I) I II IV) V)
i Lô Số cơn quặn đau của chuột (con/5 phút)
3.4.2. Phương pháp gây đau bằng mâm nóng
Tiến hành:
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con.
- Lô 1 (đối chứng): uống nước cất, 1 ml/100 g.
- Lô 2: Codein liều 10 mg/kg.
- Lô 3: uống CLG1 liều 6g dược liệu/kg.
- Lô 4: uống CLG1 liều 12g dược liệu/kg.
Thí nghiệm được tiến hành tại hai thời điểm: trước khi cho chuột uống thuốc thử và sau khi cho chuột uống thuốc thử 3 ngày liền. Đặt chuột lên mâm nóng, ln duy trì ở nhiệt độ 56o
C bằng hệ thống ởn nhiệt. Tính thời gian từ lúc đặt chuột vào mâm nóng đến khi chuột liếm chân sau. Loại bỏ
những chuột phản ứng trước 8 giây và sau 60 giây. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của chế phẩm từ cây Gạo lên thời gian phản ứng với
nhiệt của chuột.
i Lô
Thời gian phản ứng với nhiệt độ (giây)
T0 T1 p trước-sau p so với chứng 1 Chứng sinh học 17,81 ± 2,14 17,70 ± 3,69 > 0,05 2 Codein 10 mg/kg 18,02 ± 3,69 24,84 ± 5,87 < 0,01 < 0,01 3 CLG1 6g dược liệu/kg 17,94 ± 1,04 17,79 ± 1,84 > 0,05 > 0,05 4 CLG1 12g dược liệu/kg 17,83 ± 2,74 18,05 ± 2,71 > 0,05 > 0,05 Từ bảng 3.10 cho thấy:
- Codein 10mg/kg/ngày có tác dụng kéo dài thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột so với trước khi uống thuốc và so với chuột ở lô chứng (p < 0,01).
- CLG1 liều 6g dược liệu/kg/ngày và liều 12g dược liệu/kg/ngày không làm thay đổi có ý nghĩa thống kê thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột so với trước khi uống thuốc và so với chuột ở lơ chứng (p > 0,05).
3.5. BÀN LUẬN
Hình ảnh cây Gạo luôn gắn với làng quê Việt Nam, đặc biệt ở Bắc Bộ. Bên cạnh giá trị tinh thần, cây Gạo được nhân dân sử dụng các bộ phận khác nhau theo kinh nghiệm dân gian như vỏ thân trị sâu răng, trị quai bị, thấp khớp... Tuy nhiên việc nghiên cứu về cây Gạo cịn rất ít, vì vậy đề tài nghiên cứu được tiến hành là thực sự cần thiết trong việc để góp phần nâng cao giá trị sử dụng dược liệu này.
Đề tài đã tiến hành chiết xuất các nhóm chất trong vỏ thân cây Gạo bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi methanol. Sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng lần lượt các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, cloroform, ethyl acetat thu được các cắn tương ứng. Từ cắn n-hexan, tiến hành phân lập bằng sắc kí cột thu được 2 phân đoạn BBVA1 và BBVA2. Từ phân đoạn BBVA2 phân lập được BBV7. Từ cắn ethyl acetat tiến hành phân lập bằng sắc kí cột thu được 2 phân đoạn BBVC1 và BBVC2. Từ phân đoạn BBVC1 phân lập được BBV5. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất với 3 hệ dung môi khác nhau cho giá trị Rf khác nhau chứng tỏ các chất phân lập được tinh khiết tương đối.
Dựa vào dữ liệu phổ MS, 1D- và 2D-NMR xác định được cấu trúc của BBV5 và BBV7 lần lượt là Momor cerebroside I và stigmasterol.
Các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành phân lập được Momor cerebroside I từ nhiều loài khác nhau: Incarvillea arguta (Curcubitaceae), Cucumis sativus L (Bignoniaceae)... [29], [36]. Năm 2004, Yinggang Luo và cộng sự đã phân lập được Momor cerebroside I từ rễ Incarvillea arguta
(Bignoniaceae). Ngâm lạnh với dung môi ethanol, sau đó cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn, làm khô cắn tới khối lượng khơng đởi. Hịa tan cắn với nước. Sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng lần lượt có độ phân cực tăng dần với ethyl acetat và n-butanol. Từ phân đoạn n-butanol tiến hành phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel, thu được chất tinh khiết là Momor cerebroside I [36]. Đề tài cũng sử dụng phương pháp ngâm lạnh với dung môi để chiết xuất dược liệu và sắc ký cột để phân lập. Tuy nhiên đề tài sử dụng dung mơi ngâm lạnh là methanol. So với ethanol, methanol hịa tan được nhiều chất hơn, chiết được hầu hết các chất trong dược liệu cho nên hiệu suất chiết cao hơn, nhưng methanol lại độc hơn, có thể gây ảnh hưởng lên mắt và thần kinh, do vậy việc đảm bảo an toàn lao động được chú trọng.
Sau khi ngâm lạnh, đề tài cũng sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, nhưng đề tài sử dụng 3 dung môi là n-hexan, cloroform và ethyl acetat. Việc đề tài sử dụng nhiều dung mơi hơn thì sẽ mất nhiều thời gian hơn, nhưng tách được nhiều hơn các chất có độ phân cực khác nhau, do đó khi tiến hành phân lập bằng sắc ký cột sẽ tốn ít dung mơi để rửa giải hơn, dễ dàng tách được chất hơn và chất thu được sẽ tinh khiết hơn.
Cũng sử dụng phương pháp sắc ký cột, Jing Tang và cộng sự đã phân lập được Momor cerebroside I từ phân đoạn cloroform chiết xuất từ vỏ thân của Cucumis sativus L. và tiến hành thử tác dụng kháng nấm, kết quả cho thấy Momor cerebroside I có tác dụng kháng nấm mạnh mẽ trên một số chủng như Pseudomonas lachrymans, Pythium aphanidermatum, Botrytis cinerea...
[29]. Theo kinh nghiệm dân gian, nước sắc vỏ thân cây Gạo chữa bệnh đậu mùa, chữa đau răng, viêm dạ dày, sưng tấy, quai bị....[7], [10], [17]. Như vậy, Momor cerebroside I có thể là một trong những thành phần tạo ra tác dụng kháng khuẩn, chống nấm của vỏ thân cây Gạo.
Stigmasterol không chỉ được phân lập từ vỏ thân Bombax malabaricum
DC., mà stigmasterol còn là 1 phytosterol đã được phân lập từ nhiều loài khác nhau như: Rubus suavissimus (Rosoideae) [35], Achyranthes aspera L.
(Amaranthaceae) [14],... Năm 2011, Tôn Nữ Liên Hương và cộng sự đã phân lập được stigmasterol từ cây cỏ xước Achyranthes aspera L.
(Amaranthaceae). Thân cây cỏ xước được chiết bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi methanol. Sau đó, sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng lần lượt với ether dầu hỏa, cloroform, ethyl acetat và n-butanol. Cắn phân đoạn cloroform được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel, thu được chất tinh khiết là stigmasterol [14]. Tương tự như vậy, đề tài cũng sử dụng phương pháp ngâm lạnh với dung môi methanol để chiết xuất và phân
lập bằng sắc ký cột, thu được stigmasterol. Tuy nhiên, đề tài sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng lần lượt với 3 dung môi: n-hexan, cloroform, ethyl acetat. Ether dầu hỏa là hỗn hợp các alkan do đó khả năng tách các chất có độ phân cực gần giống nhau sẽ kém hơn khi sử dụng n-hexan, nhưng ether dầu hỏa lại có giá thành rẻ hơn so với n-hexan. Trong một nghiên cứu, bằng một số phản ứng hóa học thường quy, đã sơ bộ xác định dược liệu vỏ thân cây Gạo khơng có chứa chất béo [11], cho nên đề tài đã sử dụng dung mơi n- hexan thay vì sử dụng dung môi ether dầu hỏa.
-Về tác dụng sinh học
Đề tài đã tiến hành thử tác dụng giảm đau của cao lỏng vỏ thân cây Gạo bằng 2 phương pháp: Koster- gây quặn đau bằng acid acetic và phương pháp gây đau bằng mâm nóng. Kết quả cho thấy: liều 12g dược liệu/kg/ngày có tác dụng giảm rõ rệt số cơn quặn đau ở tất cả các thời điểm nghiên cứu khi tiến hành phương pháp Koster. Liều 12g dược liệu/kg/ngày làm giảm số cơn quặn đua ở tất cả các thời điểm nghiên cứu so với liều 6g dược liệu/kg/ngày (p<0,05). Như vậy ở liều này, chế phẩm có tác dụng giảm đau (p<0,001), tác dụng này tương đương với Aspirin liều 100mg/kg/ngày (p>0,05). Tuy nhiên khi tiến hành bằng phương pháp gây đau bằng mâm nóng thì liều 6g dược liệu/kg/ngày và 12g dược liệu/kg/ngày không làm thay đổi có ý nghĩa thống kê thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột so với trước khi uống thuốc cà so với chuột ở lô chứng.
Stigmasterol đã phân lập được cịn có tác dụng chống viêm. Cơ chế tác dụng của stigmasterol thông qua ức chế một số chất trung gian gây viêm, ngăn chặn biểu hiện của MMP tham gia vào q trình thối hóa sụn [32].
Năm 2012, Charles G và cộng sự đã tiến hành thử tác dụng giảm đau và chống viêm của stigmasterol phân lập từ rễ Mondea whytei
formalin và gây phù tai bằng dimthyl benzen ở chuột. Kết quả: stigmasterol liều 15mg/kg có tác dụng chống lại các trạng thái đau do cảm thụ thần kinh khi tiến hành mơ hình gây quặn đau bằng acid acetic. Liều 7,5; 15; 30 và 100mg/kg đều có tác dụng giảm đau trong giai đoạn đầu và giai đoạn cuối thử nghiệm formalin. Stigmasterol liều 30mg/kg có tác dụng tương đương với dexamathason liều 10mg/kg khi tiến hành mơ hình gây phù tai chuột bằng diethyl ether. Sau khi tiến hành cả 3 mơ hình, nghiên cứu đã đưa ra kết luận: stigmasterol có tác dụng giảm đau là do giảm viêm [22]. Cùng tiến hành trên 2 mơ hình thử tác dụng giảm đau: gây quặn đau bằng acid acetic và gây đau bằng mâm nóng, đề tài cũng thu được kết quả: cao lỏng toàn phần chiết xuất từ vỏ thân cây Gạo có tác dụng làm giảm số cơn đau trên mơ hình gây đau bằng acid acetic, nhưng không làm thay đổi phản ứng với nhiệt so với lơ chứng trên mơ hình gây đau bằng mâm nóng. Do mơ hình gây quặn đau bằng acid acetic mới chỉ xác định tác dụng giảm đau do cơ chế ngoại vi, vì thế phải tiến hành cả mơ hình gây đau bằng mâm nóng hoặc thử nghiệm formalin để xác định tác dụng giảm đau do cơ chế trung ương. Tuy nhiên đề tài sử dụng mơ hình gây đau bằng mâm nóng vì ưu điểm đơn giản, dễ dàng thực hiện, nhanh chóng và kết quả cũng khá chính xác. Tác dụng giảm đau của vỏ thân cây Gạo được biết đến trong một số bài thuốc theo kinh nghiệm dân gian như: chữa bầm giập, bong gân, trẹo khớp: vỏ cây Gạo, và lá tre giã nát, thêm ít rượu, đắp vào chỗ đau; chữa quai bị: vỏ Gạo sắc uống đông thời giã nát đắp, ...[7], [10]. Kết quả sau khi tiến hành thử tác dụng giảm đau của vỏ thân cây Gạo phù hợp với kinh nghiệm dân gian, đồng thời gợi ý tác dụng giảm đau, chống viêm của vỏ thân cây Gạo là do sự có mặt của stigmasterol trong vỏ thân cây Gạo.
Như vậy khóa luận đã tiếp tục góp phần nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Gạo một cách có hệ thống. Tìm hiểu mối
quan hệ giữa thành phần hóa học và tác dụng của dược liệu, chứng minh cho kinh nghiệm sử dụng vỏ thân cây Gạo, định hướng cho thử tác dụng sinh học cho những nghiên cứu tiếp theo.