Phân lập một số hợp chất taxoid từ lá thông đỏ lá dài (taxus wallichiana zucc ) trồng ở lâm đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu tt

B GIÁO D C VÀ ÀO T O IH CYD C THÀNH PH B YT H CHệ MINH H A HOÀNG OANH PHÂN L P M T S H P CH T TAXOID T LÁ THỌNG LÁ DÀI (TAXUS WALLICHIANA ZUCC.) TR NG LÂM NG, NH H NG THI T L P CH T I CHI U Ngành: Ki m nghi m thu c Mã s : 62720410 TịM T T LU N ÁN TI N S D TP H Chí Minh, n m 2020 CH C Cơng trình đ ih cYD Ng ih c hồn thành t i: c Thành ph H Chí Minh ng d n khoa h c: PGS TS Nguy n Ph ng Dung Ph n bi n 1: ……………………………………………… Ph n bi n ……………………………………………… Ph n bi n 3: ……………………………………………… Lu n án s đ c b o v tr c H i đ ng ch m lu n án c p tr ng h p t i i h c Y D c Thành ph H Chí Minh vào h i gi ngày tháng n m Có th tìm hi u Lu n án t i th vi n: - Th vi n Qu c gia Vi t Nam - Th vi n Khoa h c T ng h p TP HCM - Th vi n ih cYD c TP HCM GI I THI U LU N ÁN tv nđ Theo nhà khoa h c, lồi Thơng đ (Taxus sp.) có ch a taxoid nhóm h p ch t y u g m c paclitaxel, 10deacetyl baccatin III (10-DAB, ti n ch t t ng h p paclitaxel) đ s n xu t Taxol® d n xu t taxoid khác (docetaxel) làm thu c ch a tr ung th nh : Ung th bu ng tr ng, ung th vú, ung th ph i, v.v Do có giá tr kinh t cao nên Thông đ b l m d ng khai thác, đ c bi t vùng Himalaya Trung Qu c, ngu n d c li u thiên nhiên tr nên khan hi m b đe d a t ch ng Vi t Nam, Trung tâm tr ng ch bi n thu c L t tr ng Thông đ dài (Taxus wallichiana Zucc.) nh m cung c p nguyên li u ph c v cho chi t tách taxol h p ch t taxoid s n xu t thu c u tr ung th Vì th , đ tài: “Phân l p m t s h p ch t taxoid t Thông đ dài (Taxus wallichiana Zucc.) tr ng Lâm ng, đ nh h ng thi t l p ch t đ i chi u” đ c th c hi n v i m c tiêu sau: Chi t xu t, phân l p xác đ nh c u trúc m t s h p ch t taxoid t Thông đ dài tr ng Lâm ng Thi t l p m t s ch t đ i chi u đ c phân l p t Thông đ Xây d ng th m đ nh quy trình đ nh l m t s taxoid phân l p đ ng đ ng th i taxol c t Thơng đ Tính c p thi t c a đ tƠi Theo yêu c u GMP c a WHO s n xu t, vi c đánh giá ch t l ng thu c ch ph m ph i d a vào hàm l ng ho t ch t (ho c ch t đánh d u sinh h c) Ngoài ra, l nh v c khác nh tr ng tr t, nghiên c u thông đ c ng c n theo dõi, đánh giá ch t l ng m u nghiên c u đánh giá đ c ch t l ng thông đ tr ng Lâm ng ch ph m c n ph i có ch t chu n bao g m taxoid ch y u: Taxol, 10-deacetyl baccatin III (10-DAB), v.v m t s t p ch t chu n đ c tr ng cho thông đ Vi t Nam Hi n nay, nhà khoa h c Vi t Nam thành công vi c chi t xu t, phân l pđ c m t s h p ch t taxoid Vì v y, vi c chi t xu t, phân l p, u ch h p ch t taxoid chu n đ ki m đ nh nghiên c u thông đ Vi t Nam h t s c c p thi t, có ý ngh a khoa h c, th c t kinh t Các h p ch t taxoid chu n đ c tr ng cho thơng đ Vi t Nam cịn có th ng d ng đ ki m đ nh ch t l thông đ khác th tr ng n ch t chu n dùng cho ki m nghi m taxol d ng c a lo i c Trong c d ng theo D c n M có giá thành r t cao Nh ng đóng góp m i c a lu n án V m t hóa h c: L n đ u tiên công b vi c phân l p đ c h p ch t taxoid Taxus wallichiana Zucc g m có: - Taxuspin D - Taxchinin B V m t thi t l p ch t đ i chi u: L n đ u tiên công b nghiên c u thi t l p ch t đ i chi u: Taxinin B; 10-.deacetyl taxinin B; taxuspin D, taxuspin F V m t ki m nghi m thu c: L n đ u tiên công b ph ng pháp RP-HPLC-PDA xác đ nh đ ng th i paclitaxel h p ch t taxoid: Taxinin B; 10-.deacetyl taxinin B; taxuspin D, taxuspin F B c c c a lu n án Lu n án g m: 131 trang, đ t v n đ trang, t ng quan 29 trang, đ i t ng ph ng pháp nghiên c u 13 trang, k t qu 60 trang, bàn lu n 20 trang, k t lu n trang ki n ngh trang Lu n án có 37 b ng, 72 hình, s đ , 120 tài li u tham kh o (14 ti ng Vi t, 106 ti ng Anh), ph l c N I DUNG LU N ÁN Ch ng 1: T NG QUAN Trình bày nh ng v n đ sau: 1.1 Gi i thi u t ng quan v Thông đ dài (T wallichiana) 1.2 Thành ph n hóa h c Thông đ 1.3 Tác d ng d c lý c a Thông đ 1.4 Các nghiên c u chi t xu t, phân l p h p ch t taxoid t Thông đ Ch ng 2: 2.1 it IT NG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U ng nghiên c u Các h p ch t taxoid 2.2 Nguyên v t li u • Lá Thông đ thu hái Lâm ng Trung tâm tr ng ch bi n thu c L t-Vimedimex cung c p 2.3 Ph ng pháp nghiên c u 2.3.1 Ngun li u - Dung mơi, hóa ch t - Trang thi t b - Dung mơi, hóa ch t s d ng lo i k thu t dùng cho chi t xu t, lo i phân tích s c ký (Merck JT Baker) dùng cho k thu t SKLM, UV-Vis, IR, NMR, HPLC, … - Thi t b chi t xu t phân tích t i Khoa D c- ih cYD c TP.HCM, Vi n Hàn lâm Khoa h c Công ngh Vi t Nam, Vi n Ki m nghi m thu c TP.HCM 2.3.2 Ph ng pháp nghiên c u 2.3.2.1 Chi t tách h p ch t taxoid t Thông đ dài Kh o sát s b thành ph n hóa h c Thơng đ dài Phân tích s b theo quy trình phân tích c a I Ciuley đ b i B môn D c li u, Khoa D c, ih cYD c c i ti n c TP HCM Chi t xu t taxoid (diterpen) Ph ng pháp dùng dung môi h u c thay đ i đ phân c c Chi t cao toàn ph n b ng ph ng pháp ngâm l nh v i methanol Lo i t p d u béo d a vào đ phân c c: - Chi t l ng - l ng d ch chi t MeOH/n c v i dicloromethan - S c ký c t diaion HP-20, r a gi i l n l t v i dung môi: N c, MeOH 20%, MeOH 40%, MeOH 60%, MeOH 80%, MeOH 100% Phân l p taxoid S d ng ph ng pháp: - S c ký c t c n (v i silica gel 0,040-0,063 mm) đ tách phân đo n nh t p trung h p ch t taxoid, h p ch t taxoid k t tinh thô - S c ký c t áp su t trung bình (MPLC) tách h p ch t taxoid phân đo n nh thu đ c sau tri n khai s c ký c t c n Tinh ch S ph d ng ph ng pháp k t tinh l i dung môi thích h p ng pháp s c ký l ng u ch Xác đ nh c u trúc hóa h c Xác đ nh c u trúc b ng ph ng pháp ph nghi m: UV-Vis, IR, MS, NMR ( H-NMR, C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC), đ i chi u 13 v i d li u ph c a taxoid công b 2.3.2.2 Thi t l p ch t đ i chi u Chi t xu t, phân l p, tinh ch Ch t đ i chi u taxoid phân l p t Thông đ dài b ng k thu t s c ký c t c n, s c ký c t trung áp, k t tinh l i, s c ký l ng u ch đ đ t đ tinh t cao nh t nh tính i chi u ph UV-Vis; IR; MS; NMR c a ch t nghiên c u v i d li u ph t tài li u tham kh o ánh giá nguyên li u thi t l p ch t đ i chi u i m ch y: Ph ng pháp theo D VN V ánh giá đ tinh t: Ph đ nh ph ng pháp: Theo h ng pháp SKLM, HPLC-PDA Th m ng d n c a ICH ánh giá đ ng nh t lơ q trình đóng gói ch t đ i chi u L y m u: S d ng cách l y m u ng u nhiên theo ph n m m Excel, s l đ c l y đ ki m tra g = N +1 l , N s l đóng đ c ng pháp HPLC-PDA xây Xác đ nh đ tinh t: Áp d ng ph d ng th m đ nh theo ICH ánh giá đ đ ng nh t gi a l : ánh giá b ng k thu t th ng kê ANOVA m t y u t Các l đ ng nh t Ftn < Ftc (P = 0,05) ánh giá ch t đ i chi u thơng qua liên phịng thí nghi m Ti n hành xác đ nh đ tinh t t i ba phịng thí nghi m đ c l p đ t tiêu chu n GLP ho c ISO/IEC17025 ánh giá k t qu b ng k thu t th ng kê ANOVA m t y u t , so sánh giá tr Ftn Ftc Xác đ nh giá tr n đ nh đ không đ m b o đo Xác đ nh giá tr n đ nh đ không đ m b o đo theo ISO 13528 nh l ng Do khơng có ch t chu n nên hàm l (theo h ng % tính nguyên tr ng ng d n c a WHO) 2.3.2.3 Xây d ng th m đ nh quy trình đ nh l taxoid b ng ph Kh o sát ch n ch ng đ ng th i ng pháp HPLC ng trình dung môi: Thay đ i t l pha đ ng, ch n u ki n đ pic đ t đ phân gi i t i thi u 1,5 Kh o sát ch n quy trình phân tích: Th nghi m ch ng trình gradient đ ng dịng Kh o sát b c sóng phát hi n: G n v i c c đ i h p thu c a ch t Kh o sát t c đ dòng: Tri n khai m u th v i t c đ dòng t ng d n t 0,8 ml/phút; ml/phút; 1,2 ml/phút đ l a ch n đ ct cđ dòng phù h p Th m đ nh quy trình - Tính phù h p c a h th ng Yêu c u: H s đ i x ng c a pic 0,8  As  1,5; %RSD di n tích pic  2,0; s đ a lý thuy t ≥ 2000 - Tính đ c hi u: S c ký đ pha đ ng dung môi pha m u không xu t hi n tín hi u trùng v i th i gian l u c a ch t c n phân tích m u th m u đ i chi u tinh t c a pic ch t c n phân tích s c ký đ m u th : > 0,99 phân gi i gi a pic ch t c n phân pic li n k s c ký đ m u th : ≥ 1,5 - Tính n tính: r > 0,995 xác: + l p l i: %RSD ≤ 3,0 + xác trung gian: K t qu gi a ki m nghi m viên khác bi t khơng có ý ngh a th ng kê: F test (P = 0,05) - đúng: T l ph c h i 98% - 102%; %RSD ≤ 2,0 - Gi i h n phát hi n gi i h n đ nh l LOD Ch ng: LOQ ng 3: K T QU NGHIÊN C U 3.1 Chi t xu t, phơn l p taxoid thông đ dƠi 3.1.1 Kh o sát s b thành ph n hóa h c B ng 3.1 K t qu đ nh tính thành ph n hóa h c d ch chi t 3.1.1.2 Chi t taxoid thô b ng ph dung môi ng pháp thay đ i đ phân c c 3.1.2 Phân l p h p ch t taxoid t Thông đ dài 3.1.2.1 Phân l p b ng ph ng pháp s c ký c t c n (SKC) s c ký c t áp su t trung bình (MPLC) S đ phân l p h p ch t taxoid b ng SKC c n MPLC S đ phân l p h p ch t taxoid b ng SKC c n 11 3.2 Thi t l p ch t đ i chi u Chi t xu t, phân l p tinh ch đ thu đ tinh t Xây d ng tiêu chu n ch t l tiêu, ph ng pháp th theo h ng, ch ng c a taxinin B (C C) Ch tiêu M c ch t l C m quan nh tính Ph UV-Vis Ph IR Ph kh i MS Ph NMR K t tinh d ng b t, màu tr ng ng Ph i có c c đ i h p thu 217 279 nm Ph i có đ nh có s sóng: 1667, 1636, 1128 1041 cm-1 Ph i có pic có m/z 664 [M]+ (pic c n b n) H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 1,15 (s); 1,77 (s); 2,38 (s); 1,03 (s); 6,45 (d); 7,69 (d); 7,47 (m); 7,78 (d); 7,44 (m); 2,08 (s) x 4; 5,63 (dd); 5,39 (t); 5,45 (dd); 5,94 (d); 6,25 (d); 1,77 (m); 2,39 (d); 2,85 (dd); 2,25 (d); 3,33 (d); 4,92 (s); 5,45 (s) 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 199,3; 169,3; 169,7; 169,2; 150,5; 138,6; 68,6; 76,2; 69,6; 75,0 72,8 203-205 oC Khơng h n 95,0% B ng 3.2 Tóm t t tiêu chu n ch t l ng c a taxuspin F (C C) Ch tiêu M c ch t l C m quan nh tính K t tinh d ng b t, màu tr ng Ph UV-Vis Ph IR Ph kh i l ng ng v i m c ch t l ng d n c a WHO ASEAN B ng 3.1 Tóm t t tiêu chu n ch t l i m ch y nh l ng c ch t đ i chi u (C C) ng Ph i có c c đ i h p thu 267 nm Ph i có đ nh có s sóng: 3450, 1747 1679, 1199 cm-1 Ph i có pic có m/z 534 [M]+ 12 Ph NMR i m ch y nh l ng H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 1,74 (s); 1,11 (s); 2,33 (s); 0,98 (s); 2,02 (s); 2,05 (s) x 2; 2,08 (s); 5,60 (dd); 4,22 (d); 5,50 (dd); 5,90 (d); 6,26 (d); 1,61 (m); 1,94 (m); 2,33 (d); 2,77 (dd); 2,20 (d); 3,53 (d); 4,81 (s) 5,23 (s) 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 199,4; 169,2; 169,3; 169,7; 169,8; 115,5; 139,2; 144,7 149,8 242-244 oC Khơng h n 95,0% B ng 3.3 Tóm t t tiêu chu n ch t l ng c a 10-deacetyl taxinin B (C C) Ch tiêu M c ch t l ng C m quan nh tính Tinh th hình kim, màu tr ng Ph UV-Vis Ph IR Ph kh i l ng Ph i có c c đ i h p thu 274 nm Ph i có đ nh có s sóng: 3450, 1665, 1639, 1128 1041 cm-1 Ph i có pic có m/z 622 [M]+ Ph NMR H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 1,23 (s); 1,80 (s); 2,24 (s); 1,02 (s); 2,08 (s) x 3; 5,60 (d); 5,35 (s); 5,38 (m); 5,83 (d); 5,30 (d); 1,76 (m); 2,08 (m); 2,38 (d); 2,86 (dd); 2,23 (d); 3,32 (d); 4,90 (s); 5,42 (s); 6,44 (d); 7,69 (d); 7,44 (m); 7,78 (d); 7,42 (m); 2,08 (m) 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 199,3; 169,3; 169,7 (x 2); 150,5 138,6 i m ch y nh l ng (x 2); 134,5; 129,0 (x 2); 128,6 (x 2); 130,5 118,8 239-241 oC Khơng h n 95,0% 13 B ng 3.4 Tóm t t tiêu chu n ch t l Ch tiêu M c ch t l C m quan nh tính Ph UV-Vis Ph IR B t m n, màu tr ng Ph kh i l Ph NMR i m ch y nh l ng ng c a taxuspin D (C C) ng Ph i có c c đ i h p thu 217 278 nm Ph i có đ nh có s sóng: 3450, 1653, 1636, 1131 1038 cm-1 ng Ph i có pic có m/z 724 [M]+ H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 1,49 (s); 1,17 (s); 1,60 (s); 1,53 (s); 1,96 (s); 2,10 (s) x 2; 2,00 (s); 2,02 (s); 2,20 (s); 5,80 (d); 5,34 (dd); 4,85 (m); 4,85 (d); 5,60 (d); 2,07 (m); 2,36 (d); 2,57 (m); 1,89 (d); 3,70 (d); 5,20 (s); 5,08 (s); 6,46 (d); 7,70 (d); 7,54 (m) 7,40 (m) 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 170,6; 170,2; 169,3; 170,4; 168,5; 124,3; 144,2; 110,9; 50,4; 40,8; 142,6; 134,2; 128,1 (x 2); 128,9 (x 2); 68,4; 67,4; 70,4; 76,7; 78,5; 77,3 230-232 oC Khơng h n 95,0% (1) ậ Taxinin B (2) ậ Taxuspin F 14 (3) ậ 10-Deacetyl taxinin B (4) ậ Taxuspin D (5) ậ Taxchinin B Hình 3.1 C u trúc hóa h c c a h p ch t taxoid đ c phân l p 15 3.3 Xây d ng quy trình đ nh l ph ng đ ng th i taxoid b ng ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao 3.3.1 Xây d ng quy trình đ nh l ng đ ng th i paclitaxel taxoid 3.3.1.1 Kh o sát b c sóng phát hi n: D a vào đ nh h p thu c c đ i c a paclitaxel taxoid đ ch n b c sóng phát hi n cho quy trình đ nh l ng: C t Phenomenex C18, µm, 250 x 4,6 mm, 110 Å T c đ dịng: ml/phút Th tích tiêm m u: 10 l Nhi t đ c t: 25 oC Pha đ ng: ACN – H2O (60 : 40) 3.3.1.2 Kh o sát pha đ ng: M u th đ c tri n khai u ki n s c ký v i pha đ ng ACN - H2O có t l l n l t là: 70 : 30; 60 : 40 v i t c đ dòng ml/phút 3.3.1.3 Kh o sát ch ng trình tri n khai gradient Các u ki n: c t Phenomenex C18, µm, 250 x 4,6 mm, 110 Å T c đ dòng: ml/phút Th tích tiêm m u: 10 l Nhi t đ c t: 25 oC Pha đ ng: ACN – H2O v i ch gradient: Th i gian (phút) 0-35 35-60 60-70 70-80 H2O (%) ACN (%) 35 65 35→80 80→35 35 65→20 20→65 65 ng trình tri n khai Ch ng trình tri n khai ng dịng Gradient Gradient ng dòng 3.3.1.4 Kh o sát t c đ dòng Kh o sát theo chi u t ng c a t c đ dòng: 0,8; 1; 1,2 ml/phút v i t l pha đ ng ACN – H2O (60:40) 16 D a vào k t qu kh o sát u ki n nh trên, quy trình đ nh l ng đ ng th i đ c đ ngh nh sau: B ng 3.5 Các u ki n tri n khai quy trình đ nh l i u ki n s c ký ng đ ng th i HPLC Pha t nh C t Phenomenex C18, µm, 250 x 4,6 mm, 110 Å Pha đ ng ACN – H2O (60 : 40) Nhi t đ c t 25 ºC B 227 nm 280 nm c sóng phát hi n T c đ dịng ml/phút Th tích tiêm m u 10 µl 3.3.2 Th m đ nh quy trình Th m đ nh quy trình theo ch tiêu: - Tính phù h p c a h th ng K t qu kh o sát tính phù h p c a h th ng cho th y sau l n s c ký thông s đ u n m gi i h n cho phép, RSD < 2%, As < 1,5; N > 2000 - Tính đ c hi u: Quy trình có tính đ c hi u - Tính n tính: K t qu kh o sát tính n tính cho th y có s t ng quan n tính gi a n ng đ ch t đ i chi u paclitaxel chu n c ng nh ch t th m u di n tích pic t v ih s t - ng ng ng quan r > 0,995 xác đ K t qu th ng kê cho th y quy trình có t l h i ph c n m gi i h n cho phép c a t l h i ph c lý thuy t 90% - 107%; RSD < 17 2% RSD < 2% đ i v i đ l p l i; RSD < 3% đ i v i đ xác trung gian B ng 3.6 K t qu kh o sát tính n tính, gi i h n phát hi n gi i h n đ nh l ng Kho ng n R2 tính (µg/ml) LOD LOQ (µg/ml) (µg/ml) Taxuspin F 25 – 75 0,30 1,00 Paclitaxel 25 – 75 0,9997 0,075 0,25 10-deacetyl 25 – 75 0,9996 0,06 0,20 Taxuspin D 25 – 75 0,9994 0,075 0,25 Taxinin B 25 – 75 0,06 0,20 taxinin B ng d ng Áp d ng quy trình đ nh l ng đ ng th i xây d ng th m đ nh đ phân tích m u th TW đ tr ng Lâm c chi t t thông đ dài ng Ti n hành đ nh l ng m u th thông đ M i m u th ti n hành l n l y giá tr trung bình B ng 3.7 Hàm l STT Tên ch t ng taxoid m u th TW Di n tích pic HƠm (mg/g) Taxuspin F 82021 404,49 Paclitaxel 651359 268,88 10-deacetyl taxinin B 308751 373,90 Taxuspin D 282929 459,40 Taxinin B 394229 431,98 l ng 18 CH NG BÀN LU N 4.1 Chi t xu t, phơn l p, xác đ nh c u trúc vƠ đ nh tính, đ nh l ng taxoid Thơng đ dƠi Lu n án dùng ph ng pháp chi t xu t t Thông đ dài b ng dung mơi h u c có đ phân c c thay đ i nh MeOH, CH2Cl2 đ phân l p đ c h p ch t taxoid Do Thơng đ có nhi u t p nh di p l c t , d u béo nên c n x lý t p b ng thay đ i dung môi, tri n khai qua c t daion HP-20, l c v i ether d u h a tài phân l p xác đ nh đ c c u trúc c a h p ch t taxoid Thông đ dài: Taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D, taxuspin F, taxchinin B ây đ u taxoid có tác d ng d có tri n v ng làm thu c taxchinin B ch a đ c lý c bi t, hai h p ch t taxuspin D c cơng b tìm th y Thơng đ dài (Taxus wallichiana Zucc.) đ nh tính taxoid Thông đ dài tr ng ng, lu n án áp d ng h u h t ph c y cao Nh ng ph Lâm ng pháp ph bi n đ tin ng pháp phân tích đ nh tính đ c s d ng nh : SKLM, HPLC-PDA, ph nghi m (UV, IR, MS, NMR), m ch y c a t ng h p ch t so sánh v i d li u tài li u tham kh o nh l ng taxoid nguyên li u d g p nh ng khó kh n: (1) hàm l Taxus; (2) chi t xu t t d c li u th ng ng taxol r t th p c li u ch a nhi u h p ch t n i sinh khác nhau, (3), c u trúc c a m i taxoid khác r t Vì v y, đ nh l ng taxoid b ng HPLC th ng đ nh phân tách địi h i th i gian phân tích dài Do đó, k thu t khác bao g m SKLM c i ti n, s c ký n di MEKC, n di mao qu n, … c ng đ c nghiên c u 19 Nghiên c u xây d ng ph taxoid b ng ph ng pháp đ nh l ng ng pháp HPLC v i c t C18, đ u dò PDA Do c u trúc tính ch t lý hóa c a taxoid c n phân tích nh ng h p ch t mang tính base h u c có s hi n di n c a nhóm alkanoyl c u trúc đ phân c c t trung bình đ n phân c c có nhóm -OH Do đó, nghiên c u đ nh tính, đ nh l lu n án s d ng k ng taxoid c a thu t HPLC/PDA pha đ o v i c t Phenomenex Gemini RP-C18 (250 x 4,6 mm, đ ng: ACN – H2O M u đ c ch y theo ch m) h pha ng trình đ ng dịng v i th i gian phân tích 40 phút/ m u, th tích tiêm m u 10 l, b c sóng phát hi n: 280 nm 4.2 Thi t l p ch t chu n đ i chi u Các h p ch t taxoid đ c phân l p lu n án: Taxinin B, 10- deacetyl taxinin B, taxuspin D, taxuspin F có hàm l 150g) đ tinh t 95% đ ng cao (h n c ch n đ làm nguyên li u thi t l p ch t đ i chi u Hi n nay, h p ch t c ng ch a th y có nhà s n xu t hay phân ph i ch t chu n đ i chi u nh ChromaDex, Sigma Aldrich, USP, Cerilliant ho c hai Vi n ki m nghi m thu c trung ng TP.HCM cung c p Lu n án xây d ng đ c quy trình chi t xu t, phân l p ch t đ i chi u taxoid Thơng đ có tính n đ nh, hi u qu Các ch t đ b ng ph c phân l p có đ tinh t cao, đ ng pháp ph nghi m phân tích HPLC có giá tr tin c y cao Quy trình đ nh l ph c xác đ nh ng pháp HPLC đ ng taxoid đ c xây d ng b ng c th m đ nh đô đ c hi u, tính phù h p h th ng, đ l p l i, kho ng n tính 20 4.3 Xây d ng quy trình đ nh l Ph ng đ ng th i ng pháp HPLC-PDA D c n M (t USP 30 tr đi) có chuyên lu n paclitaxel, đ c p đ n đ nh l ng taxol t p ch t liên quan Theo USP (hi n l u hành USP 42), đ i v i nguyên li u đ c dán nhãn đ c phân l p t ngu n t nhiên, vi c ki m tra đ tinh t xác đ nh t p ch t liên quan c a paclitaxel đ c ti n hành b ng ph ng pháp HPLC v i u ki n s c ký: C t s c ký L43 (4,6 mm x 25 cm, µm), nhi t đ c t: 30 oC, b c sóng phát hi n: 227 nm, t c đ dịng: 2,6 ml/phút, th tích tiêm m u: 15 µl, h pha đ ng MeOH-ACN tri n khai theo ch ng trình gradient 80 phút/ m u Lu n án xây d ng quy trình đ nh l ng đ ng th i b ng HPLC d a chuyên lu n paclitaxel c a USP 41 tài li u tham kh o USP s d ng c t L43 (c t Pentafluorophenyl) c t chuyên bi t cho taxoid, nhiên giá thành cao so v i u ki n trang b thi t b phịng thí nghi m c a n c u ti n hành xây d ng quy trình đ nh l trình đ nh l c ta Vì vây, nghiên ng c t C18, quy ng đ t ch tiêu th m đ nh v đ đ c hi u, tính n tính, đ xác, đ l p l i, đ K thu t HPLC/PDA nghiên c u gi ng v i nghiên c u công b Tuy nhiên, nghiên c u s d ng pha t nh c t C18, pha đ ng ACN-H2O v i ch gian phân tích d ng trình đ ng dòng, th i i 30 phút/ m u phù h p h n đ tách đ ng th i 05 taxoid (taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D, taxuspin F paclitaxel) Thông đ ây quy trình đ nh tính, đ nh l ng đ ng th i taxoid có Thơng đ dài b ng ph ng pháp HPLC/PDA mà ch a đ c công b b i tài li u Qua kh o sát y u t nh h ng lên kh n ng phân tách gi a pic h dung mơi tri n khai đóng vai trị quan tr ng Quy 21 trình đ nh l ng c a lu n án tri n khai v i h pha đ ng ACN-H2O, không s d ng h đ m có mu i vơ c hay acid đ u ch nh pH giúp b o v c t phân tích, kéo dài tu i th c t rút ng n th i gian v sinh h th ng tr c sau phân tích, có hi u qu v m t kinh t Trong quy trình đ nh l b c sóng phát hi n 280 nm đ đ nh l ng đ ng th i, lu n án s d ng 227 nm đ đ nh l ng paclitaxel b ng taxoid cịn l i ó b c sóng c sóng 227 nm di n tích chi u cao c a paclitaxel xu t hi n rõ nh ng pic l i có s khác khơng rõ r t Cịn đ nh l ng b c sóng 280 nm pic c a taxoid l i xu t hi n rõ nh ng pic c a paclitaxel l i th p Vì v y, lu n án ch n đ u dò PDA v i b sóng phát hi n 227 nm b c sóng 280 nm đ đ nh l c ng đ ng th i paclitaxel v i taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D taxuspin F Ph ng pháp phân tích HPLC đ tài cho phép đ nh tính xác đ nh đ ng th i taxoid T walichiana V i s tr giúp c a d li u ph UV c a taxoid có s n, ph phép xác đ nh nhanh chóng taxoid tr ch t tham chi u t tích th ng pháp cho ng h p thi u ng ng Ph ng pháp c ng phù h p đ phân ng quy taxoid d c li u ho c d ch chi t mà không c n l y m u ph c t p Ph ng pháp phân tích cung c p m t quy trình nhanh chóng, thơng th ng đáng tin c y đ đ nh tính đ nh l th ng đ ng th i m t nhóm taxoid Taxus wallichiana có ng d ng ki m nghi m ngu n nguyên li u ch ph m liên quan đ n d c li u K t qu th m đ nh quy trình đ nh l ng đ ng th i 04 taxoid (taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D taxuspin F) paclitaxel cho th y quy trình có tính đ c hi u cao, R2 > 0,9995 kho ng n ng đ kh o sát đ t yêu c u v đ xác đ 22 K t qu th m đ nh ch ng t r ng qui trình chu n b m u th n đ nh, ch t phân tích h u nh khơng b m t nhi u trình x lý m u i u s giúp nh ng k t qu phân tích áp d ng quy trình có đ xác, đ cao tin c y Tính m i c a đ tài H p ch t taxuspin D taxchinin B l n đ u đ phân l p đ c t Taxus wallichiana Zucc Tuy nhiên, taxoid phân l p nghiên c u đ nghiên c u tr d ng d c công b c lý đ c Các taxoid đ c công b c u trúc c phân l p nh ng ch t có tác c quan tâm: Taxinin B, taxuspin D, taxuspin F taxchinin B C th : H p ch t taxinin B có tác d ng ch ng k t t p ti u c u, taxuspin D taxchinin B có kh n ng ch ng l i s đ kháng thu c kháng ung th , taxuspin F có tác d ng c ch t bào Hela Ngoài ra, h p ch t cịn có th làm ngun li u t ng h p paclitaxel d n xu t t L n đ u tiên thi t l p đ ng đ ng c u trúc khung c b n c h p ch t taxoid làm ch t đ i chi u, nguyên li u c n thi t ki m nghi m d ph n ki m tra, đánh giá ch t l ng c a d c li u, góp c li u ch ph m liên quan ã s d ng ph ng pháp HPLC đ đ nh l paclitaxel 04 lo i taxoid đ c phân l p t T wallichiana không ch l n đ u tiên thi t l p ph l ng đ ng th i tài ng pháp xác đ nh đ ng th i hàm ng taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D, taxuspin F taxol, mà phát hi n r ng c t Phenomenex Gemini RP-C18 có th tách riêng h p ch t v i đ phân gi i cao 23 K T LU N Sau th i gian th c hi n, đ tài: “Phân l p m t s h p ch t taxoid t Thông đ dài (Taxus wallichiana Zucc.) tr ng ng, đ nh h nghiên c u đ Phân l p đ tr ng ng thi t l p ch t đ i chi u” đ t đ Lâm c m c tiêu c đ t ra: c h p ch t taxoid tinh t t Thông đ dài đ Lâm c ng V i ph ng pháp s c ký c t c n, s c ký c t trung áp, s c ký l p m ng, HPLC, HPLC u ch ph ng pháp ph nghi m nh : UV, IR, MS, NMR, lu n án phân l p, tinh ch xác đ nh c u trúc c a m t s h p ch t taxoid Thông đ dài tr ng - Lâm ng: T 75 g phân đo n cao MeOH 100% phân l p đ (1) đ c 425 mg h p ch t c xác đ nh taxinin B 732 mg h p ch t (2) đ c xác đ nh taxuspin F 158 mg h p ch t (3) - 10-deacetyl taxinin B - T 50 g phân đo n cao MeOH 100% phân l p đ c 183 mg h p ch t (4) taxuspin D 105 mg taxchinin B - h p ch t (5) Thi t l p ch t đ i chi u Trong h p ch t đ c phân l p h p ch t đ t tiêu chu n nguyên li u thi t l p ch t đ i chi u: l tinh t > 95% có kh i ng > 150 mg Vì v y, đ tài thi t l p h p ch t taxoid làm ch t đ i chi u: taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D, taxuspin F Quy trình thi t l p ch t đ i chi u theo h ng d n c a ASEAN, m i ch t đ i chi u có thơng tin: d li u ph , m ch y, đ tinh t,… Xây d ng quy trình đ nh l taxoid b ng ph ng đ ng th i paclitaxel h p ch t ng pháp HPLC 24 Xây d ng th m đ nh quy trình đ nh l h p ch t taxoid b ng ph ng đ ng th i paclitaxel ng pháp HPLC v i c t C18, đ u dò PDA, ch đ phân tích đ ng dịng Quy trình đ nh l ng đ t ch tiêu th m đ nh v đ đ c hi u, tính n tính, đ đúng, đ l p l i KI N NGH Các h ng nghiên c u ti p theo c a lu n án đ c đ xu t nh sau: Áp d ng quy trình phân l p, phân tích taxoid xây d ng đ đánh giá ngu n Thông đ khác v tu i, v ngu n g c, v th i m thu hái, … Xây d ng tiêu chu n cho ngu n d tr ng Lâm c li u Thông đ dài ng đ xu t kh u t o ngu n cung nguyên li u bào ch thu c ch a ung th hi n có nhu c u cao Nghiên c u t ng h p paclitaxel d n xu t làm nguyên li u thu c ch a ung th t h p ch t taxoid phân l p lu n án t ng đ ng c u trúc khung c b n đ khai thác t i đa giá tr ti m n ng c a h p ch t t nhiên lo i d c li u quý DANH M C CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN Hua Hoang Oanh, Tran Ngoc Thuy Duong, Bui Thi Bich Tram, Ha Dieu Ly, Bui The Vinh, Tran Cong Luan, Nguyen Duc Tuan (2013), Isolation and identification of two taxoids from the needles of Taxus wallichiana Zucc cultivated in Lam Dong province, Proceeding Pharma Indochina VIII, 917-922 Hua Hoang Oanh, Nguyen Duc Tuan, Ha Dieu Ly, Bui The Vinh, Tran Cong Luan (2013), Establishment of reference standard taxuspine F for quality control of herbal medicinal products from cultivated Taxus wallichiana, Proceeding Pharma Indochina VIII, 328-332 H a Hoàng Oanh, Nguy n Th Nhài, Nguy n Th Trúc Ph ng, Bùi Th Vinh, Tr n Công Lu n, Nguy n Ph ng Dung (2014), Phân l p m t s h p ch t taxoid phân đo n cao methanol 100% t Thông đ dài (Taxus wallichiana Zucc.) tr ng Lâm ng, T p chí Ki m nghi m, s 3A.2014: 139-143 H a Hoàng Oanh, Nguy n Th Nhài, Nguy n Th Trúc Ph ng, Bùi Th Vinh, Tr n Công Lu n, Nguy n Ph ng Dung (2015), Thành ph n hóa h c c a Thông đ dài (Taxus wallichiana Zucc.) tr ng Lâm ng, T p chí Y h c Tp HCM, t p 19, ph b n s 01/2014, 342 - 347 H a Hoàng Oanh, Tr n Ng c B o Trân, Lê ng Kh ng, Hà Di u Ly, Bùi Th Vinh, Tr n Công Lu n, Nguy n Ph ng Dung (2016), Thi t l p m t ch t chu n đ i chi u taxoid t Thông đ dài (Taxus wallichiana Zucc.) tr ng Lâm ng, T p chí Y h c Tp HCM, t p 20, s 06/2016, 45-50 H a Hồng Oanh, Tr n Ng c Trí, Lê ng Kh ng, Hà Di u Ly, Tr n Công Lu n, Nguy n Ph ng Dung (2017), Xây d ng quy trình đ nh l ng đ ng th i m t s h p ch t taxoid, T p chí Y h c Tp HCM, t p 21, s 06/2017, 231-237 ... MHz): 1,23 (s); 1,80 (s); 2,24 (s); 1,02 (s); 2,08 (s) x 3; 5,60 (d); 5,35 (s); 5,38 (m); 5,83 (d); 5,30 (d); 1,76 (m); 2,08 (m); 2,38 (d); 2,86 (dd); 2,23 (d); 3,32 (d); 4,90 (s); 5,42 (s);... 1,96 (s); 2,10 (s) x 2; 2,00 (s); 2,02 (s); 2,20 (s); 5,80 (d); 5,34 (dd); 4,85 (m); 4,85 (d); 5,60 (d); 2,07 (m); 2,36 (d); 2,57 (m); 1,89 (d); 3,70 (d); 5,20 (s); 5,08 (s); 6,46 (d); 7,70 (d);... n) H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 1,15 (s); 1,77 (s); 2,38 (s); 1,03 (s); 6,45 (d); 7,69 (d); 7,47 (m); 7,78 (d); 7,44 (m); 2,08 (s) x 4; 5,63 (dd); 5,39 (t); 5,45 (dd); 5,94 (d); 6,25 (d); 1,77 (m);