Thử nghiệm độc tính cấp đường uống của chuột nhắt trắng được tiến hành theo phương pháp cổ điển.
Chuẩn bị ĐVTN: Chuột sau khi mua về được nuôi giữ trong điều kiện môi trường thí nghiệm, yên tĩnh, thoáng khí, nhiệt độ từ 20 – 30⁰C, độ ẩm phù hợp 50 – 60%, hạn chế tiếng ồn, chuồng nuôi giữ phải có kích thước phù hợp, đủ thức ăn và nước uống, thoáng, sạch sẽ. Chuột được nuôi ổn định trong 2 – 3 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm và trước khi dùng thuốc ở trong tình trạng nhịn đói qua đêm (12 – 15 giờ), sau khi dùng thuốc không cho ăn 1 – 2 giờ. Khi làm thực nghiệm đánh dấu chuột bằng dung dịch acid picric 1%, chia ngẫu nhiên 130 con vào các lô, mỗi lô 10 con.
Chuẩn bị mẫu thử: Bột chất 32 nghiền nhỏ bằng cối rồi phân tán vào dung môi gôm Arabic 1% đã được pha sẵn. Dung dịch thu được ở dạng hỗn dịch.
Đường dùng thuốc: Thử theo đường uống, đưa thẳng thuốc vào dạ dày bằng kim đầu tù. Số lần và thể tích dùng thuốc: Dùng 1 liều duy nhất trong ngày, thể tích 01 ml/1 gam chuột. Tiến hành:
Chuột để nhịn đói qua đêm (16h), cân trọng lượng.
Tiến hành với các liều thử nghiệm: 800, 1000, 1300, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 4800, 5000, 5200 mg/kg.
Cho chuột uống thuốc, sau khi uống 2 giờ cho ăn uống lại bình thường. Theo dõi chuột trong 1 tuần sau khi dùng thuốc. Chỉ tiêu quan sát gồm :
Biểu hiện độc tính cấp đặc biệt ngay sau khi dùng thuốc, những bất thường về hành vi, vận động như đi lại, cử động, co giật; biểu hiện của các bộ phận, giác quan như mắt, đuôi, lông.
Theo dõi tình trạng sức khỏe: khả năng tiêu thụ thức ăn, nước uống, tình trạng phân.
Trọng lượng chuột: trước và sau khi kết thúc thử nghiệm.
Số lượng chuột bị chết (nếu có) ứng với mức liều thử, dấu hiệu suy kiệt, nhiễm độc nặng, hấp hối kéo dài, không có khả năng sống sót thì tính như trường hợp con vật bị chết.
Mổ quan sát đại thể với tất cả chuột bị chết trong thời gian theo dõi và cả những con chuột còn sống sót sau thời gian theo dõi để xem các cơ quan: tim, gan, thận, phổi, bàng quang và ruột để xem có gì bất thường không.
Chỉ tiêu đánh giá:
Liều LD0 mg/kg: liều cao nhất không gây chết chuột.
Liều chết trung bình (LD50) mg/kg: liều gây chết 50% số súc vật thí nghiệm được tính theo chương trình Probit (Probit analysis program) của Michel Raymond, 1987 (Pháp).
Liều chết tuyệt đối (LD100) mg/kg: liều gây chết 100% số súc vật thí nghiệm. Dấu hiệu ngộ độc, biểu hiện bất thường.
do thuốc.
CHƯƠNG 3.
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.1. Thử nghiệm hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e
Nuôi cấy P. falciparum kháng CHQ (K1) trong labô luôn được duy trì liên tục và trước khi thử thuốc 2 ngày phải đạt mật độ KST 3 – 5%. Dưới đây là kết quả duy trì chủng K1 trong 10 ngày trước khi thử thuốc.
Bảng 3.1. Mật độ KST chủng P. falciparum kháng CHQ trong 10 ngày trước khi thử thuốc
Ngày Tổng số HC đếm Số HC nhiễm Mật độ KST (%) Lưu ý 1 10000 240 2,4
2 10000 750 7,5 Cấy chuyển xuống
0,5%
4 10000 290 2,9
5 10000 580 5,8 Cấy chuyển xuống
0,5%
6 10000 90 0,9
7 10000 370 3,7
8 10000 620 6,2 Cấy chuyển xuống (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
0,5%
9 10000 60 0,6
10 10000 340 3,4
Nhận xét:
Qua bảng 3.1 trong 10 ngày trước tiến hành thực nghiệm theo dõi qui trình nuôi chủng K1 thấy chủng được nuôi duy trì đúng qui trình, đảm bảo mật độ KST ổn định để tiến hành đưa vào thử với các thuốc theo yêu cầu. Kết quả về mật độ KST 2 ngày trước thử thuốc thỏa mãn mục tiêu đặt ra để đem đi thử nghiệm với thuốc ART và dẫn xuất.
Tiếp theo tiến hành thử hoạt tính của thuốc trên KST P. falciparum kháng CHQ (K1) nuôi cấy theo phương pháp thử thuốc 48 giờ của Nguyễn Đình Phúc với dãy nồng độ 3 x 10-9, 10 x 10-9, 30 x 10-9, 100 x 10-9, 300 x 10-9, 1000 x 10-9 mol/L.
Tiến hành nuôi cấy KST với 5 dẫn xuất và ART, sau 48 giờ tiến hành làm lam giọt mỏng xác định đáp ứng của chủng với các thuốc thử bằng cách xác định tỉ lệ ức chế KST của từng thuốc thử ở mỗi nồng độ nghiên cứu. Kết quả thể hiện ở các bảng sau:
Bảng 3.2. Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 32
Giếng CM (nmol/L) Tỉ lệ ức chế KST (%) SD CM 1 2 3 4 32 ART CM
(nmol/L) 32 ART 32 ART 32 ART 32 ART
3 37 30 34 25 32 18 35 32 34,5 1,0 26,2 3,1
10 46 49 43 43 47 38 42 47 44,5 1,2 41,8 2,7
100 79 84 79 91 81 80 89 81 82 2,4 84 2,5
300 98 95 95 98 92 87 96 95 95 1,3 93,8 2,3
1000 100 100 100 100 96 96 100 100 99 1,0 98,7 1,3
Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ ức chế chủng P. falciparum K1 của chất 32
Nhận xét:
Bảng 3.2 và biểu đồ 3.1 cho thấy:
Hoạt chất 32 ở nồng độ thấp nhất (3 nmol/L) đã có tác dụng ức chế chủng K1 với tỉ lệ 34,5%, khi nồng độ càng cao thì tỉ lệ ức chế KST của chất 32 càng tăng. Ở nồng độ 300 nmol/L thì tỉ lệ ức chế KST đã đạt 95%, nhưng khi tăng lên nồng độ cao nhất là 1000 nmol/L thì vẫn chỉ đạt 99% chưa đạt mức 100%. So sánh với tỉ lệ ức chế chủng K1 của ART thì tỉ lệ ức chế KST của chất 32 ở 2 nồng độ thấp (3 và 10 nmol/L) cao hơn ART, còn ở các nồng độ còn lại thì không có sự khác biệt nhiều.
Bảng 3.3. Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 33
Giếng CM
(nmol/L)
Tỉ lệ ức chế KST (%) SD
CM 1 2 3 4
(nmol/L) 33 ART 33 ART 33 ART 33 ART 33 ART
3 21 30 29 25 27 18 24 32 25,2 1,7 26,2 3,1
10 38 49 38 43 37 38 39 47 38 0,4 41,8 2,7
100 79 84 76 91 80 80 81 81 79 1,1 84 2,5
300 95 95 95 98 97 87 98 95 96,5 1,0 93,8 2,3
1000 100 100 98 100 100 96 100 100 99,5 0,5 98,7 1,3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét:
Qua bảng 3.3 nhận thấy chất 33 ở nồng độ thấp (3 và 10 nmol/L) tỉ lệ ức chế chủng K1 chỉ đạt dưới 50% (25,2% và 38%) và tăng dần lên ở nồng độ cao hơn. Tuy nhiên, khi so sánh với ART thì tỉ lệ ức chế chủng K1 của chất 33 ở các nồng độ hầu hết đều thấp hơn tỉ lệ ức chế KST của ART, còn ở 2 nồng độ cao nhất (300 và 1000 nmol/L) thì tỉ lệ ức chế KST lại cao hơn.
Bảng 3.4. Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 39c
Giếng CM (nmol/L) Tỉ lệ ức chế KST (%) SD 1 2 3 4 CM
(nmol/L) 39c ART 39c ART 39c ART 39c ART 39c ART
3 0 30 0 25 0 18 0 32 0 26,2 3,1 10 20 49 15 43 12 38 17 47 16 1,7 41,8 2,7 30 40 62 38 70 41 68 39 62 39,5 0,6 65,6 2,1 100 50 84 59 91 52 80 51 81 53 2,0 84 2,5 300 98 95 97 98 99 87 100 95 98 0,6 93,8 2,3 1000 100 100 100 100 100 96 100 100 100 98,7 1,3
Nhận xét:
Qua bảng 3.4 cho thấy chất 39c ở nồng độ 3 nmol/L không có khả năng ức chế chủng K1 và chỉ bắt đầu có tác dụng ức chế từ nồng độ 10 nmol/L (16%), sau đó thì tăng mạnh và đến nồng độ 1000 thì tỉ lệ ức chế đạt 100%. So sánh với ART thì ở 4 mức nồng độ đầu 3; 10; 30; 100 nmol/L tỉ lệ ức chế chủng K1 kém hơn hẳn, nhưng đến nồng độ 300 và 1000 nmol/L thì cũng cao hơn.
Bảng 3.5. Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 39d
Giếng CM (nmol/L) Tỉ lệ ức chế KST (%) SD CM 1 2 3 4 CM
(nmol/L) 39d ART 39d ART 39d ART 39d ART 39d ART
3 0 30 0 25 0 18 0 32 0 26,2 3,1 10 6 49 0 43 5 38 0 47 2,75 1,6 41,8 2,7 30 39 62 28 70 28 68 40 62 33,7 3,3 65,6 2,1 100 87 84 88 91 90 80 96 81 90 2,0 84 2,5 300 98 95 98 98 99 87 100 95 99 0,4 93,8 2,3 1000 100 100 100 100 100 96 100 100 100 98,7 1,3 Nhận xét:
Qua bảng 3.5 cho thấy chất 39d ở nồng độ 3 nmol/L cũng không có khả năng ức chế chủng K1. Ở 2 nồng độ 10 và 30 nmol/L, tỉ lệ ức chế chủng K1 dưới 50%, sau đó bắt đầu tăng mạnh ở 3 nồng độ cuối (100; 300; 1000 nmol/L) từ 90%; 99%; 100%. So sánh với tỉ lệ ức chế KST của
ART thì hoàn toàn khác biệt, ở 2 nồng độ đầu 3 nmol/L, 10 nmol/L chất 39d thấp hơn ART 20 lần, nhưng đến 3 nồng độ cuối thì lại có khả năng ức chế KST cao hơn.
Giếng CM (nmol/L) Tỉ lệ ức chế KST (%) SD 1 2 3 4 CM
(nmol/L) 39e ART 39e ART 39e ART 39e ART 39e ART
3 21 30 24 25 21 18 25 32 22,7 1 26,2 3,1 10 42 49 43 43 39 38 42 47 41,5 0,9 41,8 2,7 30 59 62 63 70 59 68 63 62 61 1,1 65,6 2,1 100 79 84 85 91 86 80 87 81 84,2 1,8 84 2,5 300 87 95 97 98 94 87 99 95 94,3 2,6 93,8 2,3 1000 98 100 100 100 99 96 100 100 99,2 0,5 98,7 1,3
Bảng 3.6. Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 39e
Nhận xét: Qua bảng 3.6 ta thấy ở nồng độ càng cao, tỉ lệ ức chế chủng K1 của chất 39e càng cao. Tương tự chất 32, ở 2 nồng độ đầu tỉ lệ ức chế chủng K1 đều dưới 50% và tăng dần ở các nồng độ cao hơn. So sánh với ART thì tỉ lệ ức chế chủng K1 của chất 39e ở hầu hết các nồng độ đều không có sự khác biệt nhiều, chỉ riêng ở nồng độ 3 và 30 nmol/L là có khả năng ức chế KST thấp hơn ART.
Từ tỉ lệ ức chế KST của các chất ART, 32, 33, 39c, 39d, 39e được xử lý số liệu bằng chương trình Probit và ANOVA để xác định nồng độ ức chế 50% KST phát triển (IC50) và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), kết quả thu được thể hiện ở các bảng sau:
Bảng 3.7. Nồng độ ức chế 50% KST phát triển của 5 dẫn xuất ở chủng K1 Mẫu thử IC50 (nmol/L) P
32 (2) 14,5 3,6 P2,1 > 0,05
33 (3) 33,8 1,8 P3,1 < 0,05
39c (4) 91,2 2,9 P4,1 < 0,05
39d (5) 65,1 4,8 P5,1 < 0,05
39e (6) 27,8 0,7 P6,1 < 0,05
Biểu đồ 3.2. Giá trị IC50 của ART và 5 dẫn xuất trên chủng P. falciparum K1
Nhận xét:
Qua bảng 3.7 và biểu đồ 3.2 cho thấy:
Trong 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e đem đi thử nghiệm, dẫn xuất 39c có nồng độ ức chế 50% KST phát triển cao nhất (91,2 2,9 nmol/L), chất 32 có IC50 thấp nhất (14,5 3,6 nmol/L). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
So sánh với IC50 của ART thì IC50 của dẫn xuất 39c cao gấp 5 lần (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05); các dẫn xuất 33, 39d, 39e có IC50 nhỏ hơn IC50 của chất 39c nhưng vẫn cao hơn IC50 của ART (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05). Riêng dẫn xuất 32 có IC50 tương tự IC50 của ART (sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P > 0,05).
Như vậy trong 5 dẫn xuất thì chất 32 là chất có tác dụng ức chế P. falciparum K1 tốt nhất và tương tự ART. Còn các dẫn xuất 33, 39c, 39d, 39e đều có tác dụng ức chế chủng P. falciparum K1 thấp hơn dẫn xuất 32 và ART.
Bảng 3.8. Nồng độ ức chế tối thiểu của 5 dẫn xuất trên chủng P. falciparum K1
Mẫu thử MIC ( nmol/L)
ART 100 32 100 33 100 39c 300 39d 300 39e 100
Biểu đồ 3.3. Giá trị MIC của ART và 5 dẫn xuất trên chủng P. falciparum K1
Nhận xét:
Qua bảng 3.8 và biểu đồ 3.3 cho thấy:
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e phân làm 2 nhóm và có độ chênh lệch rõ rệt . Nhóm 1 gồm chất 32, 33, 39e với MIC = 100 nmol/L và nhóm 2 gồm chất 39c, 39d với MIC = 300 nmol/L, trong đó nhóm 2 có MIC gấp 3 lần MIC nhóm 1. Như vậy, phải ở nồng độ gấp 3 nhóm 1, nhóm 2 mới có khả năng ức chế tối thiểu chủng K1, điều này chứng tỏ hoạt tính của nhóm 2 kém hơn nhóm 1 nhiều.
So sánh với MIC của ART thì nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nhóm 1 bằng MIC của ART (100nmol/L), còn MIC của nhóm 2 cao gấp 3 lần ART (300 nmol/L).
Qua các kết quả IC50 và MIC của 5 dẫn xuất thử và ART, nhận thấy rằng chất 32 có hoạt lực in vitro trên chủng P. falciparum K1 mạnh nhất trong 5 mẫu thử và tương tự ART. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn dẫn xuất 32 để thử nghiệm độc tính cấp trên ĐVTN.
3.1.2. Thử nghiệm độc tính cấp của hợp chất 32
Từ 130 con chuột thực nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 13 nhóm (10 con/nhóm). Sau đó, chuột được cho uống chất 32 ở các nồng độ khác nhau theo phương pháp cổ điển cho kết quả ở bảng sau:
Bảng 3.9. Kết quả sau 7 ngày theo dõi chuột uống chất 32 ở nồng độ khác nhau Lô Liều dùng (mg/kg) n Số chuột chết
1 800 10 0/10 2 1000 10 0/10 3 1300 10 0/10 4 1500 10 0/10 5 2000 10 0/10 6 2500 10 0/10 7 3000 10 0/10 8 3500 10 0/10 9 4000 10 0/10 10 4500 10 0/10 11 4800 10 0/10 12 5000 10 0/10
13 5200 10 0/10
Nhận xét:
Sau khi cho chuột uống thuốc và theo dõi trong 7 ngày, chuột vẫn ăn uống, hoạt động bình thường, bài tiết bình thường, lông mượt, không có biểu hiện bất thường và không có chuột tử vong với tất cả nồng độ thuốc thử từ 800 mg/kg đến 5200 mg/kg.
Toàn bộ chuột sau khi theo dõi 7 ngày được mổ để quan sát đại thể các cơ quan: tim, phổi, gan, thận, ruột, bàng quang. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả quan sát cân nặng và đại thể các cơ quan khi mổ toàn bộ cả 13 lô chuột sau 7 ngày theo dõi
Chỉ tiêu quan sát Biểu hiện Tỷ lệ
Cân nặng Không thay đổi đáng kể 100%
Tim Bình thường 100%
Gan Bình thường 100%
Thận Bình thường 100%
Phổi Bình thường 100%
Bàng quang Bình thường 100%
Ruột 2 con bị xuất huyết niêm mạc nhẹ 1,54%
Nhận xét:
Sau khi quan sát cân nặng và đại thể các cơ quan chuột: tim, phổi, gan, thận, ruột, bàng quang thì chúng tôi nhận thấy cân nặng và các cơ quan đều bình thường trừ 2 con trong lô 13 bị xuất huyết niêm mạc nhẹ ở ruột chiếm 1,54% số chuột thử nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2. BÀN LUẬN
3.2.1. Kết quả thử hoạt lực in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e
Tiến hành nghiên cứu thử nghiệm đánh giá tác dụng của 5 dẫn xuất 10-[(2’-hidroxy-3’- imidazol) propyl] deoxoartemisinin (32), 10-[(2’α–hidroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (33), 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl) acetamide (39c), 10- (deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide( 39d), 10-(deoxoartemisinin)-N- phenethylacetamide (39e) đối với KST P. falciparum kháng CHQ nuôi cấy trên in vitro thông qua việc xác định các chỉ số đánh giá là nồng độ ức chế 50% KST phát triển (IC50) và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy cả 5 dẫn xuất đều có tác dụng in vitro với chủng P. falciparum kháng CHQ (K1). Mặc dù khả năng ức chế của các chất khác nhau, nhưng đều có đặc điểm chung là ở nồng độ càng cao thì khả năng ức chế KST càng cao và ở 2 nồng độ cao nhất 300; 1000 nmol/L đều có khả năng ức chế KST cao hơn ART. Qua tỉ lệ ức chế KST ta xác định được IC50 để đánh giá rõ hơn về hoạt tính in vitro của 5 dẫn xuất và so sánh với ART.