14],[30]

Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau:

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự

phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

CHƯƠNG 3 - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Thực nghiệm và kết quả

3.1.1 Chiết xuất

Nạp 1kg bột lá Mãng cầu xiêm (hàm ẩm 10%) vào bình ngâm chiết Bột lá được ngâm chiết với n-hexan 3 lần (3l/24h/lần) Dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cắn dịch chiết n-hexan Bã dược liệu sau chiết với n-hexan được làm khô, tiếp tục ngâm chiết tương tự như trên với lần lượt các dung môi CH2Cl2, EtOAc và MeOH, từ đó lần lượt thu được cắn của các dịch chiết này Sơ đồ chiết xuất bột lá Mãng cầu xiêm được trình bày

ở hình 3.1

Khối lượng cắn các dịch chiết thu được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Hàm lượng các cặn các dịch chiết của lá cây Mãng cầu xiêm

Cắn dịch chiết Khối lượng thu được (g) Hàm lượng cắn (%)

Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất bột lá cây Mãng cầu xiêm

3.1.2 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Trong nghiên cứu này, cặn dịch chiết n-hexan của lá cây Mãng cầu xiêm được sử dụng làm mẫu thử để khảo sát hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư thông qua phép thử gây độc tế bào trên cả 3 dòng tế bào ung thư

KB, MCF7 và LU Bằng phương pháp thử đã được trình bày ở phần 2.3.2 chúng tôi đã thu được kết quả trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của cặn dịch chiết n-hexan từ

lá cây Mãng cầu xiêm

STT Tên mẫu Giá trị IC 50 (g/ml)

Chất đối chứng dương Ellipticin thể hiện hoạt tính gây độc đối với cả 3

dòng tế bào ung thư KB, LU, MCF7 với giá trị IC 50 lần lượt là 0,31; 0,45 và 0,53 μg/ml

Cặn dịch n-hexan của mãng cầu xiêm có tác dụng gây độc tế bào trên

cả 3 dòng tế bào thử nghiệm KB, LU và MCF7 với các giá trị IC 50 lần lượt tương ứng là 0,08 μg/ml, 0,7 μg/ml và 6,9 μg/ml Tác dụng của cặn dịch chiết n-hexan trên dòng tế bào KB là mạnh nhất thể hiện ở giá trị IC 50 nhỏ nhất là 0,08 μg/ml, tốt hơn chất đối chứng Ellipticine với giá trị IC 50 lớn hơn; trong khi đó cặn chiết này có hiệu lực trung bình trên dòng tế bào MCF7

Từ thử nghiệm cho thấy cặn dịch chiết n-hexan có tác dụng gây độc tế bào ung thư nên chúng tôi chọn dịch chiết này để tiến hành phân lập các hợp chất

3.1.3 Phân lập các chất từ dịch chiết n-hexan

3.1.3.1 Khảo sát sơ bộ cặn dịch chiết n-hexan bằng SKLM

- Lấy 0,5g cặn dịch chiết n-hexan hoà tan trong CH2Cl2, lọc qua giấy lọc,

- Bản mỏng silicagel F254 đƣợc hoạt hoá ở 1100C trong 1h

- Triển khai SKLM với các hệ dung môi sau :

Hệ (I) Hệ (II) Hệ (III)

Hình 3.2: Sắc kí đồ của cặn dịch chiết n-hexan của lá mãng cầu xiêm

trong các hệ dung môi khác nhau quan sát ở AST

Nhận xét:

Qua hình ảnh bản mỏng nhận thấy ở hệ I các chất đã bắt đầu tách vết Ở

hệ II, độ phân cực tăng lên các chất tiếp tục tách ra Hệ III là hệ phân cực cao,

các vết tách ra và tách tốt trên bản mỏng, Đây là cơ sở để lựa chọn hệ dung môi tách các chất trong cặn dịch chiết n-hexan trên SKLM và sắc kí cột

- Triển khai SKLM với hệ dung môi Toluen : Etyl acetate : Acid acetic [40:10:1], quan sát SKLM với các điều kiện khác nhau (AST, UV254, hiện vết bằng thuốc thử Vanillin sulfuric/H2SO4) thu đƣợc kết quả ở bảng 3.3

AST UV254 Hiện màu

Hình 3.3: Sắc ký đồ cặn dịch chiết n-hexan trong hệ dung môi

Toluen : Etyl acetat : Acid acetic [40:10:1]

Bảng 3.3: Kết quả SKLM của cặn dịch chiết n-hexan trong hệ dung môi

Toluen : Etyl acetat : Acid acetic [40:10:1]

STT Rf Điều kiện quan sát

AST UV245 Thuốc thử Màu sắc Độ

Ghi chú: (+++) rất đậm, (++) đậm, (+) mờ, (-) không hiện vết

Từ hình ảnh nhận thấy có 8 vệt chất chính, màu đậm, các vệt 3,4,5,6 rất gần nhau

3.1.3.2 Phân lập cặn dịch chiết n-hexan lá Mãng cầu xiêm bằng sắc ký cột

Chuẩn bị cột: Cân 100g chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,04-0,063 mm được nhồi vào cột sắc ký thuỷ tinh (chiều cao = 80cm, đường kính = 2,5cm)

bằng phương pháp nhồi cột ướt Dưới đáy cột nhồi một lớp bông mỏng, lượng silicagel đã chuẩn bị được cho vào cốc thủy tinh 500 ml sau đó thêm vào dung môi n-hexan khuấy đều đến khi tạo hỗn hợp đồng nhất rồi rót từ từ vào cột đến hết, để ổn định cột cho silica gel lắng xuống và mở van để dung môi chảy ra bình hứng đến khi trên đầu cột vạch dung môi còn khoảng 0,5 cm so với vạch silicagel

Chuẩn bị mẫu chạy cột: Cân 10g cắn dịch chiết n-hexan hòa tan trong dung môi n-hexan đến khi đồng nhất, trộn với 1g silica gel khuấy đều sau quay cô chân không loại dung môi n-hexan tạo dạng bột, bột mẫu này được trải đều lên bề mặt silicagel của cột sắc ký

Tiến hành chạy sắc kí bằng các hệ dung môi như sau:

- Chạy sắc kí cột với hệ dung môi n-hexan : CH2Cl2 với tỷ lệ như sau:

- Chạy sắc kí cột bằng hệ dung môi CH2Cl2 : EtOAc với tỷ lệ nhƣ sau: