Phân lặp vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi và antibio

Tóm tắt Tính cấp thiết: Ngộ độc thực phẩm trở thành vấn đề cấp thiết cần giải để bảo vệ sức khỏe người, việc dùng chất bảo quản thực phẩm hóa học bị hạn chế sử dụng tác dụng phụ khơng có lợi Hiện nay, có nhiều nghiên cứu chứng minh nhóm vi khuẩn lactic phân lập loại thực phẩm lên men có khả sinh chất kháng khuẩn Dạng chất kháng khuẩn có khả chống lại phát triển mầm bệnh ứng dụng chất bảo quản thực phẩm Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập 1-2 chủng vi khuẩn lactic có khả sinh chất kháng khuẩn thực phẩm len men men tiêu hóa đông khô Nội dung nghiên cứu: Phân lập chủng vi khuẩn lactic từ sản phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio, khảo sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa chủng phân lập được, cuối khảo sát khả sinh chất kháng khuẩn chủng phân lập Phương pháp: Kiểm tra khả sản sinh chất kháng khuẩn từ dòng phân lập phương pháp khuếch tán giếng thạch kết hợp với vi khuẩn thị Escherichia coli Quá trình khảo sát tiến hành thí nghiệm: - Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn lactic từ sản phẩm cơm mẻ, lạp xưởng tươi, kiệu muối chua antibio đồng thời thực vài kiểm tra nhận diện vi khuẩn lactic - Thí nghiệm 2: Khảo sát chọn lọc chủng vi khuẩn lactic sinh chất kháng khuẩn Kết quả: Phân lập 11 chủng vi khuẩn lactic kiểm tra tính kháng khuẩn, chủng có khả tổng hợp chất kháng khuẩn: CM1, LX1, LX2, A1 A2 tính kháng khuẩn chúng yếu Vì vậy, chủng vi khuẩn lactic mẫu phân lập sinh kháng khuẩn yếu iii Lời cam kết Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu cơng trình nghiên cứu có xuất xứ rõ ràng Những kết luận khoa học cơng trình nghiên cứu chưa cơng bố cơng trình khác Long Xuyên, ngày 02 tháng 01 năm 2016 Phan Thị Bích Duyên Nguyễn Thị Phương Thảo iv Mục lục Nội dung Trang Lời cảm ơn i Abstract ii Tóm tắt iii Lời cam kết .iv Mục lục v Danh sách hình viii Danh sách bảng ix Danh sách sơ đồ x Danh sách chữ viết tắt .xi Chƣơng Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu Chƣơng Lƣợc khảo tài liệu 2.1 Giới thiệu cơm mẻ, kiệu muối chua, lạp xưởng tươi antibio 2.1.1 Cơm mẻ 2.1.2 Kiệu muối chua 2.1.3 Lạp xưởng tươi 2.1.4 Antibio 2.2 Vi khuẩn lactic 2.2.1 Đặc điểm chung 2.2.2 Sự phân bố 2.2.3 Phân loại vi khuẩn lactic 2.2.4 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 2.2.5 Những ứng dụng vi khuẩn lactic 10 2.3 Quá trình lên men lactic 12 2.4 Sơ lược vi khuẩn chủng thị Escherichia coli (E.coli) 13 2.4.1 Phân loại khoa học (Castellani & Chalmers, 1919) 13 2.4.2 Đặc điểm Escherichia coli (Nguyễn Lân Dũng, 2008) 13 v 2.5 Chất kháng khuẩn 15 2.5.1 Tính kháng khuẩn vi khuẩn lactic 15 2.5.2 Sơ lược bacteriocin 15 2.5.2.1 Giới thiệu chung 15 2.5.2.2 Phân loại 16 2.5.2.3 Cơ chế tác động 17 2.5.3 Lợi ích hạn chế bacteriocin 18 2.6 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic nước 19 2.6.1 Trong nước 19 2.6.2 Ngoài nước 20 Chƣơng Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 21 3.2 Mẫu nghiên cứu 21 3.3 Thiết kế nghiên cứu 21 3.4 Công cụ nghiên cứu 21 3.4.1 Thiết bị dụng cụ 21 3.4.2 Mơi trường hóa chất: 22 3.5 phương pháp nghiên cứu 23 3.5.1 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn lactic từ mẫu: cơm mẻ, kiệu muối chua, lạp xưởng tươi, antibio quan sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa để nhận diện vi khuẩn lactic 23 3.5.1.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ kiệu muối chua 23 3.5.1.2 Phân lập vi khuẩn lactic từ cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio 24 3.5.1.3 Khảo sát đặc điểm hình thái kiểm tra sinh hóa để nhận diện vi khuẩn lactic 25 3.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả sinh chất kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic phân lập 28 3.5.2.1 Chuẩn bị dịch ly tâm vi khuẩn lactic 28 3.5.2.2 Chuẩn bị dịch huyền phù dòng thị vi khuẩn E.Coli 28 3.5.2.3 Thử khả sinh chất kháng khuẩn 28 Chƣơng Kết thảo luận 31 4.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn lactic mẫu sản phẩm, quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 31 vi 4.1.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn lactic mẫu sản phẩm quan sát hình thái khuẩn lạc chúng 31 4.1.2 Kết nhuộm gram kiểm tra sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 34 4.2 Kết xác định chọn lọc chủng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn cao 40 Chƣơng Kết luận kiến nghị 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Kiến nghị 44 Tài liệu tham khảo 45 vii Danh sách hình Nội dung Trang Hình 1: Cơm mẻ Hình 2: Kiệu muối chua Hình 3: Lạp xưởng tươi Hình 4: Antibio Hình 6: Vi khuẩn lactic hình que Hình 5: Vi khuẩn lactic hình cầu Hình 7: Vi khuẩn E.coli 14 Hình 8: Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli 14 Hình 9: Vi khuẩn E.coli chụp kính hiển vi 100X 14 Hình 10: Mơ tả vịng kháng khuẩn đĩa petri 29 Hình 11: Hình thái khuẩn lạc mẫu Antibio: A1 33 Hình 12: Hình thái khuẩn lạc mẫu cơm mẻ: CM2 33 Hình 13: Hình thái khuẩn lạc mẫu Kiệu: K1 34 Hình 14: Hình thái khuẩn lạc mẫu Lạp xưởng tươi: LX1 34 Hình 15: Hình thái tế bào vi khuẩn chủng A1 36 Hình 16: Hình thái tế bào vi khuẩn chủng CM2 36 Hình 17: Hình thái tế bào vi khuẩn dòng K1 37 Hình 18: Hình thái tế bào vi khuẩn dòng LX1 37 Hình 19: Kết kiểm tra sinh hóa chủng A1 38 Hình 20: Kết kiểm tra sinh hóa chủng CM2 38 Hình 21: Kết kiểm tra sinh hóa chủng K1 39 Hình 22: Kết kiểm tra sinh hóa chủng LX1 39 Hình 23: Vịng kháng khuẩn chủng A1 41 Hình 24: Vịng kháng khuẩn chủng A2 41 Hình 25: Vịng kháng khuẩn chủng CM1 42 Hình 26: Vịng kháng khuẩn chủng LX1 42 Hình 27: Vịng kháng khuẩn chủng LX2 43 viii Danh sách bảng Nội dung Trang Bảng 1: Các chi vi khuẩn lactic, kiểu lên men sản phẩm Bảng 2: Thành phần môi trường MRS Broth 22 Bảng 3: Thành phần môi trường Nutrient 22 Bảng 4: Kết phân lập chủng vi khuẩn quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc 32 Bảng 5: Kết kiểm tra sinh hóa chủng vi khuẩn lactic phân lập 35 Bảng 6: Kích thước vịng kháng khuẩn chủng vi khuẩn 40 ix Danh sách sơ đồ Nội dung Trang Sơ đồ 1: bước phân lập vi khuẩn lactic từ kiệu muối chua 23 Sơ đồ 2: phân lập vi khuẩn lactic từ cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio 25 Sơ đồ 3: quy trình nhuộm gram 26 Sơ đồ 4: kiểm tra khả sinh chất kháng khuẩn 30 x Danh sách chữ viết tắt A: Antibio CM: Cơm mẻ K: Kiệu LAB: Vi khuẩn Lactic LX: Lạp xưởng xi Chƣơng Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, ngộ độc thực phẩm trở thành vấn đề cấp thiết cần giải để bảo vệ sức khỏe người Bên cạnh đó, việc dùng chất bảo quản thực phẩm hóa học bị hạn chế sử dụng tác dụng phụ khơng có lợi Theo thống kê Bộ Y tế, hàng năm có khoảng 200 – 600 trường hợp ngộ độc thực phẩm, chiếm 50% ngộ độc vi sinh vật (Lương Đức Phẩm, 2005) Ở nước ta, sản phẩm lên men truyền thống có từ lâu đời ứng dụng rộng rãi đời sống ngành công nghiệp thực phẩm Thực phẩm tạo thành trình lên men lactic từ chủng vi khuẩn phong phú cơng nhận an tồn người sử dụng Tuy nhiên, từ trước đến vi khuẩn ln bị hiểu lầm lồi vi sinh vật gây hại người thường gắn liền chúng với bệnh tật Nhưng thực tế, có nhiều loại vi khuẩn có lợi cho Trong hệ tiêu hóa có hệ vi sinh vật với số lượng lớn, có 400 loài vi khuẩn khác (Melissa Peterson et al., 2002), đặc biệt chủng vi khuẩn lactic Người ta chứng minh chắn nhiều loại vi khuẩn lactic sản sinh chất kháng khuẩn (Pongtep Wilaipun et al., 2002) Hoạt động kháng vi sinh vật nhóm vi khuẩn ứng dụng 10.000 năm qua người kéo dài thời gian sử dụng nhiều loại thực phẩm thông qua trình lên men vi khuẩn lên men Phần lớn hiệu bảo quản vi khuẩn lactic khả sinh tổng hợp nhiều thành phần có tác dụng ức chế như: acid hữu cơ, H2O2, bacteriocin (Lindgren & Dobrogosz, 1990; Piard & Desmazeaud, 1992) Do đó, việc sử dụng dịng vi khuẩn có lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh trọng, đặc biệt nhóm vi khuẩn lactic Trong tương lai sử dụng bảo quản thực thực phẩm biện pháp sinh học (Hugas et al., 2003) Nhóm vi khuẩn có ứng dụng rộng rãi thực tiễn với acid lactic nguyên liệu cần thiết nhiều ngành công nghiệp Đặc biệt, công nghiệp chế biến bảo quản thực phẩm sữa chua, loại dưa từ rau củ, loại sản phẩm thủy sản lên men (Lương Đức Phẩm, 2004) ta ứng dụng việc sản xuất chế phẩm probiotic có lợi cho sức khỏe Hơn nữa, hệ vi sinh khuẩn lactic nguồn vi sinh vật sinh bacteriocin, dạng chất kháng khuẩn có khả chống lại phát triển mầm bệnh ứng dụng chất bảo quản thực phẩm, điển hình nisin Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất phổ biến chủ yếu sản phẩm lên men truyền thống dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua số sản phẩm men tiêu hố đơng khơ Nên vấn đề sản xuất bảo quản thực phẩm lên men an toàn cấp thiết Đề tài “Phân lập vi khuẩn lactic rau muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi antibio có khả sinh chất kháng khuẩn” thực Nhằm làm tiền đề cho việc nghiên cứu dịng vi khuẩn lactic có khả kháng khuẩn cao để ứng dụng sản xuất bảo quản thực phẩm lên men 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập - chủng vi khuẩn có khả sinh chất kháng khuẩn sản phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio khảo sát khả kháng khuẩn chúng 1.3 Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng vi khuẩn lactic từ sản phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio khảo sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa chủng phân lập Khảo sát khả sinh chất kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic phân lập Chƣơng Lƣợc khảo tài liệu 2.1 Giới thiệu cơm mẻ, kiệu muối chua, lạp xƣởng tƣơi antibio 2.1.1 Cơm mẻ Lên men cơm mẻ chủ yếu lên men vi khuẩn lactic có nhiều chủng loại vi khuẩn lactic tham gia theo kiểu đồng hình hay dị hình Hệ vi sinh vật cơm mẻ truyền thống gồm: tuyến trùng, nẩm men vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic lên men chua (sản sinh acid lactic) từ tinh bột chín (Nguyễn Văn Bá, 2008) C6H12O6 CH3CHOCOH + Kcal (lên men đồng hình) (Acid lactic) Bản thân vi khuẩn lactic tạo nên chất kháng sinh cần thiết để diệt vi sinh vật có hại khác nên có lợi cho người ăn Cũng nhờ đặc tính mà ăn cơm mẻ sống có lợi nhiều ăn cơm mẻ chín Hình 1: Cơm mẻ (Nguyễn Anh Tuấn, 2011) 2.1.2 Kiệu muối chua Quá trình lên men lactic muối chua kiệu chia thành ba giai đoạn: (Internet8) Giai đoạn 1: Muối ăn (NaCl) có nồng độ 2,5 – 3% muối kiệu làm cho môi trường ưu trương đường chất từ tế bào kiệu phần khuếch tán mơi trường, vi khuẩn lactic vi sinh vật khác phát triển Giai đoạn 2: Do vi khuẩn lactic phát triển mạnh, nên pH môi trường giảm xuống – 3,5 làm ức chế vi khuẩn khác, vi khuẩn lactic phát triển, chúng chiếm ưu tuyệt đối, kiệu trở nên chua, ngon Đây giai đoạn định, không tạo ưu vi khuẩn lactic, vi khuẩn khác phát triển làm kiệu khú nguyên nhân sau: - Kiệu rửa khơng kỹ, làm dập nát, có nhiều tạp khuẩn - Cho muối không 2,5 – 3% (nếu – 6% ức chế vi khuẩn lactic, 3% nhiều tạp khuẩn phát triển lấn át) - Không đậy, nén kỹ, không tạo điều kiện kỵ khí cho vi khuẩn lactic phát triển pH yếu tố quan trọng, vi khuẩn lactic phát triển ưu pH – 3,5, cịn khơng vi sinh vật khác phát triển (pH 4,5 – 5: vi khuẩn gây thối hoạt động, pH – 5,5: vi khuẩn đường ruột phát triển, pH 2,5 – 3: nấm men dại hoạt động, pH 1,2 – 3: nấm mốc phát triển) Giai đoạn 3: Khi kiệu chua, pH giảm xuống đến 3, vi khuẩn lactic bị ức chế, để tự nhiên nấm men dại, nấm mốc bắt đầu phát triển phân giải axit lactic thành CO2 H2O, pH tăng lên, sản phẩm bắt đầu có váng (váng dưa, váng cá) mơi trường giảm chua, có mùi mốc, có nhiều bọt khí (nấm men dại thường có Geotrichumcandidum) Khi muối kiệu lên men lactic có thành phẩm đạt yêu cầu: - Tạo sinh khối vi khuẩn có ích, át sinh vật gây thối - Gây chua, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm - Chuyển kiệu dạng “chín sinh học” mà hiệu suất tiêu hóa tăng Nếu muốn giữ sản phẩm khơng cho “q lactic” giữ nhiệt độ thấp (20C-40C) đồng thời bổ sung chất diệt nấm bensozt natri 1%, dịch chiết tỏi, gừng, giềng Cần nói thêm vi khuẩn lactic không phá vỡ tế bào thực vật, nên kiệu muối chua có hình dạng gần khơng thay đổi Hình 2: Kiệu muối chua (Trịnh Huyền Na, 2014) 2.1.3 Lạp xƣởng tƣơi Lạp xưởng tươi sản phẩm thịt lên men phổ biến số tỉnh miền Tây: Tiền Giang, Sóc Trăng… với phối trộn hài hòa thịt, mỡ, số phụ gia lên men lactic hệ vi sinh vật làm cho lạp xưởng chua có kết cấu, hương vị màu sắc đặc trưng Vì hàm lượng nước sản phẩm cịn cao (khoảng 45%) nên sản phẩm có cấu trúc mềm lạp xưởng khô để tránh hư hỏng phải bảo quản sản phẩm nhiệt độ lạnh Hình 3: Lạp xƣởng tƣơi (Nguyễn Hòa, 2008) 2.1.4 Antibio Cơ chế tác động có ích Lactobacillus acidophilus chứa antibio bao gồm: - Lactobacillus acidophilus có khả tạo chất có tác dụng kiềm khuẩn trực tiếp như: acid lactic, lactocidin, acidophilin - Lactobacillus acidophilus kích thích miễn dịch không chuyên biệt niêm mạc: tăng tổng hợp IgA - Lactobacillus acidophilus ức chế tương tranh xâm nhập vi khuẩn gây bệnh Do đó, Antibio tăng cường chức bảo vệ niêm mạc ruột, giúp ngăn ngừa công vi sinh vật gây bệnh, làm giảm độc tính độc tố, kích thích miễn dịch cục miễn dịch ngoại biên, kích thích hoạt động enzym tiêu hóa thức ăn (Internet6) Hình 4: Antibio (Thanh Hoài, 2013) 2.2 Vi khuẩn lactic 2.2.1 Đặc điểm chung Vi khuẩn lactic xếp chung vào họ Lactobacteriaceae (Bergey, 1979) xếp vào chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus Leuconostoc, ngày người ta bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic chủng vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm có đặc điểm sinh thái khác đặc tính sinh lý tương đối giống Tất có đặc điểm chung vi khuẩn Gram dương, thử nghiệm oxydase catalase âm tính, hình que hay hình cầu, lên men carbohydrate tạo sản phẩm cuối acid lactic (Abee et al., 1999) Vi khuẩn lactic có khả phân giải H2O2 để tạo nước O2 để phát triển Hình 5: Vi khuẩn lactic hình cầu (Hồng Văn Vinh, 2006) Hình 6: Vi khuẩn lactic hình que (Hồng Văn Vinh, 2006) 2.2.2 Sự phân bố Ít gặp đất nước, thường phát triển môi trường có chứa nhiều chất hữu phức tạp như: - Trong sữa sản phẩm từ sữa thường gặp Lactobacillus lactic, Lactobacillus bulgarius, Lactobacillus helviticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus ferment, Lactobacillus brevis, Streptococcus diacetyllactis Để tồn môi trường sữa vi khuẩn lactic tổng hợp ATP từ chất lactose - Trên bề mặt thực vật xác thực vật bị phân giải hay có Lactobcillus plantanium, Lactobcillus delnikii, Lactobcillus ferment, Lactobacillus brevis, Streptococcus lactis Chúng cịn tìm thấy loại rau quả, trái - Trong ruột niêm dịch người động vật có Lactobacillus acidophilus, Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus salivanius, Streptococcus pyogenes, Bifidobacterrium, Pneumococcus 2.2.3 Phân loại vi khuẩn lactic Dựa vào q trình lên men đường: có loại - Vi khuẩn lactic đồng hình: Streptococus lactic, Streptococcus cremoris,… Vi khuẩn lên men lactic đồng hình sản sinh 85%- 95% acid lactic Do thiếu porphyrin cytochrom, khơng có chuỗi vận chuyển electron nên chúng thu lượng đường lên men bắt buộc Trong tế bào vi khuẩn có chứa enzymealdolase triosophotphatizomerase - Vi khuẩn lactic dị hình: Vi khuẩn lên men lactic dị hình sản sinh 50% acid lactic, 25% cồn 25% acid acetic Nhóm vi khuẩn gồm có vi khuẩn sinh hương Streptococcus votrovorus, Streptococcus paracotrovorus, Streptococcus diactylactis, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermenti, Bảng 1: Các chi vi khuẩn lactic, kiểu lên men sản phẩm (Lê Văn Việt Mẫn, 2014) Chi dƣới chi Sản phẩm Kiểu lên men (Tỷ lệ phân tử) Cấu hình acid lactic Streptococcus Đồng hình Lactat L(+) Pediococcus Đồng hình Lactat DL L(+) Lactobacillus Đồng hình Lactat Thermobacterium Đồng hình Lactat D(-), L(+), DL Streptobacterium Dị hình Lactat : axetat D(-), L(+), DL (tùy tiện) 1:1 Dị hình Lactat : axetat : CO2 Betabacterium DL 1:1:1 Leuconostoc Dị hình Lactat : axetat : CO2 D(-) 1:1:1 Bifidobacterium Dị hình Lactat : axetat L(+) 2:3 Dựa vào hình thái: người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu hình que, kích thước thay đổi tùy lồi - Giống Streptococcus có dạng hình trịn hình ovan, đường kính tế bào 0,5 m m Sau phân chia theo phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đơi chuỗi ngắn - Giống Leuconostoc có hình dạng dài hình ovan, đường kính từ 0,5 m 0,8 m chiều dài khoảng 1,6 m Trong số điều kiện chúng có dạng tròn, chiều dài khoảng 1-3 m Sau phân chia chúng thường xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung - Giống Lactobacillus có dạng hình que Tùy vào điều kiện mơi trường sống mà hình dạng chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài Sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ - Giống Pediococcus tứ cầu khuẩn song cầu khuẩn Có hoạt tính thủy phân protein yếu - Giống Bifidobacterium trực khuẩn, phân lập phân nhánh dạng chữ Y, V tập hợp thành khối Sau nhiều lần cấy truyền chúng trở thành dạng trực khuẩn thẳng cong Dựa vào tính mẫn cảm với oxi: có nhóm -Vi khuẩn lactic kỵ khí nghiêm ngặt - Vi khuẩn lactic yếm khí tùy tiện: Pediococcus cerevisiae - Vi khuẩn lactic vi hiếu khí (hiếu khí tùy tiện) Dựa vào nhiệt độ phát triển tối ưu: Các vi khuẩn ưa ấm có nhiệt độ tối thích từ 250C – 370C, lồi ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích từ 500C – 650C, nhóm ưa lạnh phát triển nhiệt độ 50C thấp (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008) - Vi khuẩn lactic ưa ấm: Streptococus lactic, Lactobacillus casei, L plantarum,… - Vi khuẩn lactic ưa nhiệt: Streptococus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, L helvetcus,… 2.2.4 Nhu cầu dinh dƣỡng vi khuẩn lactic Các loại vi khuẩn lactic khác có nhu cầu dinh dưỡng khác Chúng khơng có nhu cầu nguồn chất chứa nguyên tố cacbon, nitơ, photphat lưu huỳnh mà cịn có nhu cầu số chất cần thiết khác vitamin, muối vô cơ… (Lê Văn Việt Mẫn, 2004) Nhu cầu dinh dưỡng cacbon: - Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) polysaccarit (tinh bột, dextrin) - Chúng sử dụng nguồn cacbon để cung cấp lượng, xây dựng cấu trúc tế bào làm chất cho trình lên men tổng hợp acid hữu Nhu cầu dinh dưỡng nitơ: - Phần lớn vi khuẩn lactic sinh tổng hợp hợp chất chứa nitơ Vì để đảm bảo cho sinh trưởng phát triển chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn mơi trường - Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,… Hiện cao nấm men nguồn nitơ sử dụng nhiều hiệu Tuy nhiên, quy mô công nghiệp sử dụng nguồn nitơ tốn Nhu cầu vitamin: - Vitamin đóng vai trị coenzyme q trình trao đổi chất tế bào, nên cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số loại vi khuẩn lactic khơng có khả sinh tổng hợp vitamin Vì cần bổ sung vào mơi trường loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men… Nhu cầu hợp chất hữu khác: - Ngoài acid amin vitamin, vi khuẩn lactic cần hợp chất hữu khác cho phát triển bazơ nitơ hay axit hữu - Một số axit hữu có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng vi khuẩn lactic acid citric, acid oleic Nên người ta sử dụng muối citrat, dẫn xuất acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập bảo quản chủng vi khuẩn lactic - Tương tự hai acid hữu trên, acid acetic có tác động quan trọng đến sinh trưởng tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dạng muối acetat để làm chất đệm cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic Nhu cầu muối vô khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần muối vô Nhằm cung cấp nguyên tố khoáng đồng, sắt, natri, kali, phospho, lưu huỳnh, magie đặc biệt mangan, mangan giúp ngăn ngừa trình tự phân ổn định cấu trúc tế bào 2.2.5 Những ứng dụng vi khuẩn lactic Nhờ khả tạo acid lactic từ nguồn cacbon hydrat khác mà chủng vi khuẩn lactic ứng dụng nhiều ngành sản xuất chế biến (Lê Văn Việt Mẫn, 2004) ϖ Những ứng dụng công nghệ thực phẩm: Trong cơng nghệ thực phẩm, việc sử dụng q trình lên men lactic khơng nhằm mục đích bảo quản mà nhằm đưa thị trường loại thực phẩm có tính chất hương vị mong muốn Các ứng dụng chủ yếu gồm: - Chế biến sản phẩm sữa: + Ngoài khả lên men làm cho sữa khơng bị hỏng, chủng vi khuẩn lactic cịn có nhiều khả đặc biệt khác Nhờ mà người ta sản xuất hàng loạt sản phẩm từ nguồn nguyên liệu sữa ban đầu + Như lợi dụng khả làm đông tụ sữa vi khuẩn Streptococcus lactic để sản xuất sữa chua hay khả tạo mùi vị, tạo chất thơm chủng Leuconostoc để sản xuất bơ, phomat… - Sản xuất bánh mì đen: + Đây loại bánh mì có chất lượng cao bên cạnh trình lên men nấm men tạo rượu etylic CO2 + Người ta cịn sử dụng q trình lên men vi khuẩn lactic để tạo vị chua hương thơm đặc trưng cho sản phẩm - Ủ thức ăn gia súc: 10 + Đây phương pháp sử dụng phổ biến trang trại chăn nuôi Thức ăn ủ giảm tổn thất giá trị dinh dưỡng mà bổ sung nhiều loại vitamin vi sinh vật tổng hợp Phương pháp dựa vào chuyển hóa đường có sẵn nguyên liệu vi khuẩn lactic + Để khối ủ chua thức ăn gia súc có chất lượng tốt, người ta thường sử dụng vi khuẩn lactic khiết như: Lactobacillus plantarum, Thermobacterium cerealle - Muối chua rau + Cũng ủ chua thức ăn gia súc, vấn đề muối chua rau nhằm thực hai mục đích: Bảo quản nguyên liệu Làm tăng giá trị dinh dưỡng giá trị cảm quan + Đây phương phương pháp vừa chế biến vừa bảo quản rau phổ biến, sử dụng nhiều gia đình kĩ nghệ đồ hợp Hiện có nhiều sản phẩm muối chua sản xuất sử dụng sử dụng rộng rãi dưa cải muối chua, dưa chuột muối chua… - Sản xuất acid lactic muối lactat Ngoài việc ứng dụng sản phẩm lên men, người ta sử dụng chủng lactic Lctobacterium coaglulans Lactobacillus delbrueckii để sản xuất lượng lớn acid lactic muối lactat dùng làm chất phụ gia thực phẩm ϖ Ứng dụng y học: - Sinh acid lactic, tạo nhiều chất chống vi khuẩn khác acid hữu cơ, diacetyl, hydrogen peroxide bacteriocin nên ngăn cản diện phát triển vi khuẩn gây bệnh Ecoli, Salmonella (gây tiêu chảy), vi khuẩn Pylori (gây viêm loét dày) nấm Candida - Phòng ngừa ngăn chặn rối loạn tiêu hóa, giúp cân hệ vi khuẩn đường ruột, khôi phục lại cân vi khuẩn tự nhiên thể, chuyển lactose thành acid lactic, hạn chế dị ứng thể không dung nạp lactose - Hơn nữa, vi khuẩn lactic có tác dụng giảm cholesterol, kháng tác nhân gây ung thư Vài chủng vi khuẩn sinh enzyme có khả chuyển chất tiền sinh ung thư, tác nhân sinh ung thư glucosidase, azoreductase thành bệnh ung thư.Vi khuẩn lactic có khả ức chế phát triển tế bào ung thư, ức chế hoạt động vi khuẩn sinh enzyme phân huỷ nitrosamine - Một số vi khuẩn lactic có khả bảo vệ chống lại phân hủy đột biến DNA in vitro in vivo ϖ Một số ứng dụng khác: - Ứng dụng ngành công nghệ vật liệu 11 - Ứng dụng ngành mỹ phẩm Ngồi mặt có lợi ứng dụng phát huy, vi khuẩn lactic gây tác hại Gây tượng đục bị chua công nghệ sản xuất bia, nước ngọt, rượu vang, làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm Do cần phải có biện pháp phịng chống lại ảnh hưởng xấu (Lê Văn Việt Mẫn, 2004) 2.3 Quá trình lên men lactic Lên men lactic trình thu lượng nhờ vi khuẩn lactic, bao gồm biến đổi phân tử đường thành phân tử axit lactic lượng tách (Lương Đức Phẩm et al., 2009): C6H12O6 CH3HONCOOH + 0,075x106J Lượng sản phẩm tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng điều kiện ngoại cảnh, nói chung acid lactic thường chiếm 40% lượng đường phân hủy, acid sucxinic 20%, rượu etylic chiếm 10%, acid axetic 10% loại khí gần 20% Dựa vào sản phẩm sinh trình lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành nhóm lên men đồng hình lên men dị hình Lên men đồng hình (điển hình): + Trong trường hợp acid pyruvic tạo thành theo sơ đồ Embden-MayerhorfParnas (EMP) Sau acid pyruvic tạo thành axit lactic tác dụng enzyme lactadehydrogenase + Sản phẩm acid lactic 90% – 98% + Sản phẩm phụ ethanol, acid acetic, CO2, acetone + Chủ yếu thuộc giống Lactobacterium (trực khuẩn) Streptococcus Một số chủng điển hình: Lactobacterum bungaricum, Streptococcus lactic… Lên men dị hình (khơng điển hình): + Xảy trường hợp vi khuẩn lactic khơng có enzyme bản, xilulose 5-phosphate tạo thành theo đường pento-phosphate (PP) + Chỉ có 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngồi cịn tạo sản phẩm phụ khác như: acid acetic, ethanol, CO2 Các sản phẩm phụ tương tác với tạo thành ester có mùi thơm + Có men decacboxylase để phân hủy acid pyruvic, CO2, CH3CHO Tuy nhiên không phân hủy hết acid pyruvic + Cho độ tinh khiết không cao phức tạp + Chủ yếu thuộc giống Lactobacillus Bacterium Một số chủng điển hình: Bacterium coli, Lactobacillus brevis… 12 2.4 Sơ lƣợc vi khuẩn chủng thị Escherichia coli (E.coli) 2.4.1 Phân loại khoa học (Castellani & Chalmers, 1919) Vực (domain): Bacteria Ngành (phylum): Proteobacteria Lớp (class): Gamma Proteobacteria Bộ (ordo): Enterobacteriales Họ (familia): Enterobacteriaceae Chi (genus): Escherichia Loài (species): E coli 2.4.2 Đặc điểm Escherichia coli (Nguyễn Lân Dũng, 2008) Kích thước: – m x 0,5 m Khuẩn lạc trịn, màu trắng đục - Đặc điểm ni cấy: Sống hiếu khí kị khí tùy tiện Có thể phát triển nhiệt độ từ 50C – 400C, nhiệt độ tối ưu: 370C pH thích hợp 7,0 – 7,2 Trên mơi trường thạch dinh dưỡng NA tạo khóm trịn ướt (dạng S) màu trắng đục Trên môi trường Rapid‟ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím Trên mơi trường Macconkey, Endo, SS tạo khóm hồng đỏ Trên mơi trường đường - Các phản ứng sinh hóa: Indol dương, Methyl Red (phản ứng MR) dương tính, Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính Citrat âm tính, H2S âm tính, hồn nguyên nitrat thành nitrit, Lysine decarboxylaza dương tính Đun 550C 60 C 30 phút bị tiêu diệt Dễ bị diệt thuốc sát trùng thơng thường 13 Hình 7: Vi khuẩn E.coli (Lynn Yarris, 2011) Hình 8: Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli (Madprime, 2005) Hình 9: Vi khuẩn E.coli chụp dƣới kính hiển vi 100X (Võ Thành Thìn, 2012) 14 2.5 Chất kháng khuẩn 2.5.1 Tính kháng khuẩn vi khuẩn lactic Trong trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid hữu cơ, chúng tạo môi trường không thích hợp cho phát triển vi sinh vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức bảo vệ chức dinh dưỡng màng tế bào, ức chế trình vận chuyển chủ động màng tế bào Acid lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào tự oxi hố, làm dừng q trình trao đổi chất, gây chết tế bào nhạy cảm với (Lê Văn Nhương et al., 2009) Hơn nữa, vi khuẩn lactic biểu thị loạt hoạt động kháng khuẩn Trong số hoạt động đó, việc sản xuất acid lactic acid acetic quan trọng Ngoài ra, số chủng vi khuẩn lactic biết đến để sản xuất hợp chất kháng khuẩn ethanol, acid formic, acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, reutericyclin đặc biệt bacteriocin Bên cạnh việc sản xuất hợp chất bacteriocin, số vi khuẩn lactic cịn tổng hợp peptide kháng khuẩn khác góp phần vào việc bảo quản thực phẩm cách an toàn Một đặc điểm hợp chất kháng khuẩn khả chống lại vi khuẩn gây bệnh đường ruột Escherichia coli, Salmonella nhóm Vibrio spp (De Vuyst & Leroy, 2007) 2.5.2 Sơ lƣợc bacteriocin 2.5.2.1 Giới thiệu chung Bacteriocin chất kháng khuẩn có chất protein Loại vi khuẩn tạo loại bacteriocin có khả kháng lại bacteriocin Ngồi khơng gây phản ứng dị ứng thể người gây vấn đề sức khỏe, bacteriocin bị ảnh hưởng tác động enzyme trypsin, pepsin, α-chymotrypsin… Những sản phẩm vi khuẩn sinh có khả gây ức chế vi khuẩn khác có nhiều enzyme, antibiotic, bacteriocin Hiện người ta phát nhiều loại bacteriocin vi khuẩn tổng hợp nên nisin (Lactococcus lactis), subtilin (Bacillus subtilis), pediocin (Pediococcus acidilactici)… Người ta đưa nhiều tiêu chí để định nghĩa bacteriocin, tiêu chí dùng nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác để định nghĩa loại bacteriocin khác Những tiêu chí sau: - Phạm vi ức chế loại khác - Sự có mặt loại protein hoạt động - Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn - Loại tế bào mà tác dụng 15 - Những yếu tố di truyền - Do q trình tổng hợp sinh học có tính ức chế Năm 1953, thương phẩm nisaplin xuất thị trường chất bảo quản thực phẩm đến năm 1969, tổ chức WHO công nhận nisin chất bảo quản an tồn có nguồn gốc sinh học Trong công nghệ thực phẩm, nisin bacteriocin nghiên cứu ứng dụng rộng rãi chế biến bảo quản số loại thực phẩm phomat, xúc xích, sữa chua, số loại sản phẩm thịt, rau đóng hộp Trong y dược, bacteriocin cịn ứng dụng chế phẩm sinh học để điều trị số bệnh viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hố Ngồi ra, reuterin dẫn xuất reutericyclin ức chế vi khuẩn Gram âm Gram dương, nấm động vật nguyên sinh giun, sán Các diacetyl, acetaldehyde acetoin có tác dụng kìm hãm vi sinh vật có hại nồng độ thấp 2.5.2.2 Phân loại Cho đến có khoảng 200 loại bacteriocin xác định, nhiên việc phân loại bacteriocin chưa xác định rõ ràng vấn đề tranh cãi Các bacteriocin thường phân loại kết hợp với tiêu khác Những tiêu chí họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử chúng cuối trình tự chuỗi amino acid (Desriac et al., 2010) Một cách tổng quát, bacteriocin chia thành lớp: lớp I, lớp II lớp III Lớp I Bacteriocin lớp I hay gọi Lanbiotic peptide nhỏ ( TaiLieuDaiHoc.com ... Đề tài ? ?Phân lập vi khuẩn lactic rau muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi antibio có khả sinh chất kháng khuẩn? ?? thực Nhằm làm tiền đề cho vi? ??c nghiên cứu dịng vi khuẩn lactic có khả kháng khuẩn cao... cứu Phân lập - chủng vi khuẩn có khả sinh chất kháng khuẩn sản phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio khảo sát khả kháng khuẩn chúng 1.3 Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng vi khuẩn. .. khuẩn lactic từ sản phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio khảo sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa chủng phân lập Khảo sát khả sinh chất kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic phân