Bước 1:
Chuẩn bị thuốc thử: Hòa tan 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e vào trong dung môi DMSO để có các dung dịch gốc cùng nồng độ 10-2 mol/L. Sau đó, từ dung dịch gốc pha loãng vào trong
môi trường RPHS để được các dãy nồng độ các thuốc thử lần lượt là 3, 10, 30, 100, 300, 1000 nmol/L. Tiến hành tương tự với ART để thu được các mẫu có nồng độ tương ứng.
Chuẩn bị mẫu thử: Nuôi cấy KSTSR P. falciparum kháng CHQ (K1) liên tục trong môi trường RPHS theo phương pháp Trager – Jensen đã trình bày ở mục 2.2.1.1. Mật độ KST trước khi thử 2 ngày phải đạt đến 3 - 5% HC nhiễm.
Bước 2:
Tiến hành thử trên phiến nhựa 96 giếng, thực nghiệm được tiến hành 2 lần.
Mỗi giếng trên phiến nhỏ 100μl môi trường RPHS và 100μl thuốc ở các nồng độ khác nhau (mỗi nồng độ thử 2 giếng). Sau đó nhỏ thêm 10μl dịch treo KST (40%) vào các giếng để tạo thành dịch treo 4% với mật độ 0,3 – 0,5%. Lắc nhẹ phiến nhựa để trộn KST và môi trường. Đặt các phiến nhựa vào bình nến, đốt nến để tạo nồng độ khí thích hợp: 5% CO2, 5% O2 và 90% N2 và nuôi trong tủ ấm 37 C0,5; sau 24h thay khí bình nến 1 lần.
Sau 48 giờ, lấy mẫu nuôi ra, làm lam giọt mỏng ở mỗi giếng, nhuộm Giemsa, soi ở kính hiển vi và đếm số lượng KST trên từng lam giọt mỏng theo 10.000 HC ở các giếng chứng và các giếng có nồng độ thuốc khác nhau, tính mật độ HC nhiễm. Từ đó xác định nồng độ ức chế 50% (IC50) và nồng độ ức chế tối thiểu KST phát triển (MIC).
Chỉ tiêu đánh giá:
Xác định nồng độ ức chế 50% KST phát triển (Inhibitory Concentration 50% – IC50) dựa trên chương trình ANOVA cài sẵn.
Tỉ lệ ức chế KST =
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration – MIC)