Đánh giá hiệu lực invitro của 5 dẫn xuất artemisinin trên chủng plasmodium falciparum kháng chloroquin và thử độc tính cấp của dẫn xuất có hiệu lực cao nhất

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ VÂN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA DẪN XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤT CĨ HIỆU LỰC CAO NHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ VÂN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA DẪN XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤT CĨ HIỆU LỰC CAO NHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : Ths Lê Thị Thu Hương TS Bùi Quang Phúc Nơi thực : Khoa Nghiên cứu điều trị sốt rét Viện Sốt rét – Ký sinh trùng -Côn trùng Trung ương HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Để thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, lời tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới cô giáo ThS Lê Thị Thu Hương (Bộ môn Vi sinh – Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội) – người thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình cho tơi lời khuyên quý báu suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy TS Bùi Quang Phúc (Khoa Nghiên cứu điều trị sốt rét, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương) tập thể cán Khoa đặc biệt chị TS Nguyễn Thị Minh Thu hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình thực nghiệm nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, phòng ban mơn Trường Đại Học Dược Hà Nội dạy dỗ, tạo điều kiện năm học hồn thành tốt khóa học Cuối cùng, xin gửi đến người thân gia đình, bạn bè đặc biệt nhóm NNCC, người bên cạnh động viên, giúp đỡ lời cảm ơn sâu sắc suốt trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2013 Sinh viên Ngô Thị Vân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT PLASMODIUM 1.1.1 Đặc điểm hình thái 1.1.2 Chu kỳ phát triển 1.1.2.1 Chu kỳ phát triển vơ tính người 1.1.2.2 Chu kỳ phát triển hữu tính thể muỗi 1.2 TÌNH HÌNH SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.2.1 Vài nét khái quát bệnh sốt rét 1.2.2 Tình hình bệnh sốt rét giới Việt Nam 1.2.2.1 Tình hình bệnh sốt rét giới 1.2.2.2 Tình hình bệnh sốt rét Việt Nam 1.2.3 Tình hình kháng thuốc Plasmodium 1.2.3.1 Tình hình kháng thuốc Plasmodium giới 1.2.3.2 Tình hình kháng thuốc Plasmodium Việt Nam 1.3 ĐẶC ĐIỂM ARTEMISININ VÀ DẪN XUẤT 1.3.1 Nguồn gốc, tính chất artemisinin dẫn xuất 1.3.1.1 Nguồn gốc, cấu trúc, tính chất artemisinin 1.3.1.2 Đặc điểm số dẫn xuất artemisinin 1.3.2 Cơ chế tác dụng nhược điểm chống sốt rét ART dẫn xuất 10 1.3.2.1 Cơ chế tác dụng artemisinin dẫn xuất 10 1.3.2.2 Nhược điểm artemisinin dẫn xuất 11 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DẪN XUẤT ARTEMISININ 32, 33, 39c, 39d, 39e 1.4.1 Tình hình nghiên cứu, ưu điểm dẫn xuất 10 – deoxoartemisinin 12 12 1.4.2 Cấu trúc, tính chất dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 12 1.4.2.1 Nghiên cứu tổng hợp 10-[(2’-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (32) 10-[(2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (33) 13 1.4.2.2 Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất amid 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl) acetamide (39c), 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide (39d), 10(deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide (39e) 13 1.4.2.3 Tính chất dẫn xuất 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 16 2.1.1 Chủng ký sinh trùng sốt rét 16 2.1.2 Động vật thí nghiệm 16 2.1.3 Thuốc hóa chất nghiên cứu 16 2.1.4 Dụng cụ thiết bị dùng nghiên cứu 17 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1 Thử nghiệm in vitro dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e chủng P.falciparum kháng CHQ nuôi cấy 17 2.3.1.1 Ni cấy KSTSR P falciparum liên tục phòng thí nghiệm 17 2.3.1.2 Thử nghiệm in vitro theo phương pháp thử thuốc 48 19 2.3.2 Thử nghiệm độc tính cấp dẫn xuất có hoạt lực in vitro mạnh 20 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 3.1.1 Thử nghiệm hiệu lực in vitro dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 23 3.1.2 Thử nghiệm độc tính cấp hợp chất 32 32 3.2 BÀN LUẬN 33 3.2.1 Kết thử hoạt lực in vitro dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 33 3.2.2 Kết nghiên cứu độc tính cấp dẫn xuất 32 – chất có hiệu lực in vitro mạnh 35 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 KẾT LUẬN 37 KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tiếng việt 32 10β-[2’β-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin 33 10β-[2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin 39c 39d 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl) acetamide 10β-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide 39e 10β-(deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide AE Arteether AM Artemether ART Artemisinin AS Artesunat BN Bệnh nhân BNSR Bệnh nhân sốt rét CHQ Chloroquin CM Nồng độ mẫu thử tính theo thể tích DHA Dihydroartemisinin DMSO Dimethyl sulfoxide ĐVTN Động vật thực nghiệm HC Hồng cầu KST Ký sinh trùng KSTSR Ký sinh trùng sốt rét MĐKST Mật độ ký sinh trùng P falciparum Plasmodium falciparum P vivax Plasmodium vivax Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi RI, II, III Mức độ kháng thuốc ký sinh trùng sốt rét SKD Sinh khả dụng SR Sốt rét TCYTTG Tổ chức y tế giới TLPT Trọng lượng phân tử Tiếng anh GHS Globally Harmonised Classification System Hệ thống phân loại độc tính cấp for Chemical Substances and Mixtures theo giá trị giới hạn LD50 IC50 Inhibitory Concentration 50% LD50 Lethal Dose 50 MIC Minimum Inhibitory Concentration WHO World Health Organization Nồng độ ức chế 50% ký sinh trùng phát triển Liều chết 50% động vật thí nghiệm Nồng độ tối thiểu ức chế ký sinh trùng phát triển Tổ chức y tế giới DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1 Tỉ lệ ức chế chủng P falciparum K1 chất 32 25 3.2 Giá trị IC50 ART dẫn xuất chủng P falciparum K1 30 3.3 Giá trị MIC ART dẫn xuất chủng P falciparum K1 31 Hình Tên hình Trang 1.1 Cơng thức cấu tạo ART 1.2 Sự biến đổi dẫn xuất ART huyết tương 11 1.3 Qui trình tổng hợp chất 32 33 13 1.4 Qui trình tổng hợp dẫn xuất amid ART (39a-e) 14 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 3.1 Tên bảng Đặc trưng lý – hóa dẫn xuất Mật độ KST chủng P falciparum kháng CHQ 10 ngày Trang 15 23 trước thử thuốc 3.2 Sự đáp ứng chủng P falciparum K1 in vitro với chất 32 24 3.3 Sự đáp ứng chủng P falciparum K1 in vitro với chất 33 26 3.4 Sự đáp ứng chủng P falciparum K1 in vitro với chất 27 39c 3.5 Sự đáp ứng chủng P falciparum K1 in vitro với chất 28 39d 3.6 Sự đáp ứng chủng P falciparum K1 in vitro với chất 29 39e 3.7 3.8 Nồng độ ức chế 50% KST phát triển dẫn xuất chủng K1 Nồng độ ức chế tối thiểu dẫn xuất chủng 29 31 P.falciparum K1 3.9 Kết sau ngày theo dõi chuột uống chất 32 nồng độ khác 32 3.10 Kết quan sát cân nặng đại thể quan mổ toàn 13 lô chuột sau ngày theo dõi 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Sốt rét (SR) bệnh lây theo đường máu, ký sinh trùng (KST) Plasmodium 100 79 84 79 91 81 80 89 81 82 2,4 84 2,5 300 98 95 95 98 92 87 96 95 95 1,3 93,8 2,3 1000 100 100 100 100 96 96 100 100 99 1,0 98,7 1,3 Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ ức chế chủng P falciparum K1 chất 32 Nhận xét: Bảng 3.2 biểu đồ 3.1 cho thấy: Hoạt chất 32 nồng độ thấp (3 nmol/L) có tác dụng ức chế chủng K1 với tỉ lệ 34,5%, nồng độ cao tỉ lệ ức chế KST chất 32 tăng Ở nồng độ 300 nmol/L tỉ lệ ức chế KST đạt 95%, tăng lên nồng độ cao 1000 nmol/L đạt 99% chưa đạt mức 100% So sánh với tỉ lệ ức chế chủng K1 ART tỉ lệ ức chế KST chất 32 nồng độ thấp (3 10 nmol/L) cao ART, nồng độ lại khơng có khác biệt nhiều Bảng 3.3 Sự đáp ứng chủng P falciparum K1 in vitro với chất 33 Giếng Tỉ lệ ức chế KST (%) CM SD (nmol/L) 33 ART 33 ART 33 ART 33 ART 33 ART 21 30 29 25 27 18 24 32 25,2 1,7 26,2 3,1 10 38 49 38 43 37 38 39 47 38 0,4 41,8 2,7 30 62 62 62 70 65 68 64 62 63 0,8 65,6 2,1 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 100 79 84 76 91 80 80 81 81 79 1,1 84 2,5 300 95 95 95 98 97 87 98 95 96,5 1,0 93,8 2,3 1000 100 100 98 100 100 96 100 100 99,5 0,5 98,7 1,3 Nhận xét: Qua bảng 3.3 nhận thấy chất 33 nồng độ thấp (3 10 nmol/L) tỉ lệ ức chế chủng K1 đạt 50% (25,2% 38%) tăng dần lên nồng độ cao Tuy nhiên, so sánh với ART tỉ lệ ức chế chủng K1 chất 33 nồng độ hầu hết thấp tỉ lệ ức chế KST ART, nồng độ cao (300 1000 nmol/L) tỉ lệ ức chế KST lại cao Bảng 3.4 Sự đáp ứng chủng P falciparum K1 in vitro với chất 39c Giếng SD Tỉ lệ ức chế KST (%) CM 39c ART 39c ART 39c ART 39c ART 39c ART 30 25 18 32 26,2 3,1 10 20 49 15 43 12 38 17 47 16 1,7 41,8 2,7 30 40 62 38 70 41 68 39 62 39,5 0,6 65,6 2,1 100 50 84 59 91 52 80 51 81 53 2,0 84 2,5 300 98 95 97 98 99 87 100 95 98 0,6 93,8 2,3 1000 100 100 100 100 100 96 100 100 100 98,7 1,3 (nmol/L) Nhận xét: Qua bảng 3.4 cho thấy chất 39c nồng độ nmol/L khơng có khả ức chế chủng K1 bắt đầu có tác dụng ức chế từ nồng độ 10 nmol/L (16%), sau tăng mạnh đến nồng độ 1000 tỉ lệ ức chế đạt 100% So sánh với ART mức nồng độ đầu 3; 10; 30; 100 nmol/L tỉ lệ ức chế chủng K1 hẳn, đến nồng độ 300 1000 nmol/L cao Bảng 3.5 Sự đáp ứng chủng P falciparum K1 in vitro với chất 39d Giếng Tỉ lệ ức chế KST (%) CM (nmol/L) SD 39d ART 39d ART 39d ART 39d ART 39d ART 30 25 18 32 26,2 3,1 10 49 43 38 47 2,75 1,6 41,8 2,7 30 39 62 28 70 28 68 40 62 33,7 3,3 65,6 2,1 100 87 84 88 91 90 80 96 81 90 2,0 84 2,5 300 98 95 98 98 99 87 100 95 99 0,4 93,8 2,3 1000 100 100 100 100 100 96 100 100 100 98,7 1,3 Nhận xét: Qua bảng 3.5 cho thấy chất 39d nồng độ nmol/L khơng có khả ức chế chủng K1 Ở nồng độ 10 30 nmol/L, tỉ lệ ức chế chủng K1 50%, sau bắt đầu tăng mạnh nồng độ cuối (100; 300; 1000 nmol/L) từ 90%; 99%; 100% So sánh với tỉ lệ ức chế KST Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi ART hồn tồn khác biệt, nồng độ đầu nmol/L, 10 nmol/L chất 39d thấp ART 20 lần, đến nồng độ cuối lại có khả ức chế KST cao Tỉ lệ ức chế KST (%) Giếng CM SD 39e ART 39e ART 18 25 32 22,7 26,2 3,1 39 38 42 47 41,5 0,9 41,8 2,7 70 59 68 63 62 61 1,1 65,6 2,1 85 91 86 80 87 81 84,2 1,8 84 2,5 95 97 98 94 87 99 95 94,3 2,6 93,8 2,3 100 100 100 99 96 100 100 99,2 0,5 98,7 1,3 39e ART 39e ART 39e ART 21 30 24 25 21 10 42 49 43 43 30 59 62 63 100 79 84 300 87 1000 98 (nmol/L) Bảng 3.6 Sự đáp ứng chủng P falciparum K1 in vitro với chất 39e Nhận xét: Qua bảng 3.6 ta thấy nồng độ cao, tỉ lệ ức chế chủng K1 chất 39e cao Tương tự chất 32, nồng độ đầu tỉ lệ ức chế chủng K1 50% tăng dần nồng độ cao So sánh với ART tỉ lệ ức chế chủng K1 chất 39e hầu hết nồng độ khơng có khác biệt nhiều, riêng nồng độ 30 nmol/L có khả ức chế KST thấp ART Từ tỉ lệ ức chế KST chất ART, 32, 33, 39c, 39d, 39e xử lý số liệu chương trình Probit ANOVA để xác định nồng độ ức chế 50% KST phát triển (IC50) nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), kết thu thể bảng sau: Bảng 3.7 Nồng độ ức chế 50% KST phát triển dẫn xuất chủng K1 Mẫu thử IC50 (nmol/L) ART (1) 16,3 1,8 P 32 (2) 14,5 3,6 P2,1 > 0,05 33 (3) 33,8 1,8 P3,1 < 0,05 39c (4) 91,2 2,9 P4,1 < 0,05 39d (5) 65,1 4,8 P5,1 < 0,05 39e (6) 27,8 0,7 P6,1 < 0,05 Biểu đồ 3.2 Giá trị IC50 ART dẫn xuất chủng P falciparum K1 Nhận xét: Qua bảng 3.7 biểu đồ 3.2 cho thấy: Trong dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e đem thử nghiệm, dẫn xuất 39c có nồng độ ức chế 50% KST phát triển cao (91,2 2,9 nmol/L), chất 32 có IC 50 thấp (14,5 3,6 nmol/L) So sánh với IC50 ART IC50 dẫn xuất 39c cao gấp lần (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05); dẫn xuất 33, 39d, 39e có IC 50 nhỏ IC50 chất 39c cao IC50 ART (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05) Riêng dẫn xuất 32 có IC50 tương tự IC50 ART (sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với P > 0,05) Như dẫn xuất chất 32 chất có tác dụng ức chế P falciparum K1 tốt tương tự ART Còn dẫn xuất 33, 39c, 39d, 39e có tác dụng ức chế chủng P falciparum K1 thấp dẫn xuất 32 ART Bảng 3.8 Nồng độ ức chế tối thiểu dẫn xuất chủng P falciparum K1 Mẫu thử MIC ( nmol/L) ART 100 32 100 33 100 39c 300 39d 300 39e 100 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Biểu đồ 3.3 Giá trị MIC ART dẫn xuất chủng P falciparum K1 Nhận xét: Qua bảng 3.8 biểu đồ 3.3 cho thấy: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e phân làm nhóm có độ chênh lệch rõ rệt Nhóm gồm chất 32, 33, 39e với MIC = 100 nmol/L nhóm gồm chất 39c, 39d với MIC = 300 nmol/L, nhóm có MIC gấp lần MIC nhóm Như vậy, phải nồng độ gấp nhóm 1, nhóm có khả ức chế tối thiểu chủng K1, điều chứng tỏ hoạt tính nhóm nhóm nhiều So sánh với MIC ART nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nhóm MIC ART (100nmol/L), MIC nhóm cao gấp lần ART (300 nmol/L) Qua kết IC50 MIC dẫn xuất thử ART, nhận thấy chất 32 có hoạt lực in vitro chủng P falciparum K1 mạnh mẫu thử tương tự ART Vì vậy, chúng tơi lựa chọn dẫn xuất 32 để thử nghiệm độc tính cấp ĐVTN 3.1.2 Thử nghiệm độc tính cấp hợp chất 32 Từ 130 chuột thực nghiệm chia ngẫu nhiên thành 13 nhóm (10 con/nhóm) Sau đó, chuột cho uống chất 32 nồng độ khác theo phương pháp cổ điển cho kết bảng sau: Bảng 3.9 Kết sau ngày theo dõi chuột uống chất 32 nồng độ khác Lô Liều dùng (mg/kg) n Số chuột chết 800 10 0/10 1000 10 0/10 1300 10 0/10 1500 10 0/10 2000 10 0/10 2500 10 0/10 3000 10 0/10 3500 10 0/10 4000 10 0/10 10 4500 10 0/10 11 4800 10 0/10 12 5000 10 0/10 13 5200 10 0/10 Nhận xét: Sau cho chuột uống thuốc theo dõi ngày, chuột ăn uống, hoạt động bình thường, tiết bình thường, lơng mượt, khơng có biểu bất thường khơng có chuột tử vong với tất nồng độ thuốc thử từ 800 mg/kg đến 5200 mg/kg Toàn chuột sau theo dõi ngày mổ để quan sát đại thể quan: tim, phổi, gan, thận, ruột, bàng quang Kết thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Kết quan sát cân nặng đại thể quan mổ tồn 13 lơ chuột sau ngày theo dõi Chỉ tiêu quan sát Biểu Tỷ lệ Cân nặng Không thay đổi đáng kể 100% Tim Bình thường 100% Gan Bình thường 100% Thận Bình thường 100% Phổi Bình thường 100% Bàng quang Bình thường 100% Ruột bị xuất huyết niêm mạc nhẹ 1,54% Nhận xét: Sau quan sát cân nặng đại thể quan chuột: tim, phổi, gan, thận, ruột, bàng quang chúng tơi nhận thấy cân nặng quan bình thường trừ lô 13 bị xuất huyết niêm mạc nhẹ ruột chiếm 1,54% số chuột thử nghiệm 3.2 BÀN LUẬN 3.2.1 Kết thử hoạt lực in vitro dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e Tiến hành nghiên cứu thử nghiệm đánh giá tác dụng dẫn xuất 10-[(2’-hidroxy-3’imidazol) propyl] deoxoartemisinin (32), 10-[(2’α–hidroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (33), 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl) acetamide (39c), 10(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide( 39d), 10-(deoxoartemisinin)-N- phenethylacetamide (39e) KST P falciparum kháng CHQ nuôi cấy in vitro thông qua việc xác định số đánh giá nồng độ ức chế 50% KST phát triển (IC50) nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Từ kết nghiên cứu cho thấy dẫn xuất có tác dụng in vitro với chủng P falciparum kháng CHQ (K1) Mặc dù khả ức chế chất khác nhau, có đặc điểm chung nồng độ cao khả ức chế KST cao nồng độ cao 300; 1000 nmol/L có khả ức chế KST cao ART Qua tỉ lệ ức chế KST ta xác định IC50 để đánh giá rõ hoạt tính in vitro dẫn xuất so sánh với ART Trong dẫn xuất chất 39c có IC50 cao (91,2 2,9 nmol/L) dẫn xuất 32 có IC50 thấp (14,5 3,6 nmol/L) chứng tỏ chất 32 có hoạt lực in vitro mạnh nhất, chất 39c có hoạt lực in vitro chủng P falciparum K1 Bên cạnh đó, IC50 dẫn xuất 33, 39c, 39d, 39e cao ART nên dẫn xuất nói có hoạt tính in vitro chủng P falciparum K1 thấp ART Riêng có IC50 chất 32 thấp IC50 ART: 14,5 3,6 nmol/L so với 16,3 1,8 nmol/L khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với P > 0,05; điều chứng tỏ chất 32 có hoạt lực in vitro chủng P falciparum K1 tương tự hoạt lực ART Ngoài ra, theo nghiên cứu IC50 ART trước thu điều kiện nghiên cứu labô là: 14,5 nmol/l (Nguyễn Việt Hường, 1995) 15 nmol/l (Nguyễn Mai Hương, 2001) [9] kết nghiên cứu cao không nhiều Bên cạnh đó, IC50 dẫn xuất 32 thấp PQ (IC50 = 46,2 nmol/l) điều kiện thử nghiệm Viện sốt rét nên hoạt tính in vitro chất 32 cao PQ chủng K1 [18] Đồng thời, so sánh với thực nghiệm tác giả Nguyễn Thị Minh Thu cộng hoạt lực in vitro dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e với chủng K1 điều kiện thực nghiệm [19] kết chúng tơi hoạt lực in vitro dẫn xuất khơng có thay đổi nhiều sau năm điều khẳng định tác dụng dẫn xuất chủng K1, bật dẫn xuất 32 Qua xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC dẫn xuất dẫn xuất có nồng độ ức chế tối thiểu với chủng KST P falciparum kháng CHQ nồng độ 100 (nmol/L) MIC ART 32, 33, 39e; dẫn xuất 39c, 39d có MIC 300 nmol/L cao MIC ART dẫn xuất lại, khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 Điều chứng tỏ dẫn xuất 39c 39d có tác dụng với chủng P falciparum kháng CHQ (K1) dẫn xuất lại ART Qua số IC50 MIC thu kết nghiên cứu, nhận thấy: Cả dẫn xuất có hoạt tính in vitro chủng P falciparum kháng CHQ (K1), dẫn xuất dẫn xuất 39c, 39d có giá trị IC50 MIC cao chất khác thể hoạt tính in vitro dẫn xuất lại ART nhiều lần Ngồi ra, dẫn xuất 32 chất có hoạt tính in vitro với chủng K1 cao tương tự ART cho thấy chất 32 chất có nhiều triển vọng dẫn xuất điều chế theo phương pháp lần tổng hợp thành công Việt Nam 3.2.2 Kết nghiên cứu độc tính cấp dẫn xuất 32 - chất có hiệu lực in vitro mạnh Theo kết nghiên cứu in vitro, lựa chọn chất 32 để thử nghiệm độc tính cấp chuột nhắt trắng Đây thử nghiệm thiếu để đánh giá độ an toàn thuốc nhằm phân loại mức độ độc thuốc Trong phép thử để đánh giá độ độc thuốc phép thử độc tính cấp phép thử thực Trong nghiên cứu độc tính cấp chất 32 chuột nhắt trắng dùng đường uống, đường dự kiến dùng người sử dụng phương pháp thử cổ điển Đây phương pháp có độ xác cao, phù hợp với u cầu dò liều, đặc biệt số liệu chạy theo chương trình Probit cài sẵn nên kết đáng tin cậy tránh sai số tính tốn Với mơ hình thử phương pháp thử cổ điển thử nghiệm với dãy liều mức liều thấp 800 mg/kg liều cao 5200 mg/kg Sau theo dõi ngày, quan sát dấu hiệu ngộ độc nhận thấy tất liều thử nghiệm khơng có chuột tử vong, mổ quan sát đại thể quan (tim, gan, phổi, ruột, thận, bàng quang) cân nặng hầu hết chuột khơng có biểu bất thường, có chuột lô 13 bị xuất huyết niêm mạc nhẹ ruột chiếm tỉ lệ 1,54% Do thời gian nghiên cứu có hạn nên chúng tơi dừng lại quan sát đại thể, chưa có điều kiện nghiên cứu sâu trường hợp bị xuất huyết niêm mạc ruột, nên chưa có kết luận xác nguyên nhân gây xuất huyết niêm mạc ruột nhẹ chuột trên, chưa thể kết luận xác trường hợp ngộ độc cấp Tuy nhiên chuột bị xuất huyết nhẹ chiếm tỉ lệ thấp (1,54%), nên sơ đánh giá dẫn xuất 32 gần khơng có độc tính cấp mức liều 5200 mg/kg theo phân loại GHS (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures) Tuy nhiên nghiên cứu bước đầu động vật nhỏ, nên cần phải tiếp tục tiến hành thử nghiệm lâm sàng động vật lớn người với phương pháp thử độc tính khác trước đưa vào sử dụng điều trị bệnh SR Mặc dù vậy, kết thu từ nghiên cứu khả quan, tạo sở cho nghiên cứu sau hợp chất 32 Từ kết nghiên cứu in vitro thử độc tính cấp cho thấy rằng, hợp chất 32 có hoạt tính in vitro chủng P falciparum kháng CHQ (K1) cao dẫn xuất thử tương đương với ART, đồng thời độc tính cấp Bên cạnh đó, dẫn xuất 32 với cấu trúc có chứa liên kết 10-C-C, nitơ nên có khả tan tốt nước dầu, bền vững hóa học ART nên hứa hẹn hoạt chất đưa vào điều trị SR kháng thuốc tương lai Mặc dù kết ban đầu phần khẳng định thành công Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi bước đầu nhà khoa học Việt Nam đường tìm hợp chất có hiệu điều trị bệnh SR Việt Nam KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua nghiên cứu hiệu lực in vitro dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e Viện Hóa học sản xuất với chủng P falciparum kháng CHQ (K1) độc tính cấp đường uống dẫn xuất 10-[2’hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (32) chuột nhắt trắng, hoàn thành mục tiêu đề tài đặt thu kết sau:  Cả dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e đem thử có hiệu lực in vitro với chủng P falciparum kháng CHQ (K1) Dẫn xuất 32 dẫn xuất có hiệu lực cao với IC50 = 14,5 3,6 nmol/L, MIC = 100 nmol/L tương tự hiệu lực ART  Thử độc tính cấp hợp chất 32 (chất có hiệu lực in vitro mạnh nhất) 130 chuột nhắt trắng đường uống với dãy liều dùng từ 800 mg/kg đến 5200 mg/kg, khơng có chuột chết, theo dõi dấu hiệu ngộ độc quan sát đại thể quan tim, gan, thận, phổi, ruột, bàng quang cân nặng hầu hết không thấy biểu bất thường KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu chúng tơi có số kiến nghị sau:  Mở rộng nghiên cứu tác dụng dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e đặc biệt hợp chất 32 động vật thí nghiệm để tìm hoạt lực, tác dụng dẫn xuất in vivo, từ tìm dẫn xuất tốt đưa vào điều trị tìm liều điều trị phù hợp với chủng KSTSR kháng thuốc  Tiếp tục nghiên cứu thêm độc tính cấp, bán cấp độc tính trường diễn hợp chất 32 nhằm mục đích hồn thiện q trình nghiên cứu tiền lâm sàng để tạo điều kiện cho giai đoạn nghiên cứu lâm sàng người Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt  Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc, Nhà xuất y học  Hoàng Hà cộng (2010), “Hiệu biện pháp truyền thơng phòng chống sốt rét với người Vân Kiều xã Thanh, huyện Hướng Hóa năm 2006”, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, (số 4), tr  Trần Đức Hậu (2007), Hóa dược tập 2, Nhà xuất y học, tr 213  Lê Xuân Hùng, Nguyễn Mạnh Hùng (2010), Bệnh sốt rét chiến lược phòng chống, Nhà xuất y học  Nguyễn Mạnh Hùng (2011), Cẩm nang kỹ thuật phòng chống bệnh sốt rét, Nhà xuất y học  Nguyễn Mạnh Hùng cộng (2011), “Hiệu phòng chống sốt rét Việt Nam giai đoạn 2006 – 2010”, Cơng trình nghiên cứu khoa học báo cáo hội nghị ký sinh trùng lần thứ 38 tập 1, Nhà xuất y học, tr -14  Nguyễn Xuân Hùng (2012), “Điều tra kháng Chloroquin P falciparum kỹ thuật PCR hai tỉnh Quảng Trị Đăknơng năm 2008 – 2009”, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, (số 1), tr 39 – 43  Lê Thị Thu Hương (2009), Ký sinh trùng, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, tr 108 – 135  Nguyễn Mai Hương cộng (2001), “Đánh giá nhạy cảm in vitro hiệu lực điều trị thuốc sốt rét bệnh nhân sốt rét P falciparum tỉnh Bình Phước”, Kỷ yếu CTNCKH Viện Sốt rét – Kí sinh trùng – Côn trùng Trung ương(1996-2000), Nhà xuất y học, tr 309 – 315  Jan A Rozendaal (2000), Phòng chống vật truyền bệnh, Nhà xuất y học, tr 20 -25 Người dịch Phạm Huy Tiến cộng  Nguyễn Văn Kim (1993), “Dịch tễ học sốt rét kháng thuốc Việt Nam”, Thơng tin phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, (số 1), tr 19 – 21  Lý Bá Lộc cộng (2006), “Nghiên cứu ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc đánh giá hiệu lực số phác đồ chống kháng số khu vực miền Trung – Tây Ngun”, Cơng trình nghiên cứu khoa học báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc chuyên ngành sốt rét – ký sinh trùng – côn trùng giai đoạn 2001 – 2005 tập 1, Nhà xuất y học, tr 180 – 187  Đỗ Hữu Nghị, Nguyễn Văn Hân (2006), “Tổng hợp hai dẫn xuất 10 – arylamino Artemisinin”, Tạp chí dược học, (số 363), tr - 10  Paul N.Newton cộng (2008), “Hợp tác nghiên cứu dịch tễ học tội phạm buôn bán thuốc Artesunate giả nước Đông Nam Á”, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, (số 5), tr 20 – 22 Bản dịch tiếng Việt Trịnh Ngọc Hải  Vũ Thị Phan (1996), Dịch tễ học bệnh sốt rét phòng chống sốt rét Việt Nam, Nhà xuất y học, tr 17 – 147  Bùi Quang Phúc (2008), Nghiên cứu cấu ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum kháng thuốc kỹ thuật polymerase chain reaction vùng sốt rét lưu hành nặng, Luận án tiến sĩ y học - Học viện Quân y, tr.8 - 39  Nguyễn Quang Thiều, Nguyễn Mạnh Hùng (2012), “Một số đặc điểm dịch tễ sốt rét huyện Hướng Hóa tỉnh Quảng Trị giai đoạn 2006 – 2010”, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, (số 1), tr  Nguyễn Thị Minh Thu cộng (2011), “Hiệu lực độc tính thực nghiệm Dihydroartemisinin Piperaquin Việt Nam sản xuất với ký sinh trùng sốt rét”, Cơng trình nghiên cứu khoa học báo cáo hội nghị ký sinh trùng lần thứ 38 tập 1, Nhà xuất y học, tr 232 – 240  Nguyễn Thị Minh Thu cộng (2011), “Nghiên cứu hiệu lực in vitro dẫn xuất Artemisinin độc tính cấp 10β-[(2’β–hydroxy-3’–imidazol) propyl] deoxoartemisinin”, Tạp chí dược học, (số 428)  Nguyễn Thị Minh Thu (2008), Nghiên cứu tác dụng ký sinh trùng sốt rét độc tính thực nghiệm thuốc sốt rét phối hợp Dihydroartemisinin – Piperaquin Việt Nam sản xuất, Luận án tiến sỹ dược học - Viện Dược Liệu  Thái Nguyễn Hùng Thu (2001), Nghiên cứu bán tổng hợp thử tác dụng sinh học số dẫn xuất Artemisinin, Luận án tiến sĩ dược học, Trường Đại Học Dược Hà Nội  Nông Thị Tiến (2002), Giám sát ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc đánh giá hiệu lực điều trị số phác đồ Bộ Y tế ban hành, Dự án phòng chống sốt rét Việt Nam – EC, Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương, tr  Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 2, Nhà xuất y học, tr 193 – 199  Triệu Nguyên Trung cộng (1997), “Hiệu lực Artemisinin Artesunate điều trị sốt rét P falciparum khu vực miền Trung Tây Nguyên”, Kỷ yếu CTNCKH Viện sốt rét – Kí sinh trùng – Cơn trùng Trung ương (1991-1996) tập 1, Nhà xuất y học, tr 122 – 131  Viện Kiểm nghiệm (2005), Dự thảo hướng dẫn thử độc tính thuốc, Bộ Y tế  Viện SR KST – CT TW, Nghiên cứu tiền lâm sàng hợp chất Artemisinin gắn Flour, Đề tài cấp nhà nước giai đoạn 2002 – 2004  Trần Khắc Vũ cộng (2006), “Phương pháp tổng hợp 10β – (2’-oxoethyl) deoxoartemisinin”, Tạp chí dược học, (số 366), tr – 10  Nguyễn Xuân Xã cộng (2012), “Phân tích yếu tố nguy nhiễm sốt rét cộng đồng người dân tộc Gia Rai ba thơn biên giới: Theo kết phân tích kháng thể kháng sốt rét huyết thanh”, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, (số 2), tr 15  P.T.Yến, Lê Nguyên Bình, Đặng Cẩm Thạch cộng (1997), “Hiệu lực hiệu phác đồ Artemisinin tổng liều 60 mg/kg Artesunate tổng liều 12 mg/kg đơn ngày”, Kỷ yếu CTNCKH Viện sốt rét – Kí sinh trùng – Côn trùng Trung ương (1991-1996) tập 1, Nhà xuất y học, tr 109 – 113 Tài liệu tiếng Anh  Balint G.A (2001), “Artemisinin and its derivatices, an important new class of antimalarial agents”, Pharmacology and therapeutics, 90, pp 261 – 265  Karbwang J., Na-Bangchang K (1995), “Clinical pharmacology of artemisinin compounds”, Clinical pharmacology of antimalarials, pp 263 – 294  Meshnick S.R (2002), “Artemisinin: mechanisms of action, resistance and toxicity”, International journal for Parasitology, 32, pp 1655 – 1660  Robert A., Benoit-Vical F., Claparols C., Meunier B (2005), “The antimalarial drug artemisinin alkylates heme in infected mice”, Proceedings of the National academy of science of the United States of America, Vol 102, No 83, pp 13676 – 13680  Roll Back Malaria RBM Issues Brief – On the global malaria response Finr 12 – 2009 Retrieved from the World Wide Web on 3rd of June  Quinghaosu antimalaria coordinating research group (1979), “Antimalaria studies on quinghaosu”, Chinese medical journal, Vol 92, No 12, pp 811 – 816  Tran Khac Vu, Truong Bich Ngan (2007), “Synthesis of novel water soluble 10 – deoxoartemisinins”, Journal of Chemistry, Vol 45(4), pp 505 – 508  Truong Thi Thanh Nga, Nguyen Quang An, Truong Bich Ngan, Tran Khac Vu (2008), “Synthesis of novel 10 – deoxoartemisinin”, Vast – Proceeding, pp 201 – 206  Vries P.J.de, Dien T.K (1996), “Clinical pharmacology and therapeutic potential of artemisinin and its derivatives in the treatment of malaria”, Drugs, 52(6), pp 818 – 835  Wilson J.F (2003), “Advancing the war on malaria”, Annals of Internal medicine, Vol 138, No 8, pp 693 – 696  World Health Organization (2006), Guidelines for the treatment of malaria  World Health Organization (2012), “Summary and Key Points”, World malaria report 2012 ... HÀ NỘI NGÔ THỊ VÂN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA DẪN XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤT CĨ HIỆU LỰC CAO NHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC... giá hiệu lực in vitro dẫn xuất artemisinin chủng Plasmodium falciparum kháng cloroquin thử độc tính cấp dẫn xuất có hiệu lực cao động vật thực nghiệm” với mục tiêu sau:  Nghiên cứu hiệu lực. ..  Nghiên cứu hiệu lực in vitro dẫn xuất artemisinin 32, 33, 39c, 39d, 39e chủng Plasmodium falciparum kháng cloroquin  Thử nghiệm độc tính cấp dẫn xuất có hiệu lực mạnh động vật thực nghiệm