Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM MỐC SINH AFLATOXIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực MSSV: 1311100092 : Nguyễn Trần Yến Tiên Lớp: 13DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu hướng dẫn Tiến sĩ Nguyễn Hồi Hương khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Những kết hồn tồn khơng chép từ nghiên cứu khoa học khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án hồn tồn trung thực Tơi xin chịu trách nhiệm tồn đồ án Tp.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Trần Yến Tiên Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành đồ án “Phân lập định danh vi khuẩn lactic có khả ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin” suốt trình học tập, rèn luyện trau dồi kiến thức Cũng khơng lần gặp khó khăn trắc trở nhờ hướng dẫn tận tình Cơ Nguyễn Hoài Hương em hoàn thành đồ án Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tận tình Cơ Nguyễn Hồi Hương Khoa Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Cơng nghệ TPHCM Chính nhờ Cơ truyền tải kiến thức kỹ để em đạt thành đồ án mà em thực hôm Chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc đến Thầy cô giảng viên Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM tạo điều kiện cho em tìm hiểu tài liệu để hồn thành đồ án tốt nghiệp thời gian quy định Dù hồn thành đồ án khó tránh khỏi sai sót định khả hiểu biết hạn hẹp thông tin tài liệu không khả quan để phục vụ trình thực đồ án Kính mong có góp ý hướng dẫn tận tình thầy để em học hỏi thêm kinh nghiệm, tích lũy cho q trình học tập rèn luyện chuẩn bị hành trang bước sang mơi trường làm việc sau Kính chúc Cơ Nguyễn Hồi Hương Thầy giảng viên, Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM sức khỏe, thành công may mắn Em xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Trần Yến Tiên Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU 10 Tính cấp thiết đề tài 10 Tình hình nghiên cứu 11 Mục tiêu nghiên cứu 12 Nội dung nghiên cứu 12 Phương pháp nghiên cứu .12 5.1 Phương pháp luận 12 5.2 Phương pháp xử lý số liệu 13 Kết cấu đồ án 13 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .14 1.1 Tổng quan nấm 14 1.1.1 Giới thiệu chung 14 1.1.2 Độc tố nấm 15 1.1.3 Tác hại nấm 17 1.1.4 Một số chủng nấm gây độc thực phẩm .18 1.1.5 Một số phương pháp khử nhiễm độc tố 19 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic .21 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 21 1.2.2 Phân loại .22 1.2.3 Đặc điểm hình thái vi khuẩn lactic 23 1.2.4 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 25 1.2.5 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 26 1.2.6 Quá trình trao đổi chất 28 1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men, trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic .31 1.2.8 Ứng dụng vi khuẩn lactic .32 Đồ án tốt nghiệp 1.2.9 Hoạt tính sinh học 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Địa điểm nghiên cứu .38 2.2 Thời gian thực .38 2.3 Vật liệu 38 2.3.1 Nguồn phân lập .38 2.3.2 Thiết bị dụng cụ 38 2.3.3 Hóa chất 38 2.3.4 Giống nấm 40 2.4 Phương pháp luận 40 2.5 Phương pháp thí nghiệm 43 2.5.1 Thu thập mẫu 43 2.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 43 2.5.3 Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hoá .45 2.6 Khảo sát khả tăng trưởng lên men lactic 49 2.7 Khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic phương pháp in vitro .49 2.7.1 Khảo sát khả đối kháng nấm trực phương pháp in vitro 49 2.7.2 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào 53 2.8 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic bảo quản hạt 55 2.8.1 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: 55 2.8.2 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: 57 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .60 3.1 Kết khảo sát hình thái, sinh lý, snh hoá .60 3.1.1 Thử nghiệm Catalase 61 3.1.2 Nhuộm Gram .62 3.1.3 Nhuộm bào tử 63 3.1.4 Khả lên men đường khả sinh khí 64 3.1.5 Thử nghiệm khả di động phương pháp thạch mềm .66 Đồ án tốt nghiệp 3.2 Khảo sát khả tăng trưởng lên men lactic 71 3.3 Khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic phương phap in vitro 73 3.3.1 Khảo sát khả kháng nấm trực tiếp chủng vi khuẩn lactic 73 3.3.2 Khả sinh enzyme ngoại bào 76 3.4 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: 78 3.5 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: 87 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .94 4.1 Kết luận 94 4.2 Kiến nghị 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 PHỤ LỤC Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales VK Vi khuẩn MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng chi vi khuẩn lactic 25 Bảng 1.2 Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) .34 Bảng 1.3 Các sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic có tính kháng sinh (Holzapfel cộng sự, 1995) 35 Bảng 1.4 Khả đối kháng sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB (Holzapfel cộng sự, 1995) 37 Bảng 2.1: Kí hiệu nguồn phân lập 43 Bảng 3.1: Bảng kí hiệu chủng vi khuẩn phân lập .61 Bảng 3.2 Trình bày hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào vi khuẩn phân lập 67 Bảng 3.3 Trình bày tóm tắt chủng phân lập có đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn lên men lactic 70 Bảng 3.4: Bảng xử lý số liệu khả sinh acid giá trị OD 11 chủng vi .71 khuẩn phân lập .71 Bảng 3.5: Phân nhóm chủng vi khuẩn lactic 72 Bảng 3.6 Thống kê số liệu phần trăm tỉ lệ ức chế 11 chủng vi khuẩn phân lập với chủng nấm mốc theo phương pháp cấy đường vi khuẩn 74 Bảng 3.7 Kết khả sinh enzyme chủng vi khuẩn 76 Bảng 3.8 Khả kháng nấm CĐP1 Canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng .78 Bảng 3.9 Khả kháng nấm CĐP2 Canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng .82 Bảng 3.10 Khả kháng nấm CĐP1 Canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng .87 Bảng 3.11 Khả kháng nấm CĐP2 Canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng .89 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.12 Thời gian bắt đầu xuất tơ nấm (ngày) 11 chủng vi khuẩn với mật độ cảm nhiễm 101bt/g đậu phộng 102bt/g đậu phộng 90 Bảng 3.13 So sánh khả tăng trưởng, lên men lactic, kháng nấm in vitro in vivo chủng vi khuẩn phân lập 91 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1: Một số vi khuẩn lactic điển hình 24 Hình 1.2 Sơ đồ đường lên men lactose vi khuẩn lactic .29 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập định danh sơ vi khuẩn lactic 42 Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu 44 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy đường vi khuẩn .50 Hình 2.4: Mơ tả cách đo đường kính vòng ức chế phương pháp vạch đường vi khuẩn 52 Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm khả sinh enzyme chủng LAB 53 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic 60 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic mơi trường có chứa chất thị 61 Hình 3.3: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính chủng vi khuẩn KC1A, Đối chứng âm nước cất, thử nghiệm dương tính Bacillus spp 62 Hình 3.4 Kết nhuộm gram chủng vi khuẩn: A Vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu tím B Vi khuẩn E.coli bắt màu hồng C Vi khuẩn phân lập 63 Hình 3.5 Kết nhuộm bào tử chủng vi khuẩn A Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử B Vi khuẩn E.coli không sinh bào tử C Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử 64 Hình 3.6 Thử nghiệm lên men đường Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường Ống 2: Vi khuẩn lên men đường có sinh khí Ống 3: Vi khuẩn lên men đường khơng sinh khí 65 Hình 3.7 Vi khuẩn lactic phân lập có khả lên men đường 66 Sau thử nghiệm lên men đường, thu kết cho thấy số 11 chủng phân lập có 10 chủng vi khuẩn lên men đồng hình, chủng lại lên men dị hình Các chủng phân lập từ Kim chi lên men đồng hình sinh acid lactic, với chủng phân lập từ Nem chua có chủng lên men dị hình, Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kim chi phân lập chủng từ nem chua phân lập chủng vi khuẩn vi khuẩn lên men lactic, 10 chủng vi khuẩn lên men lactic hình que chủng hình cầu, 10 chủng lên men đồng hình chủng lên men dị hình với khả lên men sinh acid lactic tăng trưởng khác Khả kháng nấm in vitro 11 chủng xác định phương pháp đối kháng trực tiếp cách ria đường vi khuẩn, 11 chủng thể khả đối kháng nấm Aspergillus spp sinh aflatoxin, chủng NC412 kháng nấm Aspergillus sp CĐP1 mạnh nhất; chủng KC242 KC1A kháng nấm Aspergillus sp CĐP2 mạnh Các chủng có khả kháng nấm mạnh đa số có khả sinh enzyme chủng KC1A NC412 sinh enzyme protease, chủng KC242 sinh enzyme protease chitinase Trong số chủng phân lập, chủng KC1A NC412 phân lập từ kim chi nem chua thể khả kháng nấm số ngày bảo quản đậu phộng cao nhất, ngồi thể khả tăng trưởng, lên men lactic nồng độ acid lactic sau 24 nuôi cấy môi trường MRS lỏng tốt 4.2 Kiến nghị Tiếp tục phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả kháng nấm cao từ thực phẩm lên men truyền thống Mở rộng thêm chủng nấm thị Ứng dụng bảo quản nhiều loại hạt khác 94 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003) Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn ni NXB nơng nghiệp Hồng Quốc Khánh cộng Phân lập, định danh xác định chủng Lactobacillus có tiềm Probiotic từ người Viện Sinh Học Nhiệt Đới Lưu Đại Kim Phượng (2016) “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.” Trường Đại học Công nghệ TP.HCM Lê Ngô Vũ Phượng (2016) “Thử nghiệm phương pháp đánh giá khả đối kháng chủng vi khuẩn Bacillus spp Lactobacillus spp số nấm mốc Aspergillus spp sinh aflatoxin” Trường Đại học Công nghệ TP.HCM Trần Lê Bích Trâm( 2016) “Khảo sát khả kháng nấm hợp chất thứ cấp vi khuẩn lactic ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng” Trường Đại học Công nghệ TP.HCM Nguyễn Thị Hiền, Phan Thị Kim, Trương Thị Hòa, Lê Thị Lan Chi, Vi sinh vật nhiễm tạp lương thực - thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, 2009 Nguyễn Lân Dũng, 2003, Vi sinh vật học, NXB nông nghiệp Tài liệu Tiếng Anh: Holzapfel, W H., R Geisen, and U Schillinger 1995 Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and foodgrade enzymes Scott, P.M 1984 Effects of food processing on mycotoxins J Food Prot., 47(6): 489 10 Magnusson, J and J Schnurer 2001 Lactobacillus coryniformis subsp coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound Appl Environ Microbiol 67(1):1-5 95 Đồ án tốt nghiệp 11 Corsetti, A., M Gobbetti, J Rossi, and P Damiani 1998 Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1 Applied Microbiology and Biotechnology 50(2):253-256 12 Roy, U., V K Batish, S Grover, and S Neelakantan 1996 Production of antifungal substance by Lactococcus lactis subsp lactis CHD-28.3 International Journal of Food Microbiology 32(1-2):27-34 13 Corsetti, A., M Gobbetti, and E Smacchi 1996 Antibacterial activity of sourdough lactic acid bacteria: isolation of a bacteriocin-like inhibitory substance from Lactobacillus sanfrancisco C57 Food Microbiology 13(6):447-456 14 De Man, J.C., Rogosa, M & Sharpe, M.E (1960) A medium for the cultivation of Lactobacilli Journal of Applied Bacteriology, 23, 130-135 Tài liệu Internet: https://vi.wikipedia.org/wiki/Nấm 96 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A Đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn KC211 Thử nghiệm khả di động KC1A KC1B Thử nghiệm lên men đường Đồ án tốt nghiệp KC106 KC242 KC13 Đồ án tốt nghiệp NC2 NC12 NC15 Đồ án tốt nghiệp NC172 NC412 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B Xử lý số liệu theo phần mềm SAS 9.4 Tỉ lệ ức chế nấm CĐP1 11 chủng vi khuẩn Class Level Information Class CHUNG Levels Values 11 KC106 KC13 KC1A KC1B KC211 KC242 NC12 NC15 NC172 NC2 NC412 Number of Observations Read 33 Number of Observations Used 33 Dependent Variable: TYLEUCCHE Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 10 2242.614819 224.261482 Error 22 28.719273 1.305422 Corrected Total 32 2271.334093 171.79 F CHUNG 10 2242.614819 224.261482 171.79 F Model 10 2884.83465 288.483465 Error 22 47.383748 2.153807 Corrected Total 32 2932.21840 R-Square Coeff Var Root MSE TYLEUCCHE Mea n 0.983840 4.978819 1.467585 29.47658 Source D F Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUN G 10 2884.83465 288.48346 133.94