nghiên cứu tách, điều chế chất chuẩn và xây dựng quy trình phân tích một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học tt

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC Ngành: Hóa Phân tích Mã số: 44 01 18 TÓM T T U N ÁN TIẾN S HĨ PHÂN TÍCH Huế - Năm 2020 i Cơng trình hồn thành Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đình Luyện PGS.TS Nguyễn Hữu Tùng Phản biện 1: ………………………………………………… Phản biện 2: ………………………………………………… Phản biện 3: ………………………………………………… Luận án bảo vệ trước hội đồng cấp Đại học Huế vào lúc g ngày năm ……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế ii MỞ ĐẦU Việt Nam nằm khu hệ thực vật phong phú giới, khu vực rừng nhiệt đới Đông Nam Á Nhiều nghiên cứu giới Việt Nam tách HCTN có HTSH từ Diệp hạ châu, Đan sâm, Mật nhân sắc ký giấy, sắc ký cột phân tích hàm lượng HPLC Một số nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích HCTN có HTSH acetogenin, tinh dầu phương pháp GC-MS, LC-MS/MS Về hướng tinh chế để thu chất tinh khiết nhiều nghiên cứu quan tâm, song chủ yếu PTN/các hãng dược chuyên ngành nghiên cứu giá thành chất chuẩn có HTSH đắt Trong đó, VN, nay, nghiên cứu theo hướng hạn chế Xuất phát từ vấn đề trên, luận án thực nhằm mục đích đóng góp tích cực vào hướng nghiên cứu Mục đích nghiên cứu luận án: Luận án thực nhằm xây dựng quy trình tách chiết, điều chế chất chuẩn phân tích số HCTN có HTSH từ số thuốc phân bố địa phương nước ta: Diệp hạ châu, Đan sâm, Mật nhân, Mãng cầu xiêm, Riềng đuôi nhọn - loài phát Các nội dung nghiên cứu luận án: - Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin từ Diệp hạ châu (P urinaria L.); hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA từ Đan sâm (S miltiorrhiza B.) hợp chất eurycomanone từ Mật nhân (E longifolia J.) phương pháp sắc ký; - Tinh chế hợp chất thu (phyllanthin, hypophyllanthin, tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA, eurycomanone) để tạo chất chuẩn cho phân tích định tính định lượng chúng dược liệu khác nhau; - Xây dựng quy trình phân tích hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin, tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA eurycomanone phương pháp sắc ký lỏng đại LC-MS/MS, UPLCDAD để áp dụng cho PTN phân tích nước ta; - Nghiên cứu xác định hàm lượng hợp chất có HTSH dịch chiết Mãng cầu xiêm phương pháp sắc ký đại: sắc ký lỏng ghép nối với detector khác (qNMR, HPLC-PDA, MALDI-TOP HRMS) hợp chất có tinh dầu phận Riềng đuôi nhọn phương pháp sắc ký khí ghép nối với detector khối phổ (GC-MS) Chƣơng TỔNG QU N 1.1 Giới thiệu hợp chất thiên nhiên có HTSH số thuốc 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Các nghiên cứu tách chiết số hợp chất thiên nhiên có HTSH 1.1.3 Một số loài thuốc chứa hợp chất thiên nhiên có HTSH 1.2 Các phương pháp phân tích hợp chất thiên nhiên 1.2.1 Phương pháp sắc ký khí 1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng 1.3 Một số nghiên cứu liên quan đến luận án Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Thông tin mẫu 2.4.2 Phương pháp chiết tách/phân lập 2.4.3 Phương pháp xác định cấu trúc đặc trưng hóa - lý HCTN 2.4.4 Phương pháp tinh chế HCTN để tạo chất chuẩn 2.4.5 PP đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn liệu chất chuẩn 2.4.6 Phương pháp phân tích HCTN 2.4.7 Phương pháp đánh giá độ tin cậy phương pháp phân tích 2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO U N 3.1 CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦ CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN 3.1.1 Chiết tách HCTN từ Diệp hạ châu đặc trƣng cấu trúc 3.1.1.1 Chiết tách phân lập 3.1.1.2 Đặc trưng cấu trúc (i) Hợp chất PU-1: Dạng tinh thể hình kim, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy 128 – 130 oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại miền UV bước sóng 230 280 nm (phụ lục A5); Mảnh phân tử phổ khố (ESIMS) có m/z  453,3 [M+Na]+ mảnh phù hợp với công thức phân tử C24H30O7 (phụ lục A1) Dữ liệu phổ NMR nêu bảng 3.1 phụ lục A2A5 Các kết thu cho phép khẳng định rằng, hợp chất PU-1 hypophyllanthin (ii) Hợp chất PU-2: Dạng tinh thể hình kim, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy 94 - 96oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại miền UV bước sóng 230 280 nm (phụ lục A10); Mảnh phân tử phổ khố (ESI-MS) có m/z = 419 [M+H]+ mảnh phù hợp với công thức phân tử C 24H34O6 (phụ lục A6) Dữ liệu phổ NMR nêu bảng 3.2 phụ lục A8, A9 Các kết thu cho phép khẳng định rằng, hợp chất PU-2 phyllanthin 3.1.2 Chiết tách HCTN từ Đan sâm đặc trƣng cấu trúc 3.1.2.1 Chiết tách phân lập 3.1.2.2 Đặc trưng cấu trúc 25 (i) Hợp chất SM-1: Dạng bột màu đỏ; [α]D = 90o (c 1,0, CHCl3); Nhiệt độ nóng chảy 182 – 183 oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại miền UV bước sóng 220 270 nm (phụ lục A18); Mảnh phân tử phổ khố (ESI-MS) có m/z  297 [M+H]+ mảnh phù hợp với cơng thức phân tử C19H20O3 (hình 3.17, phụ lục A19) Dữ liệu phổ NMR nêu bảng 3.3 phụ lục A16, A17 Các kết thu cho phép khẳng định rằng, hợp chất SM-1 cryptotanshinone (ii) Hợp chất SM-2: Dạng bột màu đỏ; Nhiệt độ nóng chảy 202 – 204 o C; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại miền UV bước sóng 225 270 nm (phụ lục A22); Mảnh phân tử phổ khố (ESI-MS) có m/z = 295 [M+H]+ mảnh phù hợp với công thức phân tử C19H18O3 (hình 3.18 phụ lục A23) Dữ liệu phổ NMR nêu bảng 3.4 Các kết thu cho phép khẳng định rằng, hợp chất SM-2 tanshinon IIA (iii) Hợp chất SM-3: Dạng bột màu đỏ; Nhiệt độ nóng chảy 232-234 o C; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại miền UV bước sóng 250 nm (phụ lục A14); Mảnh phân tử phổ khố (ESI-MS) có m/z = 277 [M+H]+ mảnh phù hợp với công thức phân tử C18H12O3 (phụ lục A11) Dữ liệu phổ NMR nêu bảng 3.5 phụ lục A12, A13 Các kết thu cho phép khẳng định rằng, hợp chất SM-3 tanshinon I 3.1.3 Chiết tách HCTN từ Mật nhân đặc trƣng cấu trúc 3.1.3.1 Chiết tách phân lập 3.1.3.2 Đặc trưng cấu trúc Hợp chất EL-1: Dạng bột màu trắng; [α]25D +26 (c 0,30, MeOH); Nhiệt độ nóng chảy 254 - 255 oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại miền UV bước sóng 255 360 nm (phụ lục A27); Mảnh phân tử phổ khố (ESI-MS) có m/z  409,1 [M+H]+ mảnh phù hợp với công thức phân tử C20H24O4 (phụ lục A24) Dữ liệu phổ NMR nêu bảng 3.6 phụ lục A25, A26 Các kết thu cho phép khẳng định rằng, hợp chất EL-1 eurycomanone Diệp hạ châu (5,0 kg) Ngâm chiết với methanol (3 x 1,5 L) Cao methanol (502 g) Chiết với cloroform, butanol Cao cloroform (255 g) Cao dịch nƣớc (90 g) Cao butanol (95 g) CC, Silica gel, CHCl3:MeOH 100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, v/v H-1 H-2 ( 8,6 g) H-3 H-4 (15g) ( (g) C18 CC, Silica( gel 8,6 g) CHCl3:MeOH CHCl3:MeOH (10:1) g) (8,6 g)(5:1) ( 8,6Hypophyllanthin g) (229 mg) H-5 (27,5 g) C18 (g) CHCl3:MeOH (8,6 g) (4:1) H-7 H-8 H-9 H-10 ( gel(g) CC, Silica g) 3:MeOH CHCl (g) (g) (g) (8,6 g) (8,6 g) (8,6 g) H-6 (8:1) ( Phyllanthin (212 8,6 mg) g) (8,6 g) HPLC điều chế, MeOH:H2O (7:3) Tinh (độ tinh khiết > 99,0%); Sử dụng làm chất chuẩn phân tích Sơ đồ 3.1: Phân lập hợp chất từ Diệp hạ châu Rễ Đan sâm (2,0 Kg) Ngâm chiết với ethanol (3 x 1,5 L) Cao ethanol (488 g) Chiết với Hexane, Ethyl acetat, Butanol Cao hexane (54,4 g) Cao ethyl acetat (105,6 g) Cao dịch nƣớc (40 g) Cao butanol (68,8 g) CC, Silica gel, Hex:EtOAc (20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1 v:v) H-1 H-2 (5,3 g) CC,(8,6 Silica gel g) hex:CH2Cl2 (1:1) H-3 (g) CC, C18 MeOH:H2O (8,6 (4:1) g) Tanshinon IIA (275 mg) (13mg) HPLC điều chế MeOH:H2O (7:3) H-4 (2,7 g) (g) hex:acetone (5:1) (8,6 g) H-5 H-6 (1,5 g) (g) CC, C18 (g) CC, Silica(g) gel CC, C18 (g) MeOH:H2O MeOH:H O hex:EtOAc (8,6 (4:1) (8,6 (4:1) (8,6 g) (3:1) (8,6 g) g) g) Tanshinon I (231 mg) Cryptotanshinon (245 mg) Tinh (độ tinh khiết > 99,0%), Sử dụng làm chất chuẩn phân tích Sơ đồ 3.2 Phân lập hợp chất từ rễ Đan sâm (1g) H-7 (1g) (1g) Rễ Mật nhân (2 Kg) Ngâm chiết với ethanol (3 x 1,5 L) Cao ethanol (62,5 g) Chiết với Ethyl acetat, Butanol Cao ethyl acetat (16,0 g) Cao dịch nƣớc (12 g) Cao butanol (19,0 g) CC, Silica gel, CHCl3:H2O (20:1, 15:1, 10:1, 5:1) Hexane:EtOAc (5:1) E-1 (8,6 E-2 E-3 (g) E-4 (g) E-5 (2,1 g) (g) g) (8, g) (8,6 g) (8,6 g) E-6 CC, C(g) (g) 18 MeOH:H2O (2:1) (8,6 (8,6 g) g) Eurycomanone (235 mg) HPLC điều chế, MeOH:H2O (1:1) Tinh (độ tinh khiết > 99,0%); Sử dụng làm chất chuẩn phân tích (1g) Sơ đồ 3.3: Phân lập hợp chất từ rễ Mật nhân E-7 (g) (8,6 g) 3.2 TINH CHẾ HỢP CHẤT ĐỂ TẠO R CHẤT CHUẨN 3.2.1 Chất chuẩn hypophyllanthin phyllanthin Bảng 3.1 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn Hợp chất Hypophyllanthin Phyllanthin Tạp chất tR S 7,976 1.95 6,902 6,36 Tạp chất tR S 9,302 2,93 9,251 10,75 Chất tR S 6,889 2433,43 8,001 3403,76 Độ tinh khiết TB (%) 99,8 99,5 3.2.2 Chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA Bảng 3.2 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn Hợp chất Tanshinone I Cryptotashinone Tanshinone IIA Tạp chất tR S 5,10 1,46 5,17 2,68 8,69 3,81 Tạp chất tR S 8,62 2,51 7,84 3,73 12,79 4,66 Chất tR S 7,78 1971,19 8,65 1275,13 15,19 2108,23 Độ tinh khiết TB (%) 99,8 99,5 99,6 3.2.3 Chất chuẩn eurycomanone Bảng 3.3 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn eurycomanone Hợp chất Eurycomanone Tạp chất tR S 0,97 3,51 Tạp chất tR S 1,22 7,59 Chất tR S 1,46 1839,25 Độ tinh khiết TB (%) 99,4 Như vậy, với trình tinh sắc ký lỏng điều chế trên, tạo chất chuẩn hypophyllanthin, phyllanthin, tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA eurycomanone 3.3 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC Trên sở khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phép phân tích LCMS/MS như: thành phần pha động (hệ dung môi, pH dung dịch đêm), nhiệt độ cột, tốc độ dịng pha động, thể tích tiêm mẫu, thời gian phân tích…) kết hợp với tham khảo kết công bố tài liệu xây dựng quy trình phân tích đồng thời hypophyllanthin phyllanthin nêu hình 3.13; quy trình phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA nêu hình 3.14 Tương tự với quy trình khảo sát đưa quy trình phân tích eurycomanone mẫu Mật nhân phương pháp LC-MS/MS Mẫu đầu (3-5 g) Đã nghiền nhỏ Chuẩn bị + 20 mL MeOH, siêu âm, 400C, 2h, lặp lại lần, lọc thu dung dịch mẫu mẫu cho phân tích µL (10 µL) mẫu tiêm vào hệ thống LC-MS/MS (UPLC-DAD) với điều kiện thích hợp Dịch chiết  cô quay chân không  định mức 100 mL (MeOH:H2O 60:40 (v/v)) Lấy 0,1 mL dung dịch mẫu định mức lên 10 mL MeOH:H2O 60:40 (đối với mẫu thực phẩm chức chạy LC-MS/MS) Lọc qua màng lọc 0,22µm  mẫu cho phân tích Điều kiện LC: - Cột sắc ký EC-C18 (100 x 2,1 mm, 2,7 μm); - MeOH – nước chứa 10 mM ammonium acetate 0,1 % HCOOH theo tỉ lệ 60:40 v/v; - Tốc độ dịng: 0,3 ml/min; - Thể tích tiêm mẫu: 1,0 μl; - Nhiệt độ buồng cột: 35 oC; - Thời gian phân tích 10 phút Điều kiện MS: - Nguồn ion hóa ESI, loại ion dương; - Nhiệt độ nguồn ion hóa 300oC; - Chế độ chạy MRM; - Phyllanthin: ion sơ cấp m/z 436,0 - ion thứ cấp m/z 151,0; - Hypophyllanthin: ion sơ cấp m/z 261,0 - ion thứ cấp m/z 231,0 Điều kiện DAD: - Bước sóng 230 nm Sắc ký đồ LC-MS/MS, UPLC-DAD bảng kết Định tính: dựa vào thời gian lưu mảnh đặc trưng Định lượng: Dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính y = a + bx ta tính nồng độ chất phân tích LC-MS/MS ta có Cng/mL = (y-a)/b (ng/mL) Tiếp theo, hàm lượng chất phân tích tính quy mg/g: Cmg/g = Cng/mL*100*D/m/106 Đối với UPLC-DAD ta có Cµg/mL = (y-a)/b Kết (µg/mL) Tiếp theo, hàm lượng chất phân tích tính quy mg/g: Cmg/g = Cµg/mL*100*D/m/103 với D hệ số pha lỗng, m khối lượng (g) mẫu phân tích, 100 thể tích (mL) bình định mức mẫu phân tích, 106, 103 tương ứng hệ số chuyển đổi từ ng µg sang mg Hình 3.1 Quy trình phân tích đồng thời hypophyllanthin phyllanthin phương pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD (áp dụng cho mẫu Diệp hạ châu thực phẩm chức bào chế từ nó) Bảng 3.5 Kết khảo sát độ ổn định hệ thống thiết bị LC-MS/MS phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA (n  6) (*) Tanshinone I Cryptotanshinone Tanshinone IIA TN t S a D t S A D t S a D 7,782 380,1 0,99 34535 8,66 367,7 0,98 30535 15,10 600,6 1,01 50016 7,785 379,9 1,02 32649 8,65 368,1 1,01 30649 15,18 599,2 0,99 49750 7,782 378,5 1,00 30673 8,62 367,5 1,02 30673 15,19 601,3 0,99 49994 7,785 381,2 1,01 36569 8,64 366,6 1,01 30569 15,19 598,9 1,02 49913 7,792 380,5 0,98 30684 8,63 367,9 0,98 30684 15,19 599,8 0,98 51015 7,846 379,6 0,98 33595 8,69 368,5 0,99 30595 15,19 603,8 1,03 50179 TB 7,795 379,97 0,99 33950 8,65 367,7 0,99 30617 15,17 600,6 1,00 50144 RSD (%) 0,3 0,2 1,6 3,5 0,3 0,2 1,8 0,2 0,2 0,3 1,6 1,0 12 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ ổn định hệ thống thiết bị LC-MS/MS TN Eurycomanone TB t 1,456 1,454 1,457 1,456 1,455 1,454 1,455 S 280,1 279,9 278,5 281,2 280,5 279,6 279,97 a 0,95 1,02 1,05 1,04 0,96 0,94 0,99 D 24535 24649 23673 26569 24684 23595 24284 RSD (%) 0,1 0,3 4,9 5,0 3.4.2 Độ đặc hiệu phƣơng pháp phân tích Phyllanthin Hypophyllanthin Hình 3.4 Sắc đồ LC-MS/MS dung dịch chuẩn chứa hypophyllanthin phyllanthin Tanshinone I Tanshinone IIA Cryptotanshinone Hình 3.5 Sắc đồ LC-MS/MS dung dịch chuẩn chứa tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA Eurycomanone Hình 3.6 Sắc đồ LC-MS/MS dung dịch chuẩn chứa eurycomanone 13 3.4.3 Khoảng tuyến tính - Đối với hypophyllanthin phyllanthin: Phương pháp LC-MS/MS: y = 11,251*Chypophyllanthin – 405,977; R2 = 0,9995; p < 0,0001; y = 22,151*Cphyllanthin – 1308,984 ; R2 = 0,9991; p < 0,0001; Hình 3.7 Đường hồi quy tuyến tính hypophyllanthin phương pháp LC-MS/MS Hình 3.8 Đường hồi quy tuyến tính phyllanthin phương pháp LC-MS/MS - Đối với tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA: Phương pháp LC-MS/MS: y = - 781.061 + 15.643*Ctanshinone I, R2 = 0.999; p < 0.0001 y = - 96.429 + 2.276*Ccryptotanshinone, R2 = 0.999; p < 0.0001 y = - 135.941 + 4.162*Ctanshinone IIA, R2 = 0.999; p < 0.0001 Hình 3.9 Đường hồi quy tuyến tính tanshinone I phương pháp LC-MS/MS 14 Hình 3.10 Đường hồi quy tuyến tính cryptotanshinone phương pháp LC-MS/MS Hình 3.11 Đường hồi quy tuyến tính tanshinone IIA phương pháp LC-MS/MS Đối với eurycomanone: Phương trình hồi quy tuyến tính thu sau (đường hồi quy tuyên tính nêu hình 3.32): y = 1262.961*Ceurycomanone + 15.631; R2 = 0.999; p δ-cadinen (20,4%); Thành phần tinh dầu thu từ rễ chứa 46 cấu tử (chiếm 92,0 % tổng hàm lượng tinh dầu) Trong đó, chứa nhiều nhóm monoterpene hydrocarbon (56,3 %) > dẫn xuất chứa oxy monoterpene (21,7 %) > sesquiterpene hydrocarbon (10,7 %); Thành phần tinh dầu thu từ hoa chứa 16 cấu tử (chiếm 97,7% tổng hàm lượng tinh dầu), chứa nhiều nhóm monoterpene hydrocarbon (44,8 %), dẫn xuất chứa oxy monoterpene (22,9 %) sesquiterpene hydrocarbon (18,2 %) KẾT U N Từ kết thu được, luận án đến kết luận sau: 1) Trên sở khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình tách phương pháp khác (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký điều chế), tìm điều kiện thích hợp để phân lập hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin từ Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.), tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA từ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza B.) eurycomanone từ Mật nhân (Eurycoma longifolia J.) với độ tinh khiết đạt 95 % chất Cấu trúc hợp chất khẳng định qua liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1H-NMR, 13CNMR), phổ hấp thụ phân tử UV-Vis phổ khối lượng (ESI-MS) 2) Đã tìm điều kiện thích hợp cho phương pháp sắc ký lỏng điều chế để tinh chế 06 hợp chất đạt độ tinh khiết 99 % chất vậy, lần nước ta tạo hóa chất thỏa mãn điều kiện làm chất chuẩn cho phân tích định tính định lượng 3) Đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời phyllanthin hypophyllanthin mẫu Diệp hạ châu thực phẩm chức 23 bào chế từ đó; Xác định đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA mẫu Đan sâm xác định eurycomanone Mật nhân phương pháp LC-MS/MS UPLC-DAD với điều kiện thí nghiệm thích hợp sử dụng chất chuẩn tạo Phương pháp LC-MS/MS đạt độ lặp lại tốt tất 06 chất với RSD < % (n  3) Phương pháp LC-MS/MS đạt độ tốt với độ thu hồi trung bình 95 - 104 %, độ nhạy cao (hay LOD thấp, khoảng 0,1 - 0,5 ppb) khoảng tuyến tính đủ rộng (0,005 – 50 ppm) với R2 > 0,999 p < 0,001 tất 06 chất Phương pháp UPLC-DAD có độ lặp lại phương pháp LC-MS/MS, sử dụng để phân tích định lượng 06 chất với kết thu không khác với phương pháp LC-MS/MS (p > 0,05) 4) Sử dụng kỹ thuật chiết phân đoạn dung môi khác nhau, kết hợp với hệ thống thiết bị phối hợp qNMR HPLC-PDA-HRMS cho phép nhận biết phân đoạn chiết etylacetate (AMF-3) từ Mãng cầu xiêm (Annona muricata (Soursop)) phân đoạn giàu nhóm hợp chất acetogenin phân tích định tính hợp chất (thuộc nhóm acetogenin) có hoạt tính sinh học phân đoạn Mặt khác, với phương pháp qNMR định lượng tổng nhóm acetogenin chứa 4-OH tổng nhóm acetogenin khong chứa 4-OH Tổng hàm lượng hai nhóm acetogenin chiếm 46 % phân đoạn AMF3 5) Bằng kĩ thuật chưng cất lôi nước kết hợp với phương pháp khối lượng, xác định hàm lượng tinh dầu chiết tách từ phận (lá, thân, rễ, hoa, quả) Riềng đuôi nhọn (Alpinia macroura K Schum) Sử dụng phương pháp GC-MS, lần giới, định tính bán định lượng hợp chất có mặt tinh dầu thu từ phận Tuy thành phần cấu tử tinh dầu phận khác nhau, chiếm nhiều nhóm monoterpene hydrocarbon với hàm lượng 35,9 – 71,9 %, nhóm dẫn xuất chứa oxy monoterpene (13,6 – 27,2 %) nhóm sespuiterpene hydrocabon (5,4 – 30,5 %); nhóm cịn lại có hàm lượng < 10 % Các kết tiền đề tốt cho nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học có mặt lồi dược liệu q 24 D NH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦ U N ÁN Tạp chí nước Đồn Mạnh Dũng, Đặng Thị Ngần, Nguyễn Thị Huệ, Lê Quốc Hùng, Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Đình Luyện, Trần Đình Thắng (2019), Phân lập xác định hàm lượng tanshinon I, cryptotanshinon, tanshinon IIA dược liệu Đan sâm (Salvia miltiorrhiza B.) sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC-DAD), Tạp chí Khoa học Công nghệ trường Khoa học Kĩ thuật, 137, 100-105 Đoàn Mạnh Dũng, Nguyễn Ngọc Tuấn, Hoàng Văn Trung, Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Đình Luyện (2019), Phân lập xác định hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin số chế phẩm từ Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC-DAD), Tạp chí Phân tích Hóa, Lý Sinh học, Tập 24, số 2, 37-42 Đoàn Mạnh Dũng, Nguyễn Ngọc Tuấn, Hoàng Văn Trung, Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Đình Luyện, Trần Đình Thắng (2019), Xác định hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin mẫu thuốc từ Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L,) sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS), Tạp chí Phân tích Hóa, Lý Sinh học, Tập 24, số 2, 140-146 Đoàn Mạnh Dũng, Hoàng Văn Trung, Nguyễn Đình Luyện, Nguyễn Hữu Tùng (2018), Phân lập phân tích hàm lượng eurycomanone mật nhân (Eurycoma longifolia) Việt Nam sắc ký lỏng ghép khối phổ LCMS/MS – Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, Tập 127, số 1B, 153-162 Đoàn Mạnh Dũng, Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Đình Luyện (2018), Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L,) sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS), Tạp chí Khoa học trường Đại học Khoa học – Đại học Huế, Tập 13, số 2, 1324 Nguyễn Huy Hùng, Đoàn Mạnh Dũng, Đinh Thị Trường Giang, Yang Chang Wu, Trần Đình Thắng (2015), Định tính, định lượng thử nghiệm hoạt tính sinh học Acetogenin dịch chiết Etanol từ Mãng cầu xiêm (Annona muricata) phương pháp HPLC-PDA, qNMR, MALDI-TOP MS, Tạp chí Hóa học, 53(6e1,2): 232-236 Tạp chí Quốc tế Le T Huong, Do N Dai, Mai V Chung, Doan M Dung & Isiaka A Ogunwande (2017), Constituents of essential oils from the leaf, stem, root, fruit and flower of Alpinia macroura K Schum, Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 16(1), 26 - 33 (SCIE) Đoàn Mạnh Dũng cộng sự, Simultaneous quantitative analyses of tanshinone IIA, cryptotanshinone, and tanshinone I in danshen (Salvia miltiorrhiza) cultivated in Vietnam using LC-MS/MS, Indian Journal of Natural Products and Resources (IJNPR), (Đang phản biện) 25 26 ... thiệu chung 1.1.2 Các nghiên cứu tách chiết số hợp chất thiên nhiên có HTSH 1.1.3 Một số lồi thuốc chứa hợp chất thiên nhiên có HTSH 1.2 Các phương pháp phân tích hợp chất thiên nhiên 1.2.1 Phương... đích đóng góp tích cực vào hướng nghiên cứu Mục đích nghiên cứu luận án: Luận án thực nhằm xây dựng quy trình tách chiết, điều chế chất chuẩn phân tích số HCTN có HTSH từ số thuốc phân bố địa phương... điều chế để tinh chế 06 hợp chất đạt độ tinh khiết 99 % chất vậy, lần nước ta tạo hóa chất thỏa mãn điều kiện làm chất chuẩn cho phân tích định tính định lượng 3) Đã xây dựng quy trình phân tích