Đánh giá hiệu lực invitro của 5 dẫn xuất artemisinin trên chủng plasmodium falciparum kháng chloroquin và thử độc tính cấp của dẫn xuất có hiệu lực cao nhất trên động vật thực nghiệm

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ VÂN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤT CÓ HIỆU LỰC CAO NHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ VÂN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤT CÓ HIỆU LỰC CAO NHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : 1. Ths. Lê Thị Thu Hương 2. TS. Bùi Quang Phúc Nơi thực hiện : Khoa Nghiên cứu điều trị sốt rét Viện Sốt rét – Ký sinh trùng -Côn trùng Trung ương HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Để thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cô giáo ThS. Lê Thị Thu Hương (Bộ môn Vi sinh – Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội) – người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và cho tôi những lời khuyên quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy TS. Bùi Quang Phúc (Khoa Nghiên cứu điều trị sốt rét, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương) cùng tập thể cán bộ trong Khoa đặc biệt chị TS. Nguyễn Thị Minh Thu đã hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm và nghiên cứu hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, các phòng ban và các bộ môn Trường Đại Học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, tạo điều kiện trong 5 năm học và hoàn thành tốt khóa học. Cuối cùng, tôi xin gửi đến những người thân trong gia đình, bạn bè đặc biệt nhóm NNCC, những người đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi lời cảm ơn sâu sắc trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Ngô Thị Vân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT PLASMODIUM 3 1.1.1. Đặc điểm hình thái 3 1.1.2. Chu kỳ phát triển 4 1.1.2.1. Chu kỳ phát triển vô tính trong người 4 1.1.2.2. Chu kỳ phát triển hữu tính trong cơ thể muỗi 5 1.2. TÌNH HÌNH SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 5 1.2.1. Vài nét khái quát về bệnh sốt rét 5 1.2.2. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam 6 1.2.2.1. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới 6 1.2.2.2. Tình hình bệnh sốt rét ở Việt Nam 6 1.2.3. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium 7 1.2.3.1. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium trên thế giới 7 1.2.3.2. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium ở Việt Nam 8 1.3. ĐẶC ĐIỂM ARTEMISININ VÀ DẪN XUẤT 9 1.3.1. Nguồn gốc, tính chất của artemisinin và dẫn xuất 9 1.3.1.1. Nguồn gốc, cấu trúc, tính chất của artemisinin 9 1.3.1.2. Đặc điểm một số dẫn xuất của artemisinin 9 1.3.2. Cơ chế tác dụng và nhược điểm chống sốt rét của ART và dẫn xuất 10 1.3.2.1. Cơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất 10 1.3.2.2. Nhược điểm của artemisinin và dẫn xuất 11 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ 32, 33, 39c, 39d, 39e 12 1.4.1. Tình hình nghiên cứu, ưu điểm của các dẫn xuất 10 – deoxoartemisinin 12 1.4.2. Cấu trúc, tính chất của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 12 1.4.2.1. Nghiên cứu tổng hợp 10-[(2’-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (32) và 10-[(2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (33) 13 1.4.2.2. Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất amid 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl) acetamide (39c), 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide (39d), 10- (deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide (39e) 13 1.4.2.3. Tính chất của 5 dẫn xuất 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 16 2.1.1. Chủng ký sinh trùng sốt rét 16 2.1.2. Động vật thí nghiệm 16 2.1.3. Thuốc và hóa chất nghiên cứu 16 2.1.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu 17 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1. Thử nghiệm in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e trên chủng P.falciparum kháng CHQ nuôi cấy 17 2.3.1.1. Nuôi cấy KSTSR P. falciparum liên tục trong phòng thí nghiệm 17 2.3.1.2. Thử nghiệm in vitro theo phương pháp thử thuốc 48 giờ 19 2.3.2. Thử nghiệm độc tính cấp của dẫn xuất có hoạt lực in vitro mạnh nhất 20 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 3.1.1. Thử nghiệm hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 23 3.1.2. Thử nghiệm độc tính cấp của hợp chất 32 32 3.2. BÀN LUẬN 33 3.2.1. Kết quả thử hoạt lực in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 33 3.2.2. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp dẫn xuất 32 – chất có hiệu lực in vitro mạnh nhất 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 KẾT LUẬN 37 KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tiếng việt 32 10β-[2’β-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin 33 10β-[2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin 39c 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl) acetamide 39d 10β-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide 39e 10β-(deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide AE Arteether AM Artemether ART Artemisinin AS Artesunat BN Bệnh nhân BNSR Bệnh nhân sốt rét CHQ Chloroquin C M Nồng độ của các mẫu thử tính theo thể tích DHA Dihydroartemisinin DMSO Dimethyl sulfoxide ĐVTN Động vật thực nghiệm HC Hồng cầu KST Ký sinh trùng KSTSR Ký sinh trùng sốt rét MĐKST Mật độ ký sinh trùng P. falciparum Plasmodium falciparum P. vivax Plasmodium vivax RI, II, III Mức độ kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét SKD Sinh khả dụng SR Sốt rét TCYTTG Tổ chức y tế thế giới TLPT Trọng lượng phân tử Tiếng anh GHS Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures Hệ thống phân loại độc tính cấp theo giá trị giới hạn LD 50 IC 50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% ký sinh trùng phát triển LD50 Lethal Dose 50 Liều chết 50% động vật thí nghiệm MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ tối thiểu ức chế ký sinh trùng phát triển WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1 Tỉ lệ ức chế chủng P. falciparum K1 của chất 32 25 3.2 Giá trị IC 50 của ART và 5 dẫn xuất trên chủng P. falciparum K1 30 3.3 Giá trị MIC của ART và 5 dẫn xuất trên chủng P. falciparum K1 31 Hình Tên hình Trang 1.1 Công thức cấu tạo của ART 9 1.2 Sự biến đổi của dẫn xuất ART trong huyết tương 11 1.3 Qui trình tổng hợp các chất 32 và 33 13 1.4 Qui trình tổng hợp các dẫn xuất amid của ART (39a-e) 14 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Đặc trưng lý – hóa cơ bản của 5 dẫn xuất 15 3.1 Mật độ KST chủng P. falciparum kháng CHQ trong 10 ngày trước khi thử thuốc 23 3.2 Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 32 24 3.3 Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 33 26 3.4 Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 39c 27 3.5 Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 39d 28 3.6 Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 39e 29 3.7 Nồng độ ức chế 50% KST phát triển của 5 dẫn xuất ở chủng K1 29 3.8 Nồng độ ức chế tối thiểu của 5 dẫn xuất trên chủng P.falciparum K1 31 3.9 Kết quả sau 7 ngày theo dõi chuột uống chất 32 ở nồng độ khác nhau 32 3.10 Kết quả quan sát cân nặng và đại thể các cơ quan khi mổ toàn bộ cả 13 lô chuột sau 7 ngày theo dõi 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Sốt rét (SR) là một bệnh lây theo đường máu, do ký sinh trùng (KST) Plasmodium được truyền từ người bệnh sang người l ành bởi muỗi thuộc giống Anopheles . [...]... đánh giá hiệu lực của các dẫn xuất artemisinin trên Plasmodium falciparum chúng tôi tiến hành đề tài Đánh giá hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất artemisinin trên chủng Plasmodium falciparum kháng cloroquin và thử độc tính cấp của dẫn xuất có hiệu lực cao nhất trên động vật thực nghiệm với các mục tiêu sau:  Nghiên cứu hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất artemisinin 32, 33, 39c, 39d, 39e trên chủng Plasmodium. .. P falciparum kháng CHQ liên tục trong phòng thí nghiệm để ổn định chủng trước khi tiến hành thực nghiệm Thử nghiệm in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e trên chủng P .falciparum kháng CHQ theo phương pháp thử 48 giờ của Nguyễn Đình Phúc và chọn ra chất có hoạt tính chống SR mạnh nhất để thử độc tính cấp trên động vật  Thử độc tính cấp của chất có hoạt tính in vitro cao nhất trên động vật thực. .. thử nghiệm, dẫn xuất 39c có nồng độ ức chế 50 % KST phát triển cao nhất (91,2 2,9 nmol/L), chất 32 có IC 50 thấp nhất (14 ,5 3,6 nmol/L) So sánh với IC50 của ART thì IC50 của dẫn xuất 39c cao gấp 5 lần (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0, 05) ; các dẫn xuất 33, 39d, 39e có IC 50 nhỏ hơn IC50 của chất 39c nhưng vẫn cao hơn IC50 của ART (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0, 05) Riêng dẫn xuất. .. Plasmodium falciparum kháng cloroquin  Thử nghiệm độc tính cấp của dẫn xuất có hiệu lực mạnh nhất trên động vật thực nghiệm CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT PLASMODIUM 1.1.1 Đặc điểm hình thái Trên Trái Đất có tới 120 loài Plasmodium gây bệnh trên động vật nhưng chỉ có 4 loài gây bệnh cho người: Plasmodium falciparum (P falciparum) , Plasmodium vivax (P vivax), Plasmodium ovale (P ovale), Plasmodium. .. chế 50 % KST phát triển của 5 dẫn xuất ở chủng K1 Mẫu thử IC50 (nmol/L) ART (1) 16,3 1,8 P 32 (2) 14 ,5 3,6 P2,1 > 0, 05 33 (3) 33,8 1,8 P3,1 < 0, 05 39c (4) 91,2 2,9 P4,1 < 0, 05 39d (5) 65, 1 4,8 P5,1 < 0, 05 39e (6) 27,8 0,7 P6,1 < 0, 05 Biểu đồ 3.2 Giá trị IC50 của ART và 5 dẫn xuất trên chủng P falciparum K1 Nhận xét: Qua bảng 3.7 và biểu đồ 3.2 cho thấy: Trong 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e đem đi thử. .. dẫn xuất 32 có IC50 tương tự IC50 của ART (sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P > 0, 05) Như vậy trong 5 dẫn xuất thì chất 32 là chất có tác dụng ức chế P falciparum K1 tốt nhất và tương tự ART Còn các dẫn xuất 33, 39c, 39d, 39e đều có tác dụng ức chế chủng P falciparum K1 thấp hơn dẫn xuất 32 và ART Bảng 3.8 Nồng độ ức chế tối thiểu của 5 dẫn xuất trên chủng P falciparum K1 Mẫu thử MIC ( nmol/L)... 50 % (IC50) và nồng độ ức chế tối thiểu KST phát triển (MIC) Chỉ tiêu đánh giá:  Xác định nồng độ ức chế 50 % KST phát triển (Inhibitory Concentration 50 % – IC50) dựa trên chương trình ANOVA cài sẵn Tỉ lệ ức chế KST =  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration – MIC) 2.3.2 Thử nghiệm độc tính cấp của dẫn xuất có hoạt lực in vitro mạnh nhất [1], [5] , [ 25] Thử nghiệm độc tính. .. cứu dược lý độc tính trên thần kinh của ART và dẫn xuất trên động vật, hầu hết các dẫn xuất đều có độc tính, nhưng DHA (sản phẩm chuyển hóa của hầu hết các ete) thì ảnh hưởng nặng nề trên thần kinh trung ương [20] Như vậy, hiện nay hướng nghiên cứu của các dẫn xuất ART với mục đích khắc phục nhược điểm của ART được phát triển theo 2 hướng: hướng thứ nhất là tạo ra các dẫn xuất mới đi từ ART và DHA, hướng... 4 – 5 lần (IC50 từ 0,36 – 7 nmol/L), dẫn xuất khác của ART đều có hoạt tính cao hơn ART như AS cao hơn 4 – 5 lần, AM và AE hơn khoảng 2 lần [38] Đặc biệt ART và dẫn xuất có hiệu quả tốt trên KSTSR kháng thuốc hoặc đa kháng thuốc [4], [38] Nhưng do đặc điểm cấu tạo đặc biệt của ART và dẫn xuất như khả năng tan trong nước và trong dầu kém, độ nhờn của thuốc cao, có chứa liên kết 10-hemiacetal dễ bị chuyển... mới có khả năng ức chế tối thiểu chủng K1, điều này chứng tỏ hoạt tính của nhóm 2 kém hơn nhóm 1 nhiều So sánh với MIC của ART thì nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nhóm 1 bằng MIC của ART (100nmol/L), còn MIC của nhóm 2 cao gấp 3 lần ART (300 nmol/L) Qua các kết quả IC50 và MIC của 5 dẫn xuất thử và ART, nhận thấy rằng chất 32 có hoạt lực in vitro trên chủng P falciparum K1 mạnh nhất trong 5 mẫu thử . VÂN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤT CÓ HIỆU LỰC CAO NHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM KHÓA. VÂN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤT CÓ HIỆU LỰC CAO NHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM KHÓA. Plasmodium falciparum kháng cloroquin và thử độc tính cấp của dẫn xuất có hiệu lực cao nhất trên động vật thực nghiệm với các mục tiêu sau:  Nghiên cứu hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất artemisinin