Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn tự nhiên và sàng lọc các chủng có khả năng kháng với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II SÀNG LỌC VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Trần Thị Ngọc Phương1*, Đặng Thị Hồng Oanh1 TĨM TẮT Nghiên cứu thực nhằm phân lập vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn tự nhiên sàng lọc chủng có khả kháng với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết cá tra Kết cho thấy, 96 chủng vi khuẩn lactic có khả đối kháng với vi khuẩn thị Escherichia coli chọn, với 29 chủng phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)), 24 chủng từ cá lăng (Mystus nemurus (Valenciennes, 1839)), 21 chủng từ cá vồ đém (Pangasius larnaudii (Bocourt, 1866)), 12 chủng từ cá trê (Clarias macrocephalus (Gunther, 1864)) chủng từ cá hú (Pangasius larnaudii (Bocourt, 1866)) Kết nhuộm Gram kiểm tra sinh hóa cho thấy hầu hết chủng vi khuẩn lactic chọn vi khuẩn Gram dương, khơng sinh bào tử, hình cầu, hình oval, que ngắn hay que dài, oxidase catalase âm tính Kết xác định tính đối kháng khả sinh bacteriocin, thu 46 chủng thể tính đối kháng chủng vi khuẩn thể khả kháng khuẩn (sinh bacteriocin thơ) Từ khóa: Aeromonas hydrophila, chế phẩm sinh học (probiotic), khả kháng khuẩn, vi khuẩn lactic I ĐẶT VẤN ĐỀ Với khoảng 600.000 diện tích mặt nước ngọt, Đồng sơng Cửu Long đánh giá có tiềm to lớn cho phát triển ngành nuôi trồng thủy sản Bên cạnh đối tượng nuôi tôm thẻ chân trắng, tôm sú,… cá tra xem đối tượng nuôi chủ lực, đem lại lợi nhuận cao cho người ni góp phần vào giá trị xuất nước Theo báo cáo Hiệp hội cá tra Việt Nam, tính đến ngày 30/6/2015 diện tích ni thả ĐBSCL 1.959 (tăng 0,21% so với kỳ năm 2014), sản lượng đạt 516.140 (tăng 1,22% so với kỳ), tổng kim ngạch xuất cá tra đến 31/5/2015 đạt 616 triệu USD Tuy nhiên, trạng thâm canh hóa mơ hình ni cá tra nay, tình hình dịch bệnh diễn phức tạp khó kiểm sốt gây thiệt hại lớn cho người ni cá tra, đó, bệnh xuất huyết (tác nhân gây bệnh A hydrophila) bệnh nguy hiểm với tần suất xuất khoảng 88% bệnh xuất huyết hộ nuôi khảo sát so với bệnh khác gây thiệt hại lớn cho người nuôi Trước tình trạng sử dụng thuốc kháng sinh khơng cách dẫn đến nhiều tác hại nghiêm trọng tượng kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh, hay dư lượng thuốc kháng sinh vật ni gây hại đến sức khỏe người Đặc biệt, vi khuẩn gây bệnh A hydrophila, tượng kháng thuốc kháng sinh diễn ngày phức tạp, Quách Văn Cao Thi ctv., (2014) hầu hết chủng A hydrophila kháng hoàn toàn với kháng sinh nhóm penicillin, cefalexin trimetroprim/ sunfamethoxazol Nên, việc nghiên cứu để tìm giải pháp thay tốt cho phòng trị bệnh việc cần thiết Trong số giải pháp tìm được, chế phẩm sinh học xem giải pháp thay tiềm vi khuẩn hữu ích có khả bám dính cao biểu mơ ruột cịn nâng cao hệ miễn dịch động vật Trong Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ * Email: phuongb1206814@student.ctu.edu.vn TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 55 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II đó, vi khuẩn lactic chứng minh có chức probiotics, có lợi với sức khỏe vật chủ bổ sung đủ số lượng đường ruột (Nirunya et al., 2008), vi khuẩn lactic phân lập từ nhiều nguồn khác sản phẩm lên men, đường ruột gia súc, đường ruột loài thủy sản,… Vi khuẩn lactic vi khuẩn Gram dương, tế bào hình cầu hình que, catalase âm tính, khơng sinh bào tử Ngồi ra, vi khuẩn lactic cịn tạo acid lactic, ethanol, hợp chất thơm bacteriocin (Chen Hoover, 2003) Tuy việc sàng lọc vi khuẩn lactic từ ruột cá khơng cịn chủ đề mới, chủng vi khuẩn có khả sử dụng làm probiotic tìm thấy trước bao gồm Lactobacillus acidophilus, L johnsonii, L casei, L gasseri, L plantarum, L rhamnosus, Bifidobacterium longum, B breve, B bifidum, B infantis, Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Nhưng hầu hết nghiên cứu trước chưa thực nhiều cá da trơn nước thu từ tự nhiên Do nghiên cứu thực nhằm phân lập sàng lọc chủng vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn tự nhiên có khả kháng với vi khuẩn A.hydrophila gây bệnh xuất huyết cá tra, có tiềm sử dụng làm probiotics, tạo sưu tập vi khuẩn cho nghiên cứu sâu vi sinh hữu ích từ lồi cá tự nhiên cho thí nghiệm điều kiện in vivo để phịng bệnh xuất huyết cá tra II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp thu mẫu Mẫu cá da trơn: cá tra, cá lăng, cá trê, cá vồ đém mua từ chợ từ ghe cào, tình trạng cá thu mẫu cịn khỏe, bên ngồi khơng trầy xướt, không xuất huyết Mỗi loại cá thu 10 con, cỡ cá khoảng 300 – 400 gram/con, chuyển thùng xốp có sục khí phịng thí nghiệm để phân tích Mẫu cá xịt cồn tiệt trùng bên ngồi, sau cắt lấy đoạn ruột dày điều kiện vô trùng để tiến hành phân lập vi khuẩn 56 2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn (Nirunya et al., 2008) Mỗi mẫu ruột cá lấy khoảng 25 gram/ cá cho vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) tiệt trùng dùng que vô trùng để nghiền Tiến hành pha loãng nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 10-4 nước muối NaCl 0,9% Lấy 1ml dung dịch pha loãng trộn với 20ml MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) (450C) đổ lên đĩa petri tiệt trùng Đĩa petri ủ 280C 24 2.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn thị (Nirunya et al., 2008) Các loài vi khuẩn thị A hydrophila E coli nuôi khoảng 20 10ml môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) 280C 1ml vi khuẩn nuôi cấy lấy chuyển sang 9ml môi trường lỏng ủ 18 280C, mật độ vi khuẩn sau điều chỉnh để đạt 106 CFU/ml dùng cho việc xác định hoạt động kháng khuẩn 2.4 Phương pháp chọn lọc vi khuẩn có tính kháng khuẩn (Nirunya et al., 2008) Chọn lấy đĩa petri có từ 20-30 khuẩn lạc vi khuẩn lactic Phủ lên đĩa petri chọn 10 ml môi trường MHB (Mueller-Hinton Broth) (0,75% agar) chứa vi khuẩn thị E.coli với mật độ 105-106 CFU/ml ủ 24h 280C Quan sát ghi nhận kích thước vịng trịn vơ trùng xuất quanh khuẩn lạc vi khuẩn 2.5 Phương pháp xác định tính đối kháng khả sinh bacteriocin (Nirunya et al., 2008) Tiến hành đổ đĩa môi trường NA (Nutrient Agar), sau tráng lên 10 ml MHA (MuellerHinton Agar) (0,75% agar) có bổ sung vi khuẩn gây bệnh A hydophila mật độ 105 – 106 CFU/ ml agar; tạo các giếng đĩa thạch (d=56mm) Vi khuẩn lactic sau nuôi MRS (de Man, Rogosa Sharpe) lỏng ở 280C 48 giờ, đem ly tâm 7.000 vòng/phút 15 phút Thu phần dung dịch bên và chia làm hai phần Với phần (i) không xử lý, phần (ii) điều chỉnh pH (6,5 – 7,0) dung dịch bằng NaOH 1M để thu dung dịch có khả có bacteriocin TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II thơ Sau đó cho 80µl phần dung dịch (i) (ii) vào mỗi giếng Dung dịch Doxycycline 100 ppm và MRS broth được sử dụng để làm đối chứng dương và đối chứng âm Ủ ở 28oC 24 giờ Xác định tính đối kháng của các chủng vi khuẩn lactic vi khuẩn gây bệnh thông qua đường kính các vòng vô trùng theo Aslim ctv., (2005) 2.6 Phương pháp định danh vi khuẩn Hình dạng, kích thước tính vịng vi khuẩn xác định phương pháp nhuộm Gram (Barrow và Feltham, 1993) Đặc điểm sinh lý sinh hóa kiểm tra phản ứng catalase, oxidase, nhuộm bào tử xác định theo cẩm nang Cowan Steels (Barrow Feltham, 1993) Sau chủng có tính đối kháng mạnh với A.hydrophila có khả sinh bacteriocin đối kháng giải trình tự định danh cơng ty công nghệ sinh học Nam Khoa phương pháp sinh học phân tử 2.7 Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 để thống kê so sánh đường kính vịng vơ trùng gây chủng vi khuẩn lactic Từ đó, xác định chủng có tính kháng khuẩn cao từ loài cá xác định chủng tốt thuộc loài cá III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập sàng lọc vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn từ đường ruột cá da trơn Kết phân lập từ loài cá da trơn nước tuyển chọn 96 chủng vi khuẩn lactic, có 29 chủng phân lập cá tra (P hypophthalmus), 24 chủng từ cá lăng (M nemurus), 21 chủng từ cá vồ đém (P larnaudii), 12 chủng từ cá trê (C macrocephalus) chủng từ cá hú (P larnaudii) dựa khả ức chế vi khuẩn E.coli tạo vùng vô trùng môi trường có chứa E coli (Hình 1A) Mặc dù trước đây, vi khuẩn lactic phân lập chủ yếu từ thực phẩm lên men, từ sữa hay ruột nhiều loài động vật chuột, lợn, gà người; thêm vào đó, Ringø Gatesoupe (1998) phân lập định danh vi khuẩn lactic đường ruột phân cá xác định vi khuẩn lactic tồn phần nhỏ hệ đường ruột cá (Nirunya B ctv., 2008) Tuy nhiên, nghiên cứu Nirunya B ctv., (2008) rằng, vi khuẩn lactic tồn với số lượng lớn đường ruột cá biển với 160 chủng phân lập Nguyễn Văn Thành Nguyễn Ngọc Trai (2012) phân lập 45 dòng vi khuẩn từ dày, ruột cá tra cá rô phi thu từ ao nuôi thâm canh Dương Thị Kim Loan (2013) phân lập 64 chủng vi khuẩn lactic từ ruột cá tra cá rô phi thu từ chợ ao nuôi Cùng với nghiên cứu trên, nghiên cứu phân lập 96 chủng vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn nước ngọt, sống tự nhiên, thu từ chợ ghe cào Từ đây, kết luận rằng, hệ vi sinh đường ruột cá (cả cá nước mặn cá nước ngọt) nguồn dự trữ phong phú vi khuẩn lactic, đặc biệt cá da trơn, vi khuẩn phân lập từ cá tra chiếm số lượng nhiều (30%) tổng số chủng vi khuẩn phân lập Các dòng vi khuẩn phân lập từ cá da trơn có nguồn gốc từ môi trường nước tự nhiên, xâm nhập cư trú hệ tiêu hóa cá thơng qua thức ăn tự nhiên môi trường nước (Nguyễn Văn Thành Nguyễn Ngọc Trai, 2012) 3.2 Nhận diện dòng vi khuẩn phân lập Những chủng chọn tiến hành kiểm tra đặc điểm sinh lí sinh hóa trước tiếp tục thực thử tính đối kháng với vi khuẩn A.hydophila Kết cho thấy, hầu hết chúng có khuẩn lạc trịn, bóng, bìa ngun có đường kính dao động từ 0,5mm đến 1,2mm Ngoài ra, quan sát kinh hiển vi quang học cho thấy chúng vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, hình cầu, hình oval, hình que ngắn hay que dài, catalase oxidase âm tính Đặc biệt, xung quanh khuẩn lạc xuất vùng suốt trường CaCO3 bị phân giải, phát triển mơi trường MRS có 0,5% CaCO3 (Hình 1B, 1C) Những đặc điểm phù hợp với đặc điểm giống Lactobacillus TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 57 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II mơ tả Kandler Wiss (1986) (Nguyễn Văn Thành Nguyễn Ngọc Trai, 2012) Vì kết luận rằng, 96 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá da trơn sống tự nhiên thuộc giống Lactobacillus, đó, vi khuẩn hình oval hình que ngắn chiếm ưu với số chủng theo thứ tự 43 chủng (45%) 39 chủng (41%) (Bảng 1) Hình 1: A: Khuẩn lạc vi khuẩn lactic đĩa thạch MRS tráng MHB 0,75% agar chứa vi khuẩn E.coli; B, C: Vi khuẩn lactic có khả làm tan vơi phát triển đĩa thạch MRS có chứa 0,5% CaCO3 Bảng 1: Đặc điểm hình thái dịng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá da trơn tự nhiên Hình thái tế bào vi khuẩn Nguồn phân lập Cá tra (Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878)) Hình cầu Hình oval Hình que ngắn Hình que dài CT1.1 CT1.2 CT2.8 CT4.8 CT10.2 CT2.1 CT2.9 CT8.3 CT4.6 CT3.3 CT4.9 CT3.4 CT4.14 CT3.6 CT7.1 CT3.7 CT7.2 CT3.8 CT7.3 CT4.4 CT8.6 CT4.10 CT10.1 CT8.7 CT8.10 CT8.11 CT8.15 CT8.16 58 CT10.8 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Cá lăng (Mystus nemurus (Valenciennes, 1839)) Cá trê (Clarias macrocephalus (Gunther, 1864)) CL9.5 CL10.20 TV8.7 Cá hú (Pangasius conchophilus (Roberts & Vidthayanon, 1991)) Cá vồ đém (Pangasius larnaudii (Bocourt, 1866)) CL2 CL3 CL10.3 CL4 CL8.20 CL8.21 CL9.3 CL9.6 CL10.8 CL10.14 CL10.22 CL10.23 CL10.29 TV2 CL1 CL8.23 CL8.26 CL10.1 CL10.4 CL10.6 CL10.7 CL10.10 CL10.37 TV8.3 TV8.6 TV8.11 TV8.14 TV8.15 TV8.16 TV8.17 TV8.18 TV8.23 CH4.1 CH4.2 TV4 TV8.10 VD1.4 VD4.3 VD4.11 VD5.2 CH4.3 CH4.4 CH4.5 CH4.7 VD3.3 VD3.8 VD3.11 VD4.1 TV3 CH2 CH5.1 VD1.5 VD1.6 VD2.1 VD2.2 VD3.6 VD3.7 VD3.10 VD3.12 VD4.7 VD4.8 VD5.1 VD4.6 VD5.3 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 59 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.3 Tính đối kháng khả sinh bacteriocin thô Vi khuẩn lactic ngăn cản phát triển tác nhân gây bệnh việc sinh acid hữu H2O2 Các acid hữu ức chế vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, nấm,… Trong đó, acid hữu có khả sinh chất ức chế diệt khuẩn với acid acetic mạnh acid lactic, vi khuẩn lactic cịn sinh H2O2 có khả diệt khuẩn Gram âm Gram dương với chế sinh supeoxide (O2-) gốc hydroxyl (OH-) tự phá hủy DNA tạo hiệu diệt khuẩn (Dilek, 2014) Bên cạnh đó, A hydrophila E ictaluri vi khuẩn Gram âm cho thấy chủng vi khuẩn phân lập có nhiều khả đối kháng với hai chủng vi khuẩn gây bệnh Thực tế từ nghiên cứu cho thấy, 96 chủng vi khuẩn lactic chọn lọc được, có 46 chủng thể tính đối kháng chủng có khả sinh bacteriocin Trong đó, chủng vi khuẩn lactic phân lập từ cá tra chiếm số lượng nhiều với 22 chủng, 15 chủng phân lập từ cá lăng Vi khuẩn lactic phân lập từ cá vồ đém có chủng, từ cá trê có chủng thể tính đối kháng vi khuẩn phân lập từ cá hú khơng thể tính đối kháng với A hydrophila Hầu hết chủng vi khuẩn lactic thể tính kháng trung bình (với đường kính vùng vơ trùng trung bình (d) từ 4,5mm đến 9,5mm) yếu (d= 2mm ÷ 4mm) (Aslim ctv., 2005) (Hình 2) Hình 2: Đường trịn vơ trùng tạo vi khuẩn lactic có khả sinh bacteriocin vi khuẩn Aeromonas hydrophila (+): đối chứng dương (kháng sinh Doxycycline 100ppm); (-): đối chứng âm (môi trường MRS lỏng); 1.1, 2.1: dung dịch ly tâm từ vi khuẩn lactic không xử lý; 1.2, 2.2: dung dịch ly tâm từ vi khuẩn lactic chuẩn pH (6,5-7) dung dịch NaOH 1M Ngồi acid hữu H2O2, vi khuẩn lactic cịn có khả sinh bacteriocin, bacteriocin chuỗi peptide hay protein sinh vài chủng vi khuẩn, hầu hết bacteriocin diệt tế bào đích tính thấm màng tế bào hoạt động đặc hiệu chúng yêu cầu chất thụ cảm đặc hiệu bề mặt tế bào đích Bacteriocin phân loại theo đặc điểm sinh hóa đặc điểm di truyền, Nisin (L lactis) Pediocin (Pediococcus 60 acidilactici) bacteriocins phổ biến sử dụng nhiều sản phẩm lên men (Dilek, 2014) Nhiều báo cáo chứng minh dịng Lactobacillus có khả sinh bacteriocins “lactocidin” Thực tế, nghiên cứu tìm chủng CL2, CL10.20 (phân lập từ cá lăng) CT3.7 (phân lập từ cá tra) có khả sinh bacteriocin trung bình yếu với đường kính vịng vơ trùng 9mm, 4mm 2mm (Bảng 2) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng 2: Bảng đường kính vịng vơ trùng gây hoạt động kháng khuẩn chủng vi khuẩn kháng với Aeromonas hydrophila A.hydrophila Nguồn phân lập Cá tra Khả đối kháng Tên chủng Khả sinh bacteriocin Đường kính vịng vơ trùng (mm) Độ nhạy(*) Đường kính vịng vơ trùng (mm) Độ nhạy(*) CT8.3 (++) (-) CT7.3 (++) (-) CT8.7 (++) (-) CT8.15 (++) (-) CT3.6 (++) (-) (++) (+) CT4.4 (++) (-) CT8.11 (++) (-) CT8.16 (++) (-) CT10.8 (++) (-) CT7.1 (++) (-) CT8.6 (++) (-) CT10.2 (++) (-) CT3.8 (+) (-) CT4.9 (+) (-) CT4.10 (+) (-) CT2.8 (+) (-) CT2.1 (+) (-) CT2.9 (+) (-) CT3.3 (+) (-) CT3.4 (+) (-) CT7.2 (+) (-) CT3.7 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 61 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Cá lăng Cá trê Cá vồ đém Đối chứng CL2 CL10.20 CL8.20 CL8.21 CL9.3 CL9.6 CL10.14 CL10.22 CL10.29 CL3 CL8.26 CL10.7 CL10.10 CL10.23 CL10.37 TV3 TV4 VD4.8 VD4.11 VD5.3 VD1.5 VD4.6 VD4.7 VD1.6 DC(+) 13 3 3 3 2 2 2 4 10 9 5 14 (++) (++) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (++) (++) (++) (++) (++) (++) (+) (++) DC(-) (-) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (++) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (*) (+): khả kháng khuẩn yếu (d=2÷4mm), (++) khả kháng khuẩn trung bình (d=4÷14mm), (+++) khả kháng khuẩn mạnh (d=14÷24mm), (-) Khơng nhạy (d=0) 3.4 Định danh chủng vi khuẩn lactic có khả sinh bacteriocin thơ Sau tìm chủng vi khuẩn lactic (CL2, CL20 CL3.7) có khả sinh bacteriocin thô, chủng phục hồi tách rịng đĩa thạch MRS Sau gửi mẫu đến Công ty TNHH Thương mại Dịch vụ Nam Khoa, thực định danh, giải trình tự gen 16S rRNA tra cứu BLAST SEARCH 62 Kết quả, chủng CL2 CL10.20 phân lập từ cá lăng xác định chủng Lactobacillus reuteri HFI-LD5 có độ tương đồng theo thứ tự 100% (548/548bp) 99% (551/552bp), chủng CT3.7 phân lập từ cá tra xác định chủng Lactobacillus fermentum JCM- 1173 với độ tương đồng 100% (539/539bp) Trình tự gen chủng vi khuẩn trình bày Bảng TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng 4: Trình tự gen Lactobacillus fermentum JCM- 1173 Lactobacillus reuteri HFILD5 Chủng Trình tự gen Lactobacillus fermentum JCM- 1173 AT C C T G G C T C A G G AT G A A C G C C G G C G G TG T G C C TA ATA C AT G C A A G T C G A A C G C G T T G GCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTG A G TA A C A C G TA G G TA A C C T G C C C A G A A G CGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGAC A C G G C C C ATA C T C C TA C G G G A G G C A G C A G TAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAG Lactobacillus reuteri HFI-LD5 GGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCCGGCGGTGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAG Lactobacillus fermentum vi khuẩn Gram dương, thuộc loài Lactobacillus, tìm thấy trình lên men nguyên liệu động vật thực vật L fermentum xác định TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 63 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II probiotic tiềm với khả làm giảm cholesterol tốt hẳn loài Lactobacillus khác việc hấp thụ cholesterol, thúc đẩy q trình chuyển hóa cholesterol Một nghiên cứu khác Allameh ctv., 2013, xác định L fermentum HM579790, phân lập từ dày cá lóc (Channa striatus) sống tự nhiên, có tiềm làm probiotic ni cá lóc cho thấy khả ức chế A hydrophila cao 13 chủng vi khuẩn phân lập điều kiện in vitro với đường kính vùng vơ trùng 8mm khả cải thiện tỉ lệ sống cá lóc (Channa striatus) có ý nghĩa thống kê bổ sung 2x106CFU/g vi khuẩn L fermentum vào phần Trong nghiên cứu này, chủng L fermentum JCM-1173 sàng lọc từ đường ruột cá tra, khả đối kháng (sử dụng dịch huyền phù lọc vô trùng) L fermentum JCM-1173 (6mm) nhỏ L fermentum HM-579790 (8mm) nghiên cứu xác định khả sinh bacteriocin A.hydrophila Lactobacillus reuteri ghi nhận vào phân loại khoa học vi khuẩn lactic vào đầu kỉ 20, vào thời điểm này, loài bị nhầm lẫn với nhóm vi khuẩn Lactobacillus fermentum Đến năm 60 kỉ 20, nhà vi sinh học người Đức Gerhard Reuter phân biệt L reuteri L fermentum phân loại vào loài L fermentum dạng sinh học II Đến năm 1980, Kandler cộng xác định khác biệt rõ L reuteri dạng sinh học khác L fermentum, từ tên khoa học “reuteri” chọn theo tên nhà khoa học Gerhard Reuter để phân biệt với L fermentum L reuteri phân lập từ nhiều nguồn thực phẩm, đặc biệt sản phẩm từ thịt sữa L reuteri vi khuẩn lên men dị hình, Gram dương, hình que cong với đầu trịn đơn, theo cặp cụm nhỏ, hoạt động probiotic loài thể qua khả ức chế hoạt động tác nhân gây bệnh, kết hợp nhiều chế bao gồm sản sinh acid lactic, H2O2 bacteriocin Bacteriocin sinh loài reuterin Reuterin hợp chất trung tính phân tử nhẹ, tan nước, 64 hoạt động khoảng pH rộng kháng với enzyme phân giải protein lipid, có khả ức chế phát triển số vi khuẩn gây hại gram dương Gram âm, lồi thuộc nấm động vật ngun sinh Đã có nghiên cứu tìm thấy L reuteri sinh đủ lượng reuterin để gây hiệu diệt khuẩn đáng mong đợi (Lei et al., 2011) Nghiên cứu xem nghiên cứu khởi phát cho việc phát L reuteri tồn ruột động vật thủy sản, cụ thể cá lăng sống tự nhiên với khả đối kháng sinh bacteriocin A hydrophila Kết có ý nghĩa lớn cho nghiên cứu vi khuẩn có tiềm làm probiotic phòng bệnh gan thận mủ bệnh xuất huyết cá tra mà việc sử dụng sinh vật đối kháng bacteriocin để ức chế lại A.hydrophila vấn đề tương đối chưa tìm thấy nghiên cứu thực nước sử dụng Lactobacillus spp hay bacteriocin vi khuẩn sinh để ức chế lại IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận: Trong nghiên cứu thực phân lập 96 chủng vi khuẩn lactic từ ruột cá da trơn tự nhiên, có 46 chủng thể tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh A.hydrophila Từ nghiên cứu, tìm chủng vi khuẩn có khả sinh bacteriocin thơ, có tiềm sử dụng làm probiotic Kết định danh xác định chủng sinh bacteriocin phân lập từ cá lăng Lactobacillus reuteri, chủng phân lập từ cá tra Lactobacillus fermentum Đề nghị: Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện mơi trường ni khả đối kháng sinh bacteriocin L reuteri L fermentum, tiếp tục nghiên cứu hợp chất bacteriocin sinh L fermentum, thực nghiên cứu khả đối kháng sinh bacteriocin hai chủng vi khuẩn chủng vi khuẩn gây bệnh khác động vật thủy sản, thực thí nghiệm điều kiện in vivo,… TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Dương Thị Kim Loan, 2013 Phân lập đánh giá khả kháng khuẩn vi khuẩn lactic vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasius hypothalamus) Luận văn cao học ngành nuôi trồng thủy sản, 2013, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Văn Thành Nguyễn Ngọc Trai, 2012 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ đốm đỏ cá tra Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 2012:23a 224-234 Quách Văn Cao Thi, Từ Thanh Dung Đặng Phạm Hòa Hiệp, 2014 Hiện trạng kháng thuốc kháng sinh hai loài vi khuẩn Edwardsiellaictaluri Aeromonashydrophila gây bệnh cá tra (Pangasianodonhypophthamus) Đồng sơng Cửa Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Số chuyên đề: Thủy Sản (2014) (2): 7-14 Tài liệu tiếng Anh Allameh, S.K., F.M Yusoff, H.M Daud, E Ringø, A.Ideris and C R.Saad, 2013 Characterization of probiotic Lactobacillus fermentum isolated from snakehead, Channa striatus, stomach Journal of the World Aquaculture Society Volume 44, Issue 6, pages 835–844, December 2013 Aslim, B., Z N Yuksekdag, E Sarikaya and Y Beyatli, 2005 Determination of the bacteriocin-like substances produced by some lactic acid bacteria isolated from Turkish dairy products LWT 38: 691-694 Barrow, G.I and Feltham, R.K.A (1993) Cowan and steel’s manual for the identification of medical bacteria 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 331 Chen, H and Hoover, D., 2003 Bacteriocins and their Food Applications Compr Rev Food Science Food Safety, 2: 82-89 Dilek Heperkan, 2014 Antimicrobial activity of lactic acid bacteria on pathogens in foods – Why successful? How successful? Food Technology 2014, 21-23 July, Las Vegas Lei, B., A L Molan, L S Maddox, Q Shu, 2011 Antimicrobial activity of Lactobacillus reuteri DPC16 supernatants against selected food borne pathogens World Journal of Microbiology and Biotechnology (Impact Factor: 1.78). 04/2011; 27(4):991-998 Nirunya, B., C Suphitchaya and H Tipparat, 2008 Screening of lactic acid bacteria from gastrointestinal tracts of marine fish for their potential use as probiotics Songklanakarin J Sci Technol.30 (Suppl.1), 141-148, April 2008 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 65 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II SCREENING OF LATIC ACID BACTERIA FOR THEIR ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST Aeromonas hydrophila CAUSING HEMORRHAGIC DISEASE IN TRA CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) Tran Thi Ngoc Phuong1*, Dang Thi Hoang Oanh1 ABSTRACT The research was conduted to isolate acid lactic bacteria from the gastroinstestinal tracts of wild freshwater catfish and then screen for their antimicrobial activity against Aeromonas hydrophila causing Hemorrhagic disease in cultured Tra catfish As the result, 96 strains of lactic acid bacteria which had inhibitory activity against indicator bacteria Escherichia coli were selected with 29 strains isolated from stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)), 24 strains from Mystus nemurus (Valenciennes, 1839), 21 strains from Pangasius larnaudii (Bocourt, 1866), 12 strains from Clarias macrocephalus (Gunther, 1864) and strains from Pangasius larnaudii (Bocourt, 1866) The result of Gram staining and biochemical characteristic tests illustrated most of selected strains of lactic acid bacteria were Gram-positive; nonsporulating; spherical, oval, short rod or long rod shape; negative oxidase and negative catalase The result of antagonistic activity determination indicated that 46 LAB strains exhibited their inhibitory activity and three of them presented the ability to produce bacteriocin-like substances Keywords: Aeromonas hydrophila, antimicrobial activity, lactic acid bacteria, probiotic Người phản biện: TS Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 25/11/2016 Ngày thông qua phản biện: 13/12/2016 Ngày duyệt đăng: 05/01/2017 College of Aquacutulre and Fisheries, Cantho University * Email: phuongb1206814@student.ctu.edu.vn 66 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 ... nhiều cá da trơn nước thu từ tự nhiên Do nghiên cứu thực nhằm phân lập sàng lọc chủng vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn tự nhiên có khả kháng với vi khuẩn A .hydrophila gây bệnh xuất huyết cá. .. trùng gây chủng vi khuẩn lactic Từ đó, xác định chủng có tính kháng khuẩn cao từ loài cá xác định chủng tốt thuộc loài cá III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập sàng lọc vi khuẩn lactic có tính kháng. .. H2O2 Các acid hữu ức chế vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, nấm,… Trong đó, acid hữu có khả sinh chất ức chế diệt khuẩn với acid acetic mạnh acid lactic, vi khuẩn