Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng vi sinh vật gây bội nhiễm mụn trứng cá do sử dụng sản phẩm chứa corticoid tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mãngành: 9420107 DƯƠNG THỊ BÍCH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT GÂY BỘI NHIỄM MỤN TRỨNG CÁ DO SỬ DỤNG SẢN PHẨM CHỨA CORTICOID Cần Thơ, 2018 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Nguyễn Văn Bá Người hướng dẫn phụ: PGS.TS Huỳnh Văn Bá Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Phòng Bảo Vệ Luận Án Tiến Sĩ, Lầu – Nhà Điều Hành, Trường Đại Học Cần Thơ Vào lúc 14 00 ngày 12 tháng năm 2018 Phản biện 1: TS Mai Nguyệt Thu Hồng Phản biện 2: PGS.TS Dương Xn Chữ Cóthể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ TRÊN TẠP CHÍ Dương Thị Bích, Nguyễn Văn Bá, Huỳnh Văn Bá, 2014 Khảo sát tần suất xuất vi khuẩn Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis bệnh nhân trứng cácó bơi corticoid Tạp chí Y dược lâm sàng 108, (5): 65-70 Dương Thị Bích, Nguyễn Văn Bá, Huỳnh Văn Bá, 2015 Phân lập vàtuyển chọn vi khuẩn lactic có khả ức chế Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis bệnh nhân trứng cá có bôi corticoid Y học Việt Nam, 427 (1): 41-45 Dương Thị Bích, Nguyễn Văn Bá, Huỳnh Văn Bá, 2016 Khả ức chế vi khuẩn gây bệnh trứng cácủa vi khuẩn lactic phân lập từ da Y học Việt Nam, 448 (1): 23-27 Nguyen Kim Đong, Duong Thi Bich, Nguyen Chi Toan, 2017 The Estimation method of S-acid lactic the fermentation products Aloe vera gel by High-Performance Liquid Chromatography Jounal of Natrura Science, 126 (1B/2017) Chương GIỚI THIỆU Tí nh cấp thiết đề tài Mụn trứng cá(MTC) làbệnh viêm nang lông tuyến bãphổ biến da, đặc trưng vùng da tăng tiết bã nhờn mặt, lưng ngực Theo nhiều nghiên cứu nguyên nhân gây mụn liên quan đến bốn yếu tố chí nh gồm: tăng sản xuất chất nhờn, tắc nghẽn lỗ chân lông, phát triển quámức vi khuẩn Propionibacterium acnes (P acnes) vàsự diện yếu tố viêm Bên cạnh đó, vấn đề sử dụng mỹ phẩm không phù hợp, đặc biệt làmỹ phẩm chứa corticoid để lại nhiều ảnh hưởng làm trầm trọng MTC, teo da, suy giảm collagen vàgia tăng bội nhiễm vi sinh vật Hiện nay, vấn đề điều trị MTC áp dụng nhiều phương pháp sử dụng kháng sinh, nội tiết vàretinoid hay liệu pháp ánh sáng xanh Tuy nhiên, biện pháp hạn chế gia tăng kháng thuốc vi sinh vật gây bội nhiễm MTC để lại nhiều tác dụng phụ cho người sử dụng Từ đó, yêu cầu biện pháp ức chế bùng phát vi sinh vật gây bội nhiễm cần thiết quản lý điều trị MTC Mục tiêu đề tài Tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic (LAB) cókhả ức chế vi sinh vật gây bội nhiễm phổ biến MTC có sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid, định hướng đưa phương pháp chăm sóc da MTC theo hướng cạnh tranh sinh học Nội dung nghiên cứu (1) Khảo sát tần suất xuất vi sinh vật bội nhiễm phổ biến (P acnes, Staphyloccocus aureus (S.aureus), Staphyloccus epidermidis (S epidermidis), Demodex) da MTC có sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid (gọi tắt corticoid bôi); (2) Khảo sát đề kháng kháng sinh nhóm vi khuẩn bội nhiễm phổ biến MTC dùng sản phẩm bôi chứa corticoid vàtuyển chọn vi khuẩn thị (VKCT); (3) Phân lập tuyển chọn dòng LAB cókhả ức chế VKCT; (4) Khảo sát số hoạt tính sinh học có khả ứng dụng chăm sóc da dòng LAB chọn; (5) Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm sóc da Những đóng góp đề tài - Xác định nhóm vi khuẩn gây bội nhiễm phổ biến MTC sử dụng corticoid bôi đánh giáthực trạng kháng thuốc kháng sinh - Tìm dòng LAB có khả ức chế nhóm vi khuẩn bội nhiễm phổ biến MTC dùng corticoid bơi, đồng thời có khả chăm sóc da cách sản sinh hợp chất chống oxy hóa vàgiữ ẩm - Bước đầu xây dựng công thức lên men chế phẩm LAB chăm sóc da MTC từ gel Nha đam Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan mụn trứng cá MTC làbệnh viêm da mãn tính, phổ biến lứa tuổi thiếu niên với biểu lâm sàng: mụn đầu trắng, đầu đen, mụn mủ, nốt, nang (Bộ Y tế, 2015) Sinh bệnh học MTC thường liên quan đến yếu tố nội sinh, ngoại sinh rõ liên quan đến bốn yếu tố: Tăng sản xuất chất nhờn, tắc nghẽn lỗ chân lông, phát triển mức P acnes phản ứng viêm (Tahir, 2010) 2.2 Vi sinh vật gây bội nhiễm MTC Theo nhiều nghiên cứu nhóm vi sinh vật gây bội nhiễm MTC cho thấy, tỷ lệ P acnes MTC chiếm 32%, S aureus là45%, S epidermidis là49% vàtỷ lệ nhiễm ký sinh trùng Demodex trường hợp MTC lạm dụng corticoid bôi tăng lên 75,5% (Dolenc-Voljc et al., 2005; Dhillon and Varshney, 2013) Vi khuẩn P acnes vi khuẩn thuộc hệ vi sinh vật tự nhiên da, chiếm khoảng 105106 tế bào/cm2 vùng có nhiều bãnhờn mặt, lưng, ngực vàkhoảng 102 tế bào/cm2 vùng khác thể P acnes cókhả sản xuất enzym liên quan đến pháhủy tế bào ký chủ như: hyaluronan, sialidase, neuraminidase, lipase vàcókhả thu hút đại thực bào tế bào gai kích thích mạnh mẽ phản ứng viêm (Bruăggemann, 2010) Vi khun S aureus l nhúm vi khun da niêm mạc, phát triển nhiều tay, ngực, bụng mũi Khoảng 10-35% người khỏe mạnh mang S aureus thường xuyên, 20-75% nhiễm không liên tục S aureus gây bệnh sản xuất enzym staphylokinase vàprotein A làm vơ hiệu hóa vị tríhoạt động C3b, C1q IgG vàcókhả bất hoạt số bổ thể tránh truy bắt bạch cầu S aureus gây bệnh với biểu lâm sàng dạng mụn mủ, áp se, bong vảy da S epidermidis làthành viên hệ vi sinh vật da có khả ức chế phản ứng viêm thông qua hoạt động acid lipoteichoic (LTA) Trên MTC, S epidermidis xem lànhân tố nhiễm trùng hội, diện với tỷ lệ từ 6,8-49% đứng sau P acnes 52,7-91,6% (Dhillon and Varshney, 2013) Cơ chế gây bệnh S epidermidis nhờ khả tạo exopolysaccharid hình thành màng sinh học ức chế công đại thực bào vàcác yếu tố chống nhiễm khuẩn ký chủ, giảm tốc độ tăng trưởng đột biến gen kháng lại thuốc kháng sinh, sản xuất chất ngoại bào acid poly-γ-glutamic, PNAG/PIA vàPSMs bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi chế miễn dịch bẩm sinh kýchủ Ký sinh trùng Demodex loại ve ký sinh có kích thước nhỏ nhóm động vật chân đốt, ký sinh chủ yếu nang lơng vị trígần mũi, lơng mày, đầu, mímắt nơi tập trung nhiều tuyến nhờn gây bệnh diện với mật số cao Cơ chế gây bệnh Demodex làm tổn thương nang lông, tắc nghẽn lỗ chân lông gây viêm tạo hội cho yếu tố gây bệnh khác xâm nhập P acnes S aureus (Tchernev, 2011) Một số biểu lâm sàng Demodex khô nang lông, ngứa, đỏ, da sần sùi, mụn mủ 2.3 Ảnh hưởng corticoid MTC Corticoid cótên đầy đủ corticosteroid làhợp chất có hoạt tí nh sinh học giống hormon steroid tiết từ vỏ thượng thận có tác dụng chống viêm, chống dị ứng Tuy nhiên, việc lạm dụng corticoid đặc biệt làdạng bơi ngồi da mang lại nhiều tác dụng phụ như: teo da, mỏng da, ửng đỏ rạn da, giãn mạch, suy yếu collagen, teo da, sắc tố, làm trầm trọng MTC, da dễ tổn thương tạo hội cho nhiều vi sinh vật bội nhiễm S aureus, P acnes vàkýsinh trùng Demodex (Klein et al., 2001) 2.4 Sơ lược vi khuẩn lactic vànhững ứng dụng chăm sóc da Thuật ngữ vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria – LAB) dùng để nhóm vi khuẩn có khả lên men chất bột đường tạo thành acid lactic LAB có đặc điểm chung như: Gram dương; không sinh bào tử; kỵ khítùy tiện hay vi hiếu khí; tế bào cóhình que cầu; âm tí nh với catalase, oxidase vàgelatinase LAB thường kết hợp với môi trường sống giàu chất dinh dưỡng, chẳng hạn phát triển nhiều loại thực phẩm (sữa, thịt, rau), số thành viên hệ vi sinh vật miệng, ruột âm đạo động vật có vú Trong qtrình trao đổi chất, LAB cókhả ức chế vi sinh vật khác đường cạnh tranh dinh dưỡng sản sinh sản phẩm như: acid lactic; acid acetic; peroxid hydrogen; carbon dioxid; bacteriocin; diacetyl; LAB xem vi khuẩn có lợi ứng dụng phổ biến lĩnh vực chăn nuôi, thủy sản, chế biến thực phẩm qua nhiều thời kỳ lịch sử Thời gian gần đây, LAB ứng dụng rộng rãi y học như: phòng chống tiêu chảy, cải thiện dung nạp lactose, kí ch thí ch miễn dịch, phòng chống dị ứng, giảm tỷ lệ mắc ung thư ruột kết, cải thiện bệnh có liên quan đến tim mạch,… Ngồi ứng dụng trên, LAB ứng dụng để chăm sóc bảo vệ da thơng qua đặc tí nh kí ch thí ch miễn dịch, ức chế vi khuẩn gây bội nhiễm da, giảm hì nh thành melanin, chống lão hóa da, tăng tính đàn hồi giữ ẩm cho da (Chen et al., 2006; Tsai et al., 2013) 2.5 Sơ lược Nha đam ứng dụng mỹ phẩm Nha đam lâu năm phát triển khắp vùng ôn đới vànhiệt đới Gel từ thịt láNha đam cóchứa 99% nước hợp chất hữu khác gồm: phenolic như: emodin aloe, aloin, aloesin; acid hữu như: saponin terpenoid; polysaccharid như: arabinan, acid glucuronic, galactan, nhiều khoáng, acid amin, vitamin Với thành phần này, gel Nha đam dùng giữ ẩm, làm chậm qtrình lão hóa da, làm mát kháng khuẩn, chống nấm nên điều trị bệnh nhiễm trùng da thể nhẹ như: mụn nhọt, u nang da lành tí nh, giảm viêm (Nandal and Bhardway, 2012; Sanghi, 2015) Vìthế, Nha đam ứng dụng phổ biến ngành công nghiệp mỹ phẩm Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Khảo sát tần suất xuất P acnes, S aureus, S epidermidis, Demodex da MTC có sử dụng sản phẩm bơi chứa corticoid Mục đích xác định tác nhân bội nhiễm phổ biến MTC có sử dụng corticoid phục vụ nội dung nghiên cứu Thời gian khảo sát từ tháng 3/2013 đến 10/2014 Thông qua vấn thu thập thông tin bệnh nhân mụn trứng cá vàlấy mẫu bệnh phẩm xét nghiệm vi sinh vật (phân lập vi khuẩn soi tươi Demodex) Kiểm tra corticoid sản phẩm bôi da phương pháp sắc ký mỏng với chất chuẩn dexamethason acetat phương pháp hóa học 3.2 Khảo sát đề kháng kháng sinh nhóm vi khuẩn gây bội nhiễm phổ biến MTC dùng sản phẩm bôi chứa corticoid tuyển chọn vi khuẩn làm thị Thực kháng sinh đồ kỹ thuật khuếch tán đĩa thạch Kirby-Bauer với loại kháng sinh gồm: trimethoprim/sulfamethoxazol, climdamycin, doxycyclin, erythromycin, oxacillin vàtetracyclin vàchọn đại diện dòng vi khuẩn đại diện để làm VKCT 3.3 Phân lập tuyển chọn dòng LAB có khả ức chế vi khuẩn thị a) Phân lập LAB Các mẫu nước vo gạo, nước bột, nước tàu hũ thu để lên men 1-2 ngày mẫu vi sinh vật từ da, phân lập mơi trường MRS bổ sung 1% CaCO3 Các dòng phân lập kiểm tra hình thái sinh hóa thử nghiệm nhuộm Gram, thử nghiệm catalase, oxydase, gelatinase chuẩn bị thínghiệm sau b) Khảo sát khả ức chế VKCT 1) Phương pháp khuếch tán giếng thạch cócải tiến Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch (well diffusion agar) có cải tiến thay dịch ly tâm loại bỏ vi khuẩn huyền phù vi khuẩn Khả ức chế VKCT xác định cách đo khoảng cách vùng vơ khuẩn, khơng tính đường kính giếng 2) Phương pháp chủng LAB chọn vào dịch ni cóVKCT Chủng mL dòng LAB với mật số 2-2,5x105 CFU/mL vào 20 mL môi trường TSB bổ sung dịch trí ch tim cóVKCT với mật số tế bào là2-2,5x10 CFU/mL Kết xác định đếm mật số vi khuẩn thời điểm 2, 6, 12, 24, 30 phương pháp đếm khuẩn lạc theo cơng thức Trong đó: N = Số lượng vi khuẩn cótrong mL dịch ni C = Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa ni = Số đĩa đếm nồng độ pha loãng thứ i di = Hệ số pha loãng thứ i 3.4 Khảo sát số đặc tính sinh học ứng dụng chăm sóc da dòng LAB chọn a Kiểm tra khả sinh bacteriocin Sử dụng phương pháp nhỏ giọt với VKCT: Bacillus coagulans JCM 2257T; Micrococcus leteus NBRC 12708; S aureus ATCC 12600T; Pediococus pentosacus JCM 5885 hiệu cao (HPLC) (trên máy US HPLC-1210 cột RSpak SH-1011) nhiệt độ 75 oC, HClO4 mM làm pha động, tốc độ dòng chảy 0,6 mL/phút vàthể tích mẫu tiêm vào mL Lượng acid lactic xác định cảm ứng BF-5 biosensor (Japan) e Khảo sát khả đề kháng với kháng sinh dùng điều trị mụn Thực kháng sinh đồ kỹ thuật khuếch tán đĩa thạch Kirby-Bauer với loại kháng sinh gồm: trimethoprim/sulfamethoxazol, erythromycin, tetracyclin, clindamycin, doxycyclin 3.5 Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm sóc da 3.5.1 Khảo sát mơi trường điều kiện ni sinh khối LAB Mục đích thínghiệm tìm môi trường cải tiến giá thành rẻ để nuôi sinh khối LAB cung cấp cho thí nghiệm lên men Nha đam làm chế phẩm, gồm thí nghiệm a Khảo sát thời gian tăng trưởng: Vi khuẩn nuôi môi trường MRS lỏng, đếm mật số vi khuẩn sau 2, 6, 12, 24, 30 b Khảo sát khả sử dụng nguồn carbon: LAB cấy môi trường TSA có bổ sung 20% loại đường: glucose, lactose, saccarose, tinh bột Quan sát phát triển vi khuẩn sau 24 c Khảo sát thành phần môi trường điều kiện nuôi sinh khối 1) Khảo sát khả sử dụng đường Thínghiệm thiết kế theo Bảng 3-1 Bảng 3.1: Thành phần môi trường (MT) nuôi LAB Thành phần Nước tàu hũ (%) Glucose (%) Sacarose (%) Lactose (%) KH2PO4 (%) (NH4)SO4 (%) MT 100 20 0 2 MT 100 20 2 MT 100 0 20 2 Thínghiệm bố trígồm nghiệm thức, nhân tố và3 lần lặp lại, đối chứng môi trường nuôi MRS Chỉ tiêu khảo sát làsinh khối vi khuẩn sau 24 2) Khảo sát tỷ lệ thành phần mơi trường Thiết kế thínghiệm theo Bảng 3.2 Bảng 3.2: Tỷ lệ thành phần môi trường nuôi LAB Thành phần Nước tàu hũ (%) Carbohydrat (%) KH2PO4 (%) (NH4)SO4 (%) Mức Mức Mức 100 15 1,5 1,5 100 20 2 100 25 2,5 2,5 Biến thiên 0,5 0,5 Thínghiệm bố trígồm nhân tố, mức độ và2 lần lặp lại Chỉ tiêu khảo sát làsinh khối vi khuẩn sau 24 3) Thínghiệm khảo sát điều kiện ni Thiết kế thínghiệm gồm nhân tố: nhiệt độ vàpH, khảo sát mức độ với lần lặp lại (Bảng 3.3) Chỉ tiêu khảo sát: sinh khối vi khuẩn sau 24 Bảng 3.3: Điều kiện nuôi LAB Nhiệt độ (oC) 30 37 45 pH 6,5 3 5,5 3 10 3 3.5.2 Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm sóc da a Khảo sát tỷ lệ thành phần nguyên liệu Thành phần lên men gồm: gel Nha đam FOB, sữa đặc có đường vinamilk vàLAB Thínghiệm khảo sát gồm nhân tố, mức độ, lần lặp lại, bố tríở nhiệt phòng (25-30 oC) (Bảng 3.4) Chỉ tiêu theo dõi: pH, mật số LAB, độ nhiễm khuẩn cảm quan (mùi, màu sắc, trạng thái sản phẩm) Bảng 3.4: Tỷ lệ thành phần chế phẩm Thành phần Nước bổ sung (%) Gel Nha đam (%) Sữa đặc (%) Vi khuẩn LAB (% pH Mức 25 50 1 6±0,5 Mức 50 30 2 6±0,5 Mức 75 20 3 6±0,5 b Khảo sát thời gian vànhiệt độ tồn trữ Khảo sát điều kiện tồn trữ gồm nhiệt độ vàthời gian Nhiệt độ khảo sát mức độ là15 oC, 25 oC và30 o C, lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi: pH, mật số LAB, độ nhiễm khuẩn, cảm quan Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát tần suất xuất P acnes, S aureus, S epidermidis, Demodex da MTC dùng corticoid bôi Qua thời gian khảo sát từ tháng 3/2013 đến tháng 10/2014 Bệnh viện Da Liễu Cần Thơ, với tổng số bệnh nhân tì nh nguyện tham gia là148 người Kết cho thấy bệnh phổ biến lứa tuổi từ 19-25 chiếm 45,9% MTC dùng corticoid bôi chiếm tỷ lệ cao sản phẩm khác (corticoid bôi 53,4%, sản phẩm khác 39,9%) sử dụng với mục đích trị mụn, làm trắng da có hiệu nhanh Tỷ lệ nhiễm P acnes MTC dùng corticoid bôi 56,8%, S epidermidis là89,9%, S aureus là60,8% vàtỷ 11 lệ Demodex thấp chiếm 8,9% Nhóm vi khuẩn bội nhiễm phổ biến MTC dùng corticoid bôi gồm vi khuẩn S epidermidis, P acnes S aureus chiếm tỷ lệ cao 45,6% (P1 Dương cầu que ngắn que dài âm tính âm tính Dương Số dòng vi khuẩn 55 22 Tỷ lệ (%) 82 75 15 53 14 82 25 18 39 82 82 82 6,1 100 91,14 18,29 64,63 17,08 100 30,48 21,95 47,56 100 100 100 67,0 26,9 Bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch khảo sát khả ức chế VKCT 82 dòng LAB phân lập, có25 dòng thể khả ức chế VKCT (Bảng 4.2.) Bảng 4.2: Tỷ lệ dòng LAB ức chế VKCT Vi khuẩn lactic VKCT n Tỷ lệ (%) P acnes 46Pa 25 44,64 S.aureus 10Sa 12 21,48 S epidermidis 09Se 14,28 13 Qua khảo sát đãchọn dòng 05SL3 phân lập từ da người không bị MTC thể khả ức chế dòng VKCT với khoảng vơkhuẩn cm S aureus 10Sa, S epidermidis 09Se 18 cm P acnes 46Pa (Hì nh 4.2) a b c Hình 4.2: Khả ức chế VKCT dòng LAB 05SL3 (a: ức chế S aureus 10Sa; b: ức chế S epidermidis 09Se; c ức chế P acnes 46Pa) Khảo sát khẳng định khả ức chế vi khuẩn tham gia sinh mụn LAB 05SL3 phương pháp chủng LAB 05SL3 vào dịch nuôi VKCT Kết thấy L plantarum 05SL3 làm giảm 48,6% mật số S aureus 10Sa, 47,3% mật số S epidermidis 09Se và60,2% mật số P acnes 46Pa so với đối chứng thời điểm 30 sau chủng (P