Phân lập một số thành phần từ vỏ thân cây gạo và thử tác dụng giảm đau

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam với lợi thế của khí hậu, địa hình đã được thiên nhiên ban tặng nguồn dược liệu dồi dào, phong phú, trong đónhiều loài được sử dụng làm thuốc. Cùng với đólàkho tàng kinh nghiệm trong trồng trọt, thu hái và bảo quản và sử dụng để phòng, điều trị bệnh hay nâng cao sức khỏe con người. Theo thời gian, kho tàng kinh nghiệm sử dụng cây thuốc được kế thừa, hoàn thiện và phát triển để phù hợp với thực tiễn. Như vậy, có thể nhận thấy cây thuốc và vị thuốc y học dân tộc là thế mạnh của ngành Dược Việt Nam hiện nay vàtương lai. Cho nên, việc nghiên cứu sâu về các thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các cây thuốc là rất cần thiết. Cây Gạo có tên khoa học là Bombax malabaricum DC. còn gọi là Mộc miên, bông gòn, ... Cây Gạo rất quen thuộc gần gũi với chúng ta, luôn gắn với hình ảnh làng quê Việt Nam, đặc biệt ở Bắc Bộ. Trong dân gian thường sử dụng vỏ thân cây Gạo để chữa các bệnh về thấp khớp, gãy xương. Ngoài ra, các bộ phận khác cũng được nhân dân sử dụng để chữa một số bệnh như hoa Gạo để chữa lỵ, viêm ruột, rễ chữa đau thượng vị... Năm 20112012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học của vỏ thân và bước đầu phân lập được lupeol, friedelin, daucosterol, catechin từ cắn toàn phần; epicatechin, bis2(ethylhexyl) adipate từ phân đoạn ethyl acetat, thăm dò một số tác dụng sinh học của cao lỏng chiết xuất từ các bộ phận dùng khác nhau của cây Gạo vàđã thu được một số kết quả ban đầu. Nhằm nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của vỏ thân cây Gạo cũng như tác dụng sinh học của vỏ thân cây Gạo, đề tài “Phân lập một số thành phần từ vỏ thân cây Gạo và thử tác dụng giảm đau” được tiến hành với các mục tiêu sau: Chiết xuất phân lập một số thành phần từ vỏ thân cây Gạo.

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

B ộ môn Dược liệu - Đại học Dược Hà Nội

B ộ môn Dược lý - Đại học Y Hà Nội

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Trong su ốt thời gian học tập và làm khóa luận, tôi đã nhận được hướng dẫn

t ận tình của các thầ ỹ thuật viên, bạn bè và gia đình Nhờ sự giúp đỡ quý báu đó mà tôi có thể học tập và hoàn thành tốt khóa luận

c ủa mình

Nhân d ịp này, tôi xin chân thành gửi lời biết ơn sâu sắc tới :

PGS TS Nguyễn Thái An ThS NCS H ồ Thị Thanh Huyền

Những người thầy hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ, động viên, tạo điều

ki ện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm khóa luận

Tôi xin được cảm ơn tất cả các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược lý -trường Đại học Y Hà Nội, đã giúp đỡ cho tôi thử tác dụng sinh học một cách chính xác nhất

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới Đảng ủy, Ban giám hiệu nhà trường, các Ban ngành, các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên ở các bộ môn đã truy ền đạt cho tôi những kiến thức, hiểu biết quý báu trong quá trình họ

Cu ối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình và bạn bè tôi - những người đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên, ủng hộ và tạo điều kiện

t ốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà N ội, ngày 27 tháng 4 năm 2013

Sinh viên Nguyễn Thị Huyền Thư

1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật 3

1.1.1 Vị trí phân loại loài Bombax malabaricum DC 3

1.1.2 Đặc điểm thực vât họ Bombacaceae 31.1.3 Đặc điểm của chi Bombax L 4 1.1.4 Đặc điểm của loài Bombax ceiba L 4

Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 13

2.1.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 13 2.1.3 Động vật thí nghiệm 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ch ữ viết tắt Ch ữ viết đầy đủ

AST Ánh sáng thường

13

C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

DEPT Distortionless Enhactôient by PolarizationTransfer

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

1

H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

DANH M ỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Một số hợp chất được phân lập từ vỏ thân cây Gạo 7

3 Bảng 3.2 Màu sắc và giá trị Rfcủa cắn TP trên SKLM với hệ

4 Bảng 3.3 Màu sắc và giá trị Rfcủa cắn phân đoạn n-hexan

5 Bảng 3.4 Màu sắc và giá trị Rfcủa cắn phân đoạn EtOAc

6 Bảng 3.5 Màu sắc và giá trị Rf của BBV5 với 3 hệ dung môi

7 Bảng 3.6 Màu sắc và giá trị Rf của BBV7 với 3 hệ dung môi

10 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của chế phẩm từ cây Gạo lên số cơn

11 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của chế phẩm từ cây Gạo lên thời gian

DANH M ỤC CÁC HÌNH

3 Hình 3.3 Sắc kí đồ cắn phân đoạn n-hexan với hệ dung môi III 23

4 Hình 3.4 Sắc kí đồ cắn phân đoạn EtOAc với hệ dung môi III 24

5 Hình 3.5 Sơ đồ chiết xuất và phân lập các chất từ vỏ thân cây

6 Hình 3.6 Hình ảnh SKLM của BBV5 với 3 hệ dung môi sau

Hình ảnh SKLM so sánh BBV5 với cắn phân đoạn ethyl acetat trên cùng 1 bản mỏng với hệ dung môi I sau khi phun thuốc thử

28

8 Hình 3.8 Hình ảnh SKLM của BBV7 với 3 hệ dung môi sau

Hình ảnh SKLM so sánh BBV7 với cắn phân đoạn hexan trên cùng 1 bản mỏng với hệ dung môi I sau khi phun thuốc thử

n-30

11 Hình 3.11 Một số mảnh phân tử chính trên phổ khối của BBV5 32

13 Hình 3.13 Ảnh chụp tinh thể của BBV7 dưới kính hiển vi vật

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam với lợi thế của khí hậu, địa hình đã được thiên nhiên ban tặng nguồn dược liệu dồi dào, phong phú, trong đó nhiều loài được sử dụng làm thuốc Cùng với đó là kho tàng kinh nghiệm trong trồng trọt, thu hái và bảo

quản và sử dụng để phòng, điều trị bệnh hay nâng cao sức khỏe con người Theo thời gian, kho tàng kinh nghiệm sử dụng cây thuốc được kế thừa, hoàn thiện và phát triển để phù hợp với thực tiễn Như vậy, có thể nhận thấy cây thuốc và vị thuốc y học dân tộc là thế mạnh của ngành Dược Việt Nam hiện nay và tương lai Cho nên, việc nghiên cứu sâu về các thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các cây thuốc là rất cần thiết

Cây Gạo có tên khoa học là Bombax malabaricum DC còn gọi là Mộc

miên, bông gòn, Cây Gạo rất quen thuộc gần gũi với chúng ta, luôn gắn với hình ảnh làng quê Việt Nam, đặc biệt ở Bắc Bộ Trong dân gian thường sử

dụng vỏ thân cây Gạo để chữa các bệnh về thấp khớp, gãy xương Ngoài ra, các bộ phận khác cũng được nhân dân sử dụng để chữa một số bệnh như hoa

Gạo để chữa lỵ, viêm ruột, rễ chữa đau thượng vị

Năm 2011-2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã khảo sát thành

phần hóa học của vỏ thân và bước đầu phân lập được lupeol, friedelin, daucosterol, catechin từ cắn toàn phần; epicatechin, bis-2-(ethylhexyl) adipate

từ phân đoạn ethyl acetat, thăm dò một số tác dụng sinh học của cao lỏng chiết xuất từ các bộ phận dùng khác nhau của cây Gạo và đã thu được một số

kết quả ban đầu

Nhằm nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của vỏ thân cây Gạo

cũng như tác dụng sinh học của vỏ thân cây Gạo, đề tài “Phân lập một số thành phần từ vỏ thân cây Gạo và thử tác dụng giảm đau” được tiến hành

với các mục tiêu sau:

- Chi ết xuất phân lập một số thành phần từ vỏ thân cây Gạo

- Nghiên c ứu tác dụng sinh học

Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được thực hiện với các nội dung sau:

1 Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

2 Chi ết xuất, phân lập một số thành phần từ phân đoạn n-hexan và phân đoạn ethyl acetat của vỏ thân cây Gạo

3 Nhận dạng các chất phân lập được dựa trên dữ liệu phổ ESI-MS và 1D- và 2D-NMR

4 Th ử tác dụng giảm đau của cao lỏng vỏ thân chiết xuất từ vỏ thân cây

G ạo dựa trên 2 mô hình: gây quặn đau bằng acid acetic và gây đau

b ằng mâm nóng

Chương I

1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

1.1.1 Vị trí phân loại loài Bombax malabaricum DC

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [4], cây Gạo (Bombax malabaricum DC.) có vị trí phân loại như sau:

Phân giới thực vật bậc cao Plantae

Ngành Ngọc lan Magnoliophyta

Lớp Ngọc lan Magnoliopsida

Phân lớp Sổ Dilleniidae

Liên bộ Bông Malvanae

Bộ Bông Malvales

Họ Gạo Bombacaceae

Chi Bombax L

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Gạo Bombacaceae

Cây to, cành thường nằm ngang [2], [10] Đặc trưng bởi cây gỗ (đôi khi

gỗ lớn với gốc bạnh) Thân có khi rất to để dự trữ nước, có tế bào nhầy và khoang nhầy [2], [19] Thân lúc còn non có gai hoặc không, thân của nhiều loài có gai thô [7]

Lá kép chân vịt, lá kèm rụng sớm, cuống dài mọc so le, có lông hình sao và có vẩy phân nhánh [2], [10]

Hoa lớn, lưỡng tính, bao hoa mẫu 5, thường có đài phụ, cánh hoa (nếu có) xếp vặn Nhị 5 nhiều, rời hoặc hợp thành bó hay ống Bao phấn 1 ô, mở

dọc, hạt phấn tròn nhẵn, bầu 5 ô, đính noãn trung trụ [8] Quả thường là nang

chẻ ô [2], vỏ quả có nhiều lông [8] Hạt thường có lông (bông) bao ngoài, thường không có nội nhũ hoặc nội nhũ nghèo [2], [4]

Họ Gạo có 22 chi, 250 loài phân bố ở vùng nhiệt đới, nhất là châu Mỹ

Việt Nam có 5-6 chi, khoảng 10 loài, mọc hoang và được trồng làm cây cảnh [7]

1.1.3 Đặc điểm của chi Bombax L

Bombax trong tiếng Hi Lạp là cây bông, liên tưởng đến những sợi lông

mềm bao bọc quanh hạt [5]

Cây gỗ lớn, có gai, thân có bạnh vè [5] Tán lá rậm Lá mọc so le, có

cuống, lá kép chân vịt rụng vào mùa khô, có 3 hoặc 9 lá chét [5] Hoa đều, lưỡng tính, đơn độc hay tập hợp thành xim ở nách hoặc ở ngọn Đài có dạng đấu với 3 hay 5 thùy Tràng 5 cánh hoa thường có lông mềm Nhị nhiều có bao phấn 1 ô, ít khi 2 ô Bầu thượng với 5 ô nhiều noãn [5] Quả nang dai, nở thành 5 van, hạt có lớp lông len dày, bay được, lông của quả dùng làm chăn đệm [4], [5]

Ở nước ta chi Bombax L có các loài sau: [10]

Bombax anceps Pierre

Bombax malabaricum DC

Bombax insignis Wall

Bombax thorelii Gagn

Bombax albidum

1.1.4 Đặc điểm của loài Bombax malabaricum DC

Tên đồng danh [25]: Bomba ceiba L

Salmalia malabarica (DC.) Schott , Endll

Họ Gạo Bombacaceae

Cây gỗ cao đến hơn 15m, có gai hình nón, bạnh vè ở gốc [5], [18] Thân sần sùi, màu nâu xám, vỏ thân dày từ 1,8-2,5cm, cây trưởng thành gai bớt nhọn hơn, cây già thì có các vết nứt dọc theo cây [25]

Cành hình trụ, mọc ngang, không có gai, mọc phía trên Cành non dày, không gai Cây có thể dễ dàng nhận ra bởi sự sắp xếp các cành mọc ra từ thân thành các vòng xoắn khá đều nhau [5], [18], [23]

Lá mọc so le, kép chân vịt gồm 5-7 lá chét, hình mác, gốc thuôn, đầu

nhọn, dài 9-15cm, rộng 4-5cm, hai mặt nhẵn, mép nguyên, cuống chung dài hơn phiến lá [15] Lá mới thường không xuất hiện cho đến khi hoa nở [23]

Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm, hoa rộng 15-17cm, đài vàng, hoa màu đỏ mọc trên những cành nhỏ trước khi cây ra lá non Đài hình chuông, đài dày như da, bao bọc lấy nụ hoa, khi nở rách ra thành 3-5 mảnh không đều, có 5 răng tù và ngắn, màu nâu xám Tràng 5 cánh nạc, rời nhau,

mặt ngoài phủ lông nhung Nhị nhiều hợp thành 6 bó, 1 bó ở giữa, 5 bó xung quanh, ngắn hơn cánh hoa Bầu hình nón, có lông mềm màu trắng nhạt [7], [10], [15], [18]

Quả nang to, hình thoi, dài 8-15cm, khi nứt 5 mảnh, hạt có nhiều lông

trắng dài, hình trứng, phát tán cùng sợi bông khi quả chín tách vỏ Ra hoa tháng 3, quả già tháng 5 [17], [19]

1.1.5 Phân b ố, sinh thái

Trên thế giới, cây Gạo phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, được trồng nhiều ở Ấn Độ, Malaysia, Lào, Thái Lan, Việt Nam, vùng Himalaya [18], [25]

Ở Ấn Độ, cây sống được ở vùng tương đối khắc nghiệt, ngay cả khi nhiệt độ về mùa đông 2-30

C hoặc thấp hơn, mùa nóng có khi đến 490

C Do

khả năng chịu hạn tốt và có lớp vỏ dày, những cây to có thể tồn tại qua các đợt cháy rừng, vì vậy cây Gạo là cây trồng rừng quan trọng [18], [25]

Ở nước ta, cây Gạo chỉ thấy trồng các tỉnh phía Bắc, từ Quảng Bình trở

ra, thường mọc ở đất trồng ven rừng, đồi, nhất là dọc theo bờ suối Cây được

trồng ở đầu làng, ven đường đi hoặc đình chùa lấy bóng mát Cây mọc nhanh,

mọc được trên nhiều loại đất kể cả khô cằn, đá sỏi [18]

Cây rụng lá vào mùa đông, ra hoa vào mùa xuân [18]

Cây Gạo rất dễ trồng : trồng bằng hạt hoặc bằng cành cây trồng bằng cành Tuy nhiên để cho cây mọc thẳng, người ta tạo cây giống từ hạt Cây

rụng lá vào mùa đông, ra hoa vào mùa xuân [18]

Theo [18], vỏ thân chứa 3,01% tanin

Năm 2011-2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được catechin từ cắn toàn phần, bis (2-ethyl hexyl) adipate, epicatechin từ phân đoạn ethyl acetat [1], [12], [13], [16]

Năm 2003, Saleem và cộng sự đã tìm thấy shamimicin có cấu trúc: bis-2(3,4-dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-3,7-5-O-xylopyranosyloxy-2H-1-benzopyran [28]

1,1-Faizi S và cộng sự đã tìm thấy shamiminol, một glycoside có cấu tạo 3,4,5-trimethoxyphenol 1-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside Ngoài ra còn có stigmasta-3,5-diene, lupeone, 2a-O-beta-D-glucopyranoside

3-B ảng 1.1 Một số hợp chất được phân lập từ vỏ thân cây Gạo

5 Daucosterol

17 18 19

20 22

5

24 26 27 28 29

O 3 O HO HO HO OH

20 22

28

29 30

23 24

OH

O O

HO

OH OH OH

O O

HO

O OH

OH OH

HO

[28]

9

Bis 2(ethylhexyl)

adipate

O

1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC

Cây Gạo được biết đến với nhiều tác dụng như: kháng khuẩn, chống viêm, giảm đau, hạ sốt, hạ huyết áp, giảm đường huyết, bảo vệ gan, chống oxy hóa, chống ung thư, bảo vệ thành mạch Một số tác dụng dược lý liên quan tới vỏ thân cây Gạo như:

1.3.1 Tác d ụng chống viêm

Tác dụng chống viêm của epicatechin, cắn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân và cao lỏng vỏ thân được thử nghiệm trên mô hình gây u hạt bằng amian

Kết quả cho thấy các chế phẩm từ cây Gạo với liều tương đương 12g dược

liệu/kg/ngày đều làm giảm trọng lượng u hạt so với lô chứng (p< 0,05) tác

dụng này tương đương với prednisolon liều 5mg/kg (p>0,05) Tuy nhiên liều 6g dược liệu/kg/ngày chưa làm giảm trọng lượng khối u hạt một cách rõ rệt [12]

Trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin, tác dụng chống viêm của epicatechin và cắn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân cũng được báo cáo là có tác dụng Epicatechin và cắn ethyl acetat với liều tương đương với 4g dược liệu/kg và 8g dược liệu/kg có tác dụng làm giảm phù chân chuột rõ

rệt [1]

1.3.2 Tác d ụng chống oxy hóa

Bhusan và cộng sự đã tiến hành đánh giá khả năng chống oxy hóa của

dịch chiết nước và dịch chiết ethanol của vỏ cây trên nhiều mô hình khác nhau như: sử dụng DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl), ABTS (2,2 azino bis-3-ethyl-benzo-thiazoline-6-sulfonic acid), oxid nitric so sánh với acid ascorbic Trong tất cả các mô hình nghiên cứu, các dịch chiết đều có tác dụng

chống oxy hóa mạnh [21]

1.3.3 Tác d ụng hạ đường huyết

Tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết ethanol vỏ cây được đánh giá trên mô hình gây tiểu đường bằng alloxan Trong thí nghiệm, chuột được

uống dịch chiết (100mg/kg và 200mg/kg) và glibenclamide (20mg/kg) Với

liều 200mg/kg làm giảm mức đường huyết rõ rệt ở những con chuột mắc bệnh

tiểu đường trong mô hình gây tiểu đường bằng alloxan Tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết có thể là thông qua cơ chế kích thích sử dụng glucose ở ngoại vi [30]

1.3.4 Tác d ụng kháng khuẩn và chống nấm

Dịch chiết nước của vỏ cây được dùng trong thử nghiệm kháng lại các

chủng vi khuẩn Gr(+) như Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumoniae, vi khu ẩn Gr(-) như Escherchia coli, Klebsiella aerogenes, Neisseria gonorrhoeae và n ấm như Candida albicans Kết quả

cho thấy dịch chiết nước có hoạt tính kháng khuẩn và chống nấm do sự có

mặt của tanin và hợp chất phenolic Nghiên cứu này đã phần nào sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng dược liệu trong y học dân gian [20]

1.3.5 Tác dụng hạ huyết áp

Năm 2003, Saleem và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp của

bột quả, dịch chiết ether dầu hỏa của vỏ thân và hoa lên chuột Dịch chiết ether dầu hỏa của vỏ thân liều 10mg/kg làm giảm huyết áp động mạch 58%, trong khi lupeol liều 5mg/kg gây giảm 44% và liều 15mg/kg gây giảm 52%

Dịch chiết methanol vỏ cây đã khử chất béo tại liều 10mg/kg làm giảm 30%

và liều 30mg/kg làm giảm 51% [28]

1.3.6 Th ử độc tính cấp

Trong một nghiên cứu về độc tính cấp của dịch chiết methanol từ vỏ thân đã khử chất béo, liều 200mg/kg chưa cho thấy độc tính trên chuột Nhưng liều 1000mg/kg, khi quan sát mô học của thận, tim và gan thấy tác hại

của phân đoạn methanol từ vỏ thân ảnh hưởng lên thận, tim và gan [28]

Trên mô hình thử độc tính cấp theo phương pháp Litchfied-Wilcoxon, chưa thấy có chuột chết khi sử dụng cao lỏng 4:1tại liều 300g/kg thể trọng chuột Liều này cao gấp 50 lần liều dùng cho người, nhưng chuột được thử

vẫn khỏe mạnh Như vậy có thể thấy dược liệu vỏ thân cây Gạo khá là an toàn [16]

vỏ cây còn là thuốc chữa chứng sốt, rễ chữa sốt thương hàn, viêm amidan, liệt dương [9]

Tất cả giã nát trộn với lòng trắng trứng gà, đắp bó tại chỗ[18]

- Ch ữa quai bị: vỏ Gạo sắc uống 10-20g đồng thời giã nát đắp [9]

- Ch ữa sai khớp: vỏ Gạo giã nát với bã chè tươi, lá cây lai lá cây chẹo,

xào nóng, đắp [18]

- Ch ữa bầm giập, bong gân, trẹo khớp: vỏ cây Gạo

Lá tre

Mỗi thứ 1 nắm, giã nát, thêm ít rượu, đắp vào chỗ đau [18]

- Ch ữa đau thượng vị: Rễ/ vỏ Gạo 30g

Rễ hoàng lực 6g Đun sôi, lấy nước uống [17]

- Sưng tấy, đơn độc, quai bị, viêm dạ dày: vỏ Gạo tươi (bỏ bên ngoài)

30-40g thái miếng 30-40g, sắc, uống [17]

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

- Nơi thu hái: xã Hương Sơn, huyện Mỹ Đức, thành phố Hà Nội

- Thời gian thu hái: tháng 4 năm 2011

- Mẫu nghiên cứu đã được TS Đỗ Thị Xuyến (Viện Sinh thái và tài nguyên sinh học) giám định tên khoa học là Bombax malabaricum DC - họ Gạo

(Bombacaceae)

- Mẫu nghiên cứu tác dụng sinh học: vỏ thân cây Gạo được làm nhỏ, sấy khô, đem chiết bằng nước 3 lần theo phương pháp sắc, mỗi lần sắc khoảng 2h, dịch

lọc được đem cô cách thủy đến cao lỏng 4:1 (CLG1)

2.1.2 Hóa ch ất, thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa ch ất

Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV

2.1.2.2 Máy móc, thi ết bị

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Cân phân tích Precisa

- Nồi cách thủy

- Máy cất quay chân không Buchi Rotavapor R-200

- Bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 (Merck)

- Cột sắc ký

- Đèn tử ngoại

- Tủ sấy SHELLAB

- Máy đo phổ khối lượng (ESI-MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap,

Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo điểm nóng chảy: Kofler micro-hotstage, Viện Hóa học các hợp

chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Kính hiển vi

- Mâm nóng của hãng Ugo-Basile (Italy)

2.1.3 Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng

20 ± 2g, của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

- Các súc vật được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với đầy đủ

thức ăn và nước uống tại Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Định tính các thành phần hóa học

Định tính các nhóm chất trong mẫu nghiên cứu bằng SKLM [3]

- Dịch chấm sắc kí: Mẫu phân tích hòa tan trong methanol

- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn được hoạt hóa 1h ở

1100C Để nguội

- Khai triển với nhiều hệ dung môi khác nhau

- Hiện màu với thuốc thử H 2SO4 10% trong cồn 96%, quan sát dưới ánh sáng thường

- Tiến hành: Chấm dịch chiết lên trên bản mỏng, sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi

bình, sấy nhẹ cho bay hết dung môi Phát hiện vết ở AST, soi dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm Sau đó phun thuốc thử là dung dịch

H2SO4 10% trong ethanol 96% lên bản mỏng, sấy khô ở nhiệt độ 1100

C rồi quan sát dưới AST

2.2.2 Chi ết xuất

- Xác định độ ẩm

Vỏ thân sau khi sấy khô nghiền thành bột thô Lấy khoảng 2g bột mẫu nghiên cứu để xác định độ ẩm của dược liệu Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100

C, rắc bột dược liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt cân, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình Đọc kết quả Tiến hành 3

lần, lấy kết quả trung bình

- Chiết xuất

Chiết bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi methanol ở nhiệt độ phòng Sau đó, sử dụng phương pháp chiết lỏng- lỏng lần lượt với các dung môi n-hexan, cloroformvà ethyl acetat Các phân đoạn được thu hồi dung môi

tới cắn Cắn được làm khô đến khối lượng không đổi Cân cắn

- Tính hiệu suất chiết

Trong đó X: hiệu suất chiết (%)

a: khối lượng cắn toàn phần x: độ ẩm dược liệu

M: khối lượng dược liệu đem chiết

2.2.3 Phân l ập

Sử dụng phương pháp sắc kí cột thông dụng để phân lập các chất

Chất hấp phụ: silicagel

Ti ến hành

- Chu ẩn bị cột:

Rửa sạch, làm khô, lắp cố định vào giá theo chiều thẳng đứng

- Ổn định cột:

Lót 1 lớp bông dưới đáy cột

Cho silicagel vào cốc có mỏ, thêm dung môi rửa giải vào khuấy lên

Mở vòi, rót hỗn dịch trên vào cột, cho dung môi chảy và để silicagel

lắng tự nhiên xuống đáy cột Khi dung môi chảy gần hết trong cột, tiếp tục rót

hỗn dịch trên vào cột Chú ý không để khô dung môi ở cột Tiếp tục dùng dung môi hứng được rót lên cột và cho chảy liên tục 1 thời gian Ổn định cột trong 12h

Kiểm tra độ tinh khiết

Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng SKLM Mỗi chất phân lập được kiểm tra bằng nhiều hệ dung môi khác nhau

2.2.4 Nh ận dạng chất tinh khiết phân lập được

Nhận dạng chất phân lập dựa trên dữ liệu phổ MS, 1D- và 2D-NMR

2.2.5 Th ử tác dụng giảm đau

*M ẫu nghiên cứu

Cao lỏng 4: 1 chiết xuất từ vỏ thân cây Gạo

* Phương pháp Koster – gây quặn đau bằng acid acetic:

Nguyên tắc: Cho chuột uống thuốc thử trong thời gian nhất định ngày, sau đó gây đau bằng cách tiêm acid acetic vào ổ bụng Đếm số cơn quặn đau

từ phút thứ 5 đến phút thứ 30 So sánh kết quả của mẫu thử và mẫu chứng

Tiến hành:

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con

- Lô 1 (đối chứng): uống nước cất

So sánh kết quả của mẫu thử và mẫu chứng

Tiến hành:

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con

- Lô 1 (đối chứng): uống nước cất

- Lô 2: uống codein

- Lô 3, 4: uống thuốc thử

Thí nghiệm được tiến hành tại hai thời điểm: trước khi cho chuột uống thuốc thử và sau khi cho chuột uống thuốc thử 3 ngày liền Đặt chuột lên mâm nóng, luôn duy trì ở nhiệt độ 56o

C bằng hệ thống ổn nhiệt Tính thời

gian từ lúc đặt chuột vào mâm nóng đến khi chuột liếm chân sau Loại bỏ

những chuột phản ứng trước 8 giây và sau 60 giây

* Xử lý số liệu

Các số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê y sinh học theo t- test - Student và test trước sau (Avant-après) Biểu diễn ± SE

Quy ước: *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001

Cân chính xác 1kg bột dược liệu, ngâm với dung môi methanol ở nhiệt

độ phòng Rút dịch chiết 3 lần, lọc Gộp các dịch lọc lại, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn Cắn được làm khô đến khối lượng không đổi Cân

cắn, thu được 71g cắn toàn phần kí hiệu là BBV

Hiệu suất chiết: X=7,73%

Hòa tan cắn toàn phần vào nước nóng 600

C Sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, cloroform, ethyl acetat Thu được cắn phân đoạn n-hexan, cloroform, ethyl acetat với khối lượng tương ứng lần lượt là 15,21(g); 30,18(g) và 16,02(g), kí

hiệu lần lượt là BBVA, BBVB, BBVC Dịch chiết nước còn lại kí hiệu là BBVD

3.2 ĐỊNH TÍNH CẮN TOÀN PHẦN

3.2.1 Định tính cắn toàn phần bằng SKLM

- Dịch chấm sắc ký: cắn TP được hòa tan trong methanol

- Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi khai triển sau:

Hệ I: n-hexan: ethyl acetat (3: 7)

Hệ II: Cloroform : methanol (15: 1)

Hệ III: Ethyl acetat: methanol : nước (6:1 :1)

Hệ IV: Toluen : ethyl acetat : acid formic (5: 4:1)

Hệ V: Cloroform : ethyl acetat : n-hexan (19:1:1)

- Hình ảnh sắc ký đồ của cắn toàn phần với các hệ dung môi khác nhau thu được như ở hình 3.1

I) II) III) IV) V)

Hình 3.1 S ắc kí đồ cắn toàn phần từ hệ I đến hệ V ở UV 365nm

Sau nhiều lần triển khai sắc ký với các hệ dung môi trên, kết quả cho

thấy hệ IV tách tốt nhất Cắn toàn phần được triển khai với hệ dung môi IV và quan sát ở các điều kiện khác nhau Kết quả thể hiện ở hình 3.2 và bảng 3.2

1) 2) 3) 4)

Hình 3.2 S ắc kí đồ của cắn TP với hệ dung môi IV 1) không phun TT, AST 3) không phun TT, UV 254nm

2) không phun TT, UV 365nm 4) phun TT, AST

Bảng 3.2 Màu sắc và giá trị Rf của cắn TP trên SKLM với hệ dung môi IV

Nhận xét: sau khi thăm dò 5 hệ dung môi, thấy hệ dung môi IV tách tốt

nhất.Kết quả định tính cắn toàn phần bằng SKLM cho thấy:

Khi chưa phun thuốc thử:

 Ở ánh sáng thường: không có vết nào

 Ở bước sóng 365nm: có 10 vết

 Ở bước sóng 254nm: có 6 vết

Sau khi phun thuốc thử:

 Ở ánh sáng thường: có 8 vết

Trong các vết, nhận thấy một số vết đáng lưu ý:

+ Vết số 6, 7 quan sát được màu xanh dương rất rõ ở UV365nm

+ Vết số 11 quan sát được rất rõ màu xanh dương trắng ở UV365nm tuy nhiên ở

UV254nm và sau khi phun thuốc thử thì không thấy xuất hiện

+ Vết số 8 quan sát được rất rõ màu đỏ ở UV365nm, màu đen ở UV254nm , không

thấy xuất hiện sau khi phun thuốc thử

3.2.2 Định tính cắn phân đoạn n-hexan bằng SKLM

Dịch chấm sắc ký: cắn n-hexan hoà tan hoàn toàn trong methanol

Tiến hành thăm dò với các hệ dung môi:

Hệ I: Cloroform : methanol (8: 2)

Hệ II: Cloroform : methanol (9: 1)

Hệ III: Cloroform : ethyl acetat : n-hexan (19: 1: 1)

Hệ IV: Toluen : ethyl aceat : acid formic (5: 3: 1) Sau khi triển khai sắc kí với các hệ dung môi trên, kết quả cho thấy hệ III tách tốt nhất Cắn phân đoạn n-hexan được triển khai với hệ dung môi III và được quan sát ở các điều kiện khác nhau Kết quả thể hiện trong hình 3.3

và bảng 3.3

1) 2) 3) 4)

Hình 3.3 S ắc kí đồ cắn phân đoạn n-hexan với hệ dung môi III

1) không phun TT, AST 2) không phun TT, UV 254nm

3)không phun TT, UV 365nm 4) phun TT, AST

Bảng 3.3 Màu sắc và giá trị Rf cắn phân đoạn n-hexan trên SKLM với hệ dung môi III

Khi chưa phun thuốc thử:

 Ở ánh sáng thường: không thấy có vết nào

 Ở bước sóng 254nm: có 1 vết

 Ở bước sóng 365nm: có 4 vết

Sau khi phun thuốc thử:

 Ở ánh sáng thường: có 3 vết

Trong các vết, nhận thấy một số vết đáng lưu ý:

+ Vết số 2 quan sát được rất rõ ở UV365nm , không thấy xuất hiện ở UV254nm và sau khi phun thuốc thử

+ Vết số 4 quan sát được rất rõ có màu xanh dương trắng ở UV365nm, màu xanh tím sau khi phun thuốc thử, tuy nhiên không thấy xuất hiện ở UV254nm

3.2.3 Định tính cắn phân đoạn EtOAc bằng SKLM

Dịch chấm sắc ký: cắn phân đoạn EtOAc hòa tan hoàn toàn bằng MeOH

Tiến hành thăm dò với các hệ dung môi:

Hệ I : Toluen: ethyl acetat: acid formic (5:3:1)

Hệ II : Toluen: ethyl acetat: acid formic (5:6:1)

Hệ III : Cloroform: methanol (8:2)

Hệ IV : Cloroform: methanol (9:1) Sau khi triển khai sắc kí thấy hệ III cho kết quả tách tốt nhất Cắn phân đoạn ethyl acetat được triển khai với hệ dung môi III và quan sát ở các điều kiện khác nhau Kết quả thể hiện ở hình 3.4 và bảng 3.4

1) 2) 3) 4)

Hình 3.4 S ắc kí đồ của cắn EtOAc với hệ dung môi III

1) không phun TT, AST 2) không phun TT, UV 254nm

3)không phun TT, UV 365nm 4) phun TT, AST

B ảng 3.4 Màu sắc và giá trị Rf của cắn phân đoạn EtOAc trên SKLM với hệ dung môi III

Khi chưa phun thuốc thử:

 Ở ánh sáng thường: không có vết nào

 Ở bước sóng 254nm: có 9 vết

 Ở bước sóng 365nm: có 11 vết

Sau khi phun thuốc thử :

 Ở ánh sáng thường: có 5 vết

Trong các vết, nhận thấy một số vết đáng lưu ý:

+ Vết số 6 quan sát được rất rõ thấy màu xanh dương trắng ở UV365nm, màu đen ở UV254nm, màu nâu sau khi phun thuốc thử

+ Vết số 7 quan sát được rất rõ thấy màu xanh dương ở UV365nm, màu đen ở

UV254nm, màu đỏ sau khi phun thuốc thử

+ Vết số 11 quan sát được rất rõ màu xanh dương ở UV365nm, không thấy xuất

hiện ở UV254nm, sau khi phun thuốc thử

3.3 PHÂN LẬP

Sử dụng sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel để phân lập cắn phân đoạn n-hexan và cắn phân đoạn ethyl acetat

3.3.1 Phân l ập lần 1

3.3.1.1 C ắn phân đoạn n-hexan (BBVA)

- Lượng mẫu: 15,21g cắn phân đoạn n-hexan

- Kích thước cột: 10 x 43cm

- Chất hấp phụ: 120g silicagel 40-63 µm

- Hệ dung môi rửa giải: n-hexan: ethyl acetat (20: 1)

- Kết quả: sau khi rửa giải thu được 100 phân đoạn Kiểm tra thành

phần dịch hứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển n-hexan: ethyl acetat (15:1), các phân đoạn có sắc kí đồ giống nhau thì gộp thành một phân đoạn

Bốc hơi dung môi đến khi cắn có khối lượng không đổi, xác định khối lượng các phân đoạn Từ BBVA thu được phân đoạn BBVA2 (gộp các ống từ 17-20) có khối lượng 120mg

3.3.1.2 Cắn phân đoạn ethyl acetat (BBVC)

- Lượng mẫu: 16,02g cắn phân đoạn ethyl acetat

- Kích thước cột: 10 x 43cm

- Chất hấp phụ: 120g silicagel 30-50 µm

- Hệ dung môi rửa giải: Aceton: nước (1:6)

- Kết quả: sau khi rửa giải thu được 50 phân đoạn Kiểm tra thành phần

dịch hứng bằng SKLM với hệ dung môi cloroform: methanol (5:1) Từ BBVC thu được phân đoạn BBVC1 (gộp các ống từ 3-9) có khối lượng là 4g

- Lượng mẫu: 120mg BBVA2 thu được sau khi phân lập lần 1

- Kích thước cột: 2 x 50cm

- Chất hấp phụ: 60g silicagel 40-63 µm

- Hệ dung môi rửa giải: n-hexan: ethyl acetat (15:1)

- Kết quả: sau khi rửa giải thu được 55 phân đoạn Kiểm tra thành

phần dịch hứng bằng SKLM với hệ dung môi cloroform:methanol (10:1) Trong quá trình dồn ống , có 1 phân đoạn xuất hiện chất kết tinh trong ống nghiệm Chất thu được ký hiệu là BBV 7 (gộp các ống từ 25-32) Tinh chế BBV7 bằng phương pháp kết tinh lại Cô đến cắn có khối lượng không đổi, xác định khối lượng của BBV7 là 15mg

3.3.2.2 Phân đoạn BBVC1

-Lượng mẫu: 4g BBVC1 thu được sau khi phân lập lần 1

- Kích thước cột: 2 x 50cm

- Chất hấp phụ: 60g silicagel 40-63 µm

- Hệ dung môi rửa giải: loroform: methanol: nước (4: 1: 0,1)

-Kết quả: sau khi rửa giải thu được 60 phân đoạn Kiểm tra dịch hứng

bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat: methanol (10:1).Trong quá trình dồn ống, có 1 phân đoạn xuất hiện chất kết tinh trong ống nghiệm Chất thu được ký hiệu là BBV5 (gộp các ống từ 31-38) Tinh chế BBV5 bằng phương pháp kết tinh lại Cô đến cắn có khối lượng không đổi , xác định khối lượng của BBV5 là 20mg

Hình 3.5 Sơ đồ chiết xuất và phân lập các chất từ vỏ thân cây Gạo.

3.3.3 Ki ểm tra độ tinh khiết của chất đã được phân lập

3.3.3.1 Ki ểm tra độ tinh khiết của BBV5

Triển khai BBV5 trên 3 hệ dung môi:

Hệ I: Cloroform: methanol (4:1)

Hệ II: Toluen : ethyl acetat: acid formic (5:7:1)

Hệ III: Ethyl acetat: methanol (10:1)

Cắn toàn phần BBV (71g)

BBVB (30,18g)

BBVA

(15,21g)

BBVC (16,02g)

BBVD

BBVA1

(220mg)

BBVA2 (120mg)

BBVC1 (4g)

BBVC2 (2g)

BBV7 (15mg)

BBV5 (20mg)

Kết quả: Sau khi phun thuốc thử, quan sát ở AST thấy có 1 vết màu tím duy nhất trên bản mỏng ở cả 3 hệ Sơ bộ kết luận BBV5 tinh khiết

I) II) II)

B ảng 3.5 Màu sắc và giá trị Rf của BBV5 với 3 hệ dung môi sau khi phun thuốc thử

So sánh BBV5 và cắn phân đoạn ethyl acetat trên cùng 1 bản mỏng trên, hệ dung môi khai triển là hệ I:

Hình 3.7 Hình ảnh SKLM so sánh BBV5 với cắn phân đoạn ethyl acetat trên

cùng 1 b ản mỏng với hệ dung môi I sau khi phun thuốc thử

Nhận xét: Triển khai BBV5 và cắn phân đoạn ethyl acetat trên cùng 1

bản mỏng với hệ dung môi I, quan sát thấy ở cắn phân đoạn ethyl acetat xuất

hiện vết có Rf tương đương với Rf của BBV5 sau khi phun thuốc thử

3.3.3.2 Ki ểm tra sự tinh khiết của BBV7

Triển khai BBV7 với 3 hệ dung môi

Hệ I: n-hexan : ethyl acetat (9 : 1)

Hệ II: Cloroform: ethyl acetat: n-hexan (19:1:1)

Hệ III: Cloroform: methanol (19 : 1,5)

Kết quả: Sau khi phun thuốc thử, quan sát ở AST xuất hiện 1 vết màu xanh tím duy nhất trên bản mỏng ở cả 3 hệ Sơ bộ kết luận BBV7 tinh khiết

I) II) III)

B ảng 3.6 Màu sắc và giá trị Rf của BBV7 với 3 hệ dung môi sau khi phun thuốc thử

So sánh BBV7 và cắn phân đoạn n-hexan trên cùng 1 bản mỏng với hệ dung môi I:

m ỏng với hệ dung môi I sau khi phun thuốc thử

Nhận xét: Triển khai BBV7 và cắn phân đoạn n-hexan trên cùng 1 bản

mỏng với hệ dung môi I, quan sát thấy ở cắn phân đoạn n-hexan xuất hiện vết có Rf tương đương với Rf của BBV7

H-NMR và 13C-NMR của BBV5 xuất hiện các tín hiệu đặc

trưng cho sự có mặt của một phân tử đường tại δH 4,12 (1H, d, J= 7,5Hz, proton anome) và δC 103,43 (carbon anome), một nhóm amide cũng được

nhận diện tại δH 7,55 (1H, d, J= 9,5Hz, NH) và δC 173,75 (-NH-C=O), các proton metylen của mạch dài tại δH 1,23-1,28 (32H, br s) và δC 22,00-31,22ppm; 2 nhóm methyl tại δH 0,84 (6H, t, J=7,0 Hz) và δC 13,85 (x2) tín

hiệu proton của 2 nhóm methyl này dạng triplet chứng tỏ nó liên kết trực tiếp

với nhóm CH2 hay nó chính là vị trí liên kết cuối cùng của 2 mạch dài Ngoài

ra, 2 proton olefin được xác định δH 5,3 (1H, dd, J=15,5; 6,5Hz) và 5,36; 5,30 (1H, dd, J=15,5; 6,5Hz), δC 129,63 và 130,20 ppm nối đôi được xác định là trans vì có hằng số J= 15,5 Hz; 3 nhóm methyl gắn với nguyên tử oxy tại δ3,83 (1H, m); 3,84 (1H, m) và 4,17 (1H, t, J = 5,5Hz) Các dữ kiện phổ này

gợi ý rằng hợp chất BBV5 là một cerebroside [33]

O OH NH

O

1'

OH

O HO

HO

OH

HO

4'' 2'' 6'' 5''

1'' 3'' 18

24

OH

3'

Hình 3.10 M ột số tương tác HMBC chính của BBV5

Tất cả các vị trí của BBV5 được gán bằng các phương pháp phổ NMR hai chiều hiện đại là HSQC và HMBC (Hình 3.10, bảng 3.7) Phân tích chi

tiết các tương tác trên phổ HMBC của H-1 sang C-2 (δ 49,84)/C-3 (δ 74,15)/C-1” (δ 103,43); H-4 sang C-2 (δ 49,84)/C-3 (δ 74,15)/C-6(δ 22,00); H-8 (9) sang C-7 (δ 26,6)/C-10 (δ 26,9); H-2’ sang C-3’ (δ 34,28); H-3’ sang C-2’ (δ 70,89) và H-1” sang C-1 (δ 68,80) đã khẳng định vị trí nhóm hydroxy

tại C-3, C-4 và C-2’, đơn vị đường được xác định là đường β-D-glucosyl thông qua nhận diện bộ số liệu 1

H-NMR và 13C-NMR cũng như so sánh với tài liệu [33]

O OH NH O

1 3 5 1'

OH

O HO

HO

OH

HO 4''

2''

6'' 5''

1'' 3''

m/ z: 718.3

m/ z: 682.6

(3) (4)

m/ z: 300.3

Hình 3.11 M ột số mảnh phân tử chính trên phổ khối của BBV5

Để xác định chính xác độ dài mạch carbon và vị trí của nối đôi trong phân tử hợp chất BBV5 phổ khối lượng đã được đo Trên phổ ESI-MS xuất

hiện pic ion tại m/z 845,5 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử

C48H93NO10 (M=844) Trên phổ khối lượng bắn mảnh xuất hiện mảnh phân tử

tại m/z 682,6 tương ứng công thức C42H83NO5 phân tử BBV5 bị cắt mảnh ở vị

trí (1); mảnh phân tử tại m/z 300,3 tương ứng với công thức C18H36O3 phân tử

BBV5 bị cắt tại vị trí (1) và (2) chứng tỏ mạch chính của BBV5 có 18C, mạch còn lại có 24C Mảnh phân tử tại m/z 718,3 tương ứng với công thức

C39H75NO10 phân tử BBV5 bị cắt mảnh ở vị trí (3) trên hình 3.11; mảnh m/z

691,4 tương ứng với công thức C37H73NO10 phân tử BBV5 bị cắt mảnh ở vị trí