Nghiên cứu tách, tinh chế và thủy phân glucomannan từ cây amorphophallus konjac k koch ở lâm đồng và định hướng ứng dụng hạ đường huyết tt

BỘ GIÁO DỤCVÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẦN THỊ NỮ NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN GLUCOMANNAN TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJACK KOCH Ở LÂM ĐỒNG VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT Chun ngành: Hóa hữu Mã số:9.44.01.14 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Hà Nội - 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Đỗ Trường Thiện Người hướng dẫn khoa học 2: TS Trần Thị Ý Nhi Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết đề tài Glucomannan polysacarit gồm mắt xích Dmannose D-glucose liên kết với liên kết β-(1→ 4) glucozit Các mạch nhánh chiếm khoảng 8% thông qua liên kết β-1,3-glucozit β-1,6-glucozit Đây chất xơ hòa tan nghèo lượng dùng làm thực phẩm phần ăn người ăn kiêng để giảm cân, làm giảm cholesterol máu, mỡ máu, giảm hấp thu đường huyết Ngồi glucomannan cịn có nhiều tính chất q có khả hấp thụ nước trương nở tốt tạo dung dịch có độ nhớt cao nên ứng dụng nhiều lĩnh vực tạo độ ổn định cho thực phẩm, tạo gel, tạo màng Glucomannan có nhiều lồi nưa, lồi cấu trúc tính chất khác nhau, Nưa Konjac (Amorphophalus konjac K.Koch) lồi có hàm lượng glucomannan cao trồng chủ lực để phát triển ngành Nưa số nước Đông Á Đông Nam Á như: Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan Việt Nam có khoảng 25 lồi Nưa phân bố rải rác khắp vùng miền nước.Cây Nưa Amorphophallus konjac K.Koch tìm thấy vào năm 2012 số tỉnh miền núi phía Bắc Do khối lượng phân tử lớn (khối lượng phân tử trung bình glucomannan dao động khoảng 1.9  106÷  106Da [10], độ nhớt cao nên khả tan nước glucomannan (độ tan khoảng 30%), làm hạn chế phần hiệu phạm vi ứng dụng glucomannan số lĩnh vực Để tăng khả hịa tan, q trình thủy phân glucomannan để thu glucomannan có khối lượng phân tử nhỏ mà giữ tính chất quý glucomannan thu hút quan tâm nghiên cứu nhiều nhà khoa học Ngồi tính chất chung glucomannan (KGM), glucomannan thủy phân (LKGM) cịn có nhiều hoạt tính sinh học lợi khuẩn, chống oxy hóa, điều hịa miễn dịch, ….Glucomannan thủy phân sử dụng để vận chuyển thuốc Với tiềm ứng dụng LKGM lĩnh vực thực phẩm dược phẩm, nghiên cứu phương pháp điều chế glucomannan khối lượng phân tử thấp gần nhiều tác giả giới quan tâm, gồm: thủy phân enzym [13]–[23], enzym kết hợp với chiếu xạ [24]thủy phân axit HCl [14][25], axit HCl kết hợp sử dụng sóng siêu âm [26] hay chiếu xạ tia gamma kết hợp etanol [27], kiềm kết hợp nhiệt [28] Tuy nhiên nghiên cứu giới tập trung nhiều vào phương pháp điều chế glucomannan khối lượng phân tử thấp mà chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết tính chất, cấu trúc hóa học, mối quan hệ cấu trúc hoạt tính sinh học chúng, đặc biệt khả giảm hấp thu đường huyết chế tác dụng chưa nghiên cứu Những nghiên cứu glucomannan có nguồn gốc Việt Nam lại chưa có Để đóng góp nghiên cứu có ý nghĩa khoa học glucomannan có nguồn gốc Việt Nam, đồng thời góp phần nâng cao giá trị sử dụng glucomannan nhằm tạo sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức có giá trị thực tiễn cao t Nưa Amorphophalus konjac K.Koch Việt Nam lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tách, thủy phân glucomannan từ Amorphophallus Konjac K.Koch định hướng ứng dụng hạ đường huyết sản phẩn tạo thành” Mục tiêu luận án: - Tách, xác định tính chất chứng minh cấu trúc cùa glucomannan t củ Amorphophallus Konjac K.Koch thu nhận Việt Nam - Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân Konjac glucomannan để chế tạo loại glucomannan với khối lượng phân tử thấp phương pháp khác - Thăm dị hoạt tính hạ đường huyết chế hạ đường huyết sản phẩm thủy phân Các nội dung nghiên cứu luận án * Nghiên cứu thành phần hóa học củ A.Konjac K.Koch: Xác định tỷ lệ manose/glucose, cấu trúc hóa học, khối lượng phân tử phương pháp hóa lý đại (IR, NMR, TGA, …) * Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân konjac glucomannan phương pháp hóa học phương pháp enzym, xác định cấu trúc, tính chất sản phẩm thủy phân * Nghiên cứu ảnh hưởng konjac glucomannan konjac glucomannan thủy phân đến khả hấp thu dung nạp glucozơ máu chuột nhắt trắng Xác định khả kích hoạt enzym AMPK konjac glucomannan thủy phân Ý nghĩa khoa học đóng góp luận án 1-Đã nghiên cứu đầy đủ glucomannan t nưa Amorphophallus Konjac K.Koch t tách chiết đến nghiên cứu cấu trúc thủy phân phương pháp khác 2-Sử dụng quy hoạch hóa thực nghiệm bậc BoxBenh Ken, xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân glucomannan enzym Sản phẩm thủy phân tạo thành oligome có khối lượng phân tử giảm t 1598 kDa xuống 2051,77 Da, tan tốt nước độ tan 92,5% mà giữ cấu trúc, tính chất polime ban đầu 3-Đã đánh giá khả kích hoạt enzym AMPK invitro khả giảm hấp thu tăng khả dung nạp glucose chuột nhắt trắng glucomannan glucomannan thủy phân Kết nghiên cứu cho thấy glucomannan thủy phân có khả kích hoạt enzym AMPK làm hạ glucose huyết chuột nhắt trắng Bố cục luận án Luận án gồm 124 trang với 29 bảng số liệu, 33 hình sơ đồ Bố cục luận án: Mở đầu: trang, chương - Tổng quan: 40 trang; chương - Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 18 trang; chương - Kết bàn luận 53 trang; kết luận chung - trang Danh mục cơng trình khoa học công bố liên quan đến luận án: trang B NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung glucomannan 1.1.1.Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan 1.1.2 Tính chất vật lý glucomannan 1.1.3 Tính chất hóa học glucomannan 1.1.4 Hoạt tính sinh học tác dụng dược lý glucomannan 1.2 Cây nưa A.konjac K.Koch quy trình tách chiết glucomannan 1.2.1 Cây Nưa Amorphophallus Konjac K.Koch 1.2.2 Quy trình tách chiết glucomannan từ củ A.konjac 1.3 Phản ứng cắt mạch glucomannan 1.3.1 Cắt mạch phương pháp lý -hóa học 1.3.2 Thủy phân với xúc tác enzym 1.4 Enzym AMPK vai trị hạ đường huyết 1.4.1 Q trình chuyển hóa glucose thể 1.4.2 Khái quát enzym Adenoidin 5'-monophosphat kích hoạt protein kinase (AMPK ) 1.4.3 Các phương pháp kích hoạt AMPK 1.5 Tính hình nghiên cứu glucomannan từ nưa A.konjac Việt Nam CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu củ Nưa (thân củ) Amorphophallus Konjac K.Koch trồng tỉnh Lâm Đồng năm, thu vào tháng 10 năm 2016 Mẫu giám định tên khoa học TS Nguyễn Văn Dư, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, tiêu lưu giữ nhà lưới lưu mẫu tỉnh Đắc Nông Trung tâm phát triển công nghệ cao Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Vi khuẩn Bacillus substilis Bacillus lichenifomis Trong nghiên cứu sử dụng khuẩn lạc chủng Bacillus substilis Bacillus lichenifomis cung cấp phịng thí nghiệm ni giữ chủng vi sinh vật gốc để sản xuất chế phẩm sinh học AT- BiO Công ty TNHH Sản xuất & Dịch vụ An Thái Cả chủng vi khuẩn có lợi, an tồn sinh học nguồn gốc xuất xứ rõ ràng có giải trình tự gen chủng gốc kèm theo phụ lục luận án Các vi sinh vật hữu ích mua chủng gốc t Cơng ty cổ phần Công nghệ vi sinh Môi trường - Enzym endo-1,4 β-Mannanase (Bacillus sp.) EC 3.2.1.78Cazy Family: GH26CAS: 37288-54-3 công ty Megazyme -Tế bào C2C12 (tế bào vân nguyên phát chuột nhắt, CRL-1772) cung cấp hệ thống chủng chuẩn Mỹ - Động vật: chuột nhắt trắng, hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng t 20-30g, học viện Quân y cung cấp 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng glucomannan Được thực theo phương pháp DNS: Thủy phân glucomannan sau cho dịch thủy phân tác dụng với axit 3,56 dinitrosalicylic axit tạo sản phẩm có màu nâu đỏ Xác định hàm lượng mono saccharide đường chuẩn glucose 2.2.2 Tách glucose từ củ nưa A.Konjac Sử dụng phương pháp kết hợp khơ, ướt có cải tiến để tách glucomannan t củ nưa A.Konjac K.Koch Bước 1: Củ nưa Konjac rửa sạch, loại bỏ tạp chất, thái lát nhỏ, ngâm vào dung dịch NaHSO3 0,25 ‰ Bước 2: Thêm dung dịch etanol/nước tỷ lệ 1,5:1với tỷ lệ củ/dung môi 1:2.Thời gian xay nghiền 20 phút Bước 3: Ly tâm thu tủa (dạng sệt) Bước 4: Sấy khô hỗn hợp sản phẩm thu bột konjac glucomannan (KGM) Bước 5: Tinh chế sản phẩm cách hòa tan bột KGM vào dung dịch etanol 40% gia nhiệt, khuấy đều, ly tâm thu tủa, bỏ phần dịch lọc Lặp lại trình lần thu KGM tinh chế 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc Cấu trúc hóa học hợp chất xác định sở sử dụng phép xác định thông số vật lý phương pháp đo phổ thiết bị đại đồng thời kết hợp với phân tích tra cứu tài liệu tham khảo 2.2.2.1 Phổ hồng ngoại IR 2.2.2.2 Phổ cộng hưởng t nhân (NMR) 2.2.2.3.Giản đồ phân tích nhiệt 2.2.2.4 Thiết bị đo áp suất thẩm thấu OSMOMAT 090 Tỷ lệ đơn vị cấu trúc manose/glucose xác định dựa vào giá trị tích phân phổ cộng hưởng t hạt nhân proton 1HNMR, theo công thức sau: R Man/Glu  I H1  Man I H1  Glu (2.3) Trong đó: RGlu/Man tỷ lệ glucose/mannose IH1-Glu giá trị tích phân proton H1 glucose IH1 -Man giá trị tích phân proton H1 mannose * Xác định độ axetyl hóa Độ axetyl hóa DA xác định dựa vào giá trị tích phân phổ cộng hưởng t hạt nhân proton 1H-NMR, theo công thức sau: DA  I CH 3   I H1  100% (2.4) Trong đó: ICH3 giá trị tích phân H nhóm CH3 IH1 giá trị tích phân proton liên kết với C1 2.2.3 Thủy phân glucomannan 2.2.3.1 Thủy phân axit - Lấy vào cốc thể tích xác dung dịch hỗn hợp axit CH3COOH axit HCl Cân 10g glucomannan, phân tán vào dung dịch hỗn hợp axit, khuấy dung dịch đến đồng phương pháp thủy phân axit axit kết hợp sóng siêu âm - Tiến hành siêu âm mẫu nhiệt độ thường khoảng 30 phút sau khuấy t có gia nhiệt mẫu thủy phân kết hợp sử dụng sóng siêu âm với cường độ 20 Hz khuấy t kỹ thuật lai Western plot Quá trình thực môn Dược lực Trường Đại học Dược Hà Nội 2.2.3.1 Hoạt tính hạ đường huyết Konjacglucomannan chuột nhắt trắng Khả kích thích dung nạp glucose huyết sản phẩm thủy phân xác định mơ hình chuột bình thường, khỏe mạnh nghiệm pháp xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống (Oral glucose tolerance test - OGTT) Nghiệm pháp thực trường Đại học Dược Hà Nội Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nghiên cứu tách, tinh chế đặc điểm cấu trúc, tính chất glucomannan củ nưa A.konjac 3.1.1 Hàm lượng glucomannan củ Nưa A.Konjac Bột glucomannan t củ nưa Amorphophallus Konjac chất bột màu trắng tan nước với độ tan 32% hàm lượng 12,26% củ tươi hàm lượng tro 4,17%, độ hút ẩm 9%, hàm lượng Asen 0,208 ppm, hàm lượng chì 0,184 ppm So sánh với kết nghiên cứu trước, hàm lượng glucomannan củ nưa Konjac cao so với lồi nưa chng (Paeonnifolius) hàm lượng 1,67% nưa đầu nhăn (Corrugatus) 6% Điều khẳng định vai trò Amorphophallus Konjac định hướng phát triển loài Nưa Việt Nam 3.1.2 Cấu trúc Konjac glucomannan Để xác định cấu trúc KGM, tiến hành ghi phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng t hạt nhân 1H, 13C phổ HSQC KGM Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) proton (1H) KGM quy kết bảng 3.5 11 Bảng 3.5: Độ dịch chuyển hóa học proton (1H) KGM Tín hiệu Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm) H1 5,30; 5,60 5,65;5,04 H2 4,24;4,29 3,94÷3,99 H3 4,32÷4,69 4,20÷4,23 H4 3,80÷3,89 3,79 H5 3,65÷3,65 4,06÷4,08 H6 4,29;4,27 4,18÷4,19 H CH3CO- 2,52 Kết phân tích phổ cho thấy glucomannan tách t A.konjac, có cấu trúc vơ định hình, có tỷ lệ manose/glucose 1,6/1, độ axetyl hóa ≈8%, khối lượng phân tử 1.598 kDa, phân nhánh vị trí C6 So với loại Nưa khác tìm thấy Việt Nam, glucomannan thu t nưa A, Konjac có độ acetyl hóa lớn (nưa chng; nưa thái có DA =0; nưa trạm trổ có DA = 7,22; nưa đầu nhăn có DA = 7,57)[9] Khối lượng phân tử glucomannan xác định phương pháp áp suất thẩm thấu Mn  848  T ( K )  lim C C 0 d  1.597 910 ( g / mol )  1.598 kDa Kết chứng minh Konjac glucomannan có khả hịa tan nước lớn nhiều loại nưa khác tìm thấy Việt Nam Nhờ có tính chất này, Konjac glucomannan ứng dụng nhiều lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm lĩnh vực khác 12 Trên phổ hai chiều 1H-13C-HSQC-NMR, tương tác C/H đặc trưng tín hiệu, liên kết trực tiếp CH vịng pyranose quy kết xác sau: Manose: C1/H1 (94.71;94.33/5.30; 5.60), C2/H2 (71.04/4,24;4.29), C3/H3(71.45/4.32÷4.69), C4/H4(76.76/3.80÷3.89), C5/H5(74.976/3.651÷3.658), C6/H6(61.97/4.29;4.27) Glucose: C1/H1 (96.68;92.78/5.65;5.04), C2/H2 (72,27;72,18/3,94÷3,99), C3/H3(73,12/4,20÷4,23), C4/H4(76,60; C5/H5(73.82/4.06÷4.08), 76,56/3,79), C6/H6(61.63; 61.54/4.18÷4.19) 3.2 Thủy phân Glucomannan xúc tác axit Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác axit xác định điều kiện thích hợp để thủy phân glucomannan xúc tác axit kết hợp sóng siêu âm là: nồng độ axit CH3COOH 10%, axit HCl 0,15M, nhiệt độ phản ứng 50oC, thời gian phản ứng giờ, tỷ lệ KGM/dd axit 1/10(g/ml) Đối với phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác axit khơng kết hợp sóng siêu âm thực ở: nồng độ axit CH3COOH 10%, axit HCl 0,15M, nhiệt độ phản ứng 50oC, thời gian phản ứng giờ, tỷ lệ KGM/dd axit 1/10 (g/ml) Sản phẩm thủy phân có khối lượng phân tử giảm t 1598kDa xuống 88,561kDa Độ tan nước LKGM-1 đạt 82,6% Cấu trúc mạch oligome sản phẩm xác định phổ IR, phổ NMR 1H, 13C giản đồ phân tích nhiệt 13 Hình 3.17: Phổ 1H LKGM-1 Kết phân tích cho thấy, với việc sử dụng hỗn hợp axit CH3COOH HCl nhóm axetyl phân tử glucomannan bảo vệ nên độ DA sản phẩm thủy phân giảm không đáng kể Cấu trúc mạch LKGM-1 thay đổi so với glucomannan ban đầu: tỷ lệ M/G 1,51, DA LKGM-1 7,03%, 3.3 Thủy phân Konjac glucomannan enzym 3.3.1 Định tính xác định khả phân huỷ glucomannan enzym từ vi khuẩn Kết thực nghiệm cho thấy, enzym sinh t loại vi khuẩn Bacillus subtilis bacillus licheniformis có khả phân hủy glucomannan Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng Trong chủng vi khuẩn bacillus subtillis có khả phân hủy tốt với P 0,05) cho thấy giá trị khơng có ý nghĩa thống kê Điều chứng tỏ mơ hình thực nghiệm hồn tồn tin cậy Giá trị hệ số xác định R2 phản ánh độ phù hợp phương trình hồi quy so với thực tế Hệ số xác định R2 0,9988, cao xấp xỉ Điều chứng tỏ phương trình hồi qui hồn tồn phù hợp với kết thực nghiệm Phân tích phù hợp có nghĩa mơ hình thực nghiệm đánh giá phần mềm phân tích Design Expert Kết bảng ANOVA (Bảng 3.20) 15 Bảng 3.20 Kết phân tích ANOVA tối ưu hóa điều kiện phản ứng thủy phân Yếu tố Mơ hình A-Nhiệt độ B-Thời gian C-pH D-tỷ lệ E/S AB AC AD BC BD CD A² B² C² D² Phần dư Lack of fit R2 Bậ c tự 65344,95 14 1915,47 563,07 Tổng bình phương 7412,76 2681,43 1604,00 223,35 402,00 57,00 55,35 1200,62 11662,98 3973,30 47246,57 7920,57 80,48 78,77 1 1 1 1 1 1 12 10 Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P 4667,50 1915,47 563,07 695,95 285,61 83,96 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 7412,76 2681,43 1604,00 223,35 402,00 57,00 55,35 1200,62 11662,98 3973,30 47246,57 7920,57 6,71 7,88 1105,29 399,82 239,17 33,30 59,94 8,50 8,25 179,02 1739,02 592,44 7044,76 1181,01 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0130 0,0140 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 9,19 0,1021 0,9988 Ảnh hưởng cặp yếu tố đến độ nhớt hỗn hợp phản ứng biểu diễn hình 3.23 16 ® Software Design-Expert® Software Actual Factor Coding: Actual Y (mpa.s) nts above predicted value Design points above predicted value nts below predicted value Design points below predicted value 250.15 61.15 300 ature 250 250 X2 = D: E/S 200 Actual Factors 200 B: Time = 150 C: pH = Y (mpa.s) Y (mpa.s) 248 X1 = A: Temperature 150 100 100 50 50 0.7 C: pH Design-Expert® Software Factor Coding: Actual 35 30 50 45 40 0.5 0.4 D: E/S A: Temperature (oC) a) Độ pH nhiệt 0.3 0.2 0.1 30 35 50 45 40 A: Temperature (oC) b)Tỷ lệ E/S nhiệt độ Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Y (mpa.s) Design points above predicted value Y (mpa.s) Design points below predicted value 61.15 0.6 Design points above predicted value 250.15 Design points below predicted value 300 61.15 X2 = B: Time 250 X1 = B: Time Actual Factors 200 Actual Factors C: pH = Y (mpa.s) D: E/S = 0.4 250.15 300 250 X2 = C: pH 200 A: Temperature = 40 D: E/S = 0.4 150 Y (mpa.s) X1 = A: Temperature 100 50 150 100 50 50 B: Time (h) 45 40 35 30 A: Temperature (oC) C: pH 5 B: Time (h) d)Thời gian phản ứng độ pH c)Thời gian phản ứng nhiệt độ Hình 3.23 Đường mức mặt đáp ứng 3D ảnh hưởng cặp yếu tố đến độ nhớt hỗn hợp phản ứng Chúng sử dụng chương trình tính FLEXI viết ngơn ngữ thuật tốn FORTRAN để tìm điều kiện tối ưu phản ứng Kết tốn tối ưu tìm điều kiện phản ứng thủy phân xúc tác enzym là: nhiệt độ= 42,376oC, thời gian = 5,681h, pH = 7,241,tỉ lệ E/S = 0,536 Khối lượng phân tử trung bình sản phẩm thủy phân 2051,28 Da Cấu trúc sản phẩm thủy phân khảo sát phổ proton 1H, 13C, HSQC Bảng 3.23: 1H NMR độ dịch chuyển hóa học LKGM-E 17 Proton Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm) H1 5,26 5,03;5,02 H2 4,41 3,87 H3 4,30 4,22 H4 4,32 4,16 H5 4,01 4,08 H6 4,28; 4,20 4,49 H CH3CO- 2,70 Bảng 3.24: Độ dịch chuyển hóa học 13C - NMR LKGM-E Tín hiệu Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm) C1 102,15;101,99 104,45 C2 72,52;72,18 75,35;75,11 C3 73,63; 73,15 76,19 C4 77,79÷78,90 80,86 C5 77,26 76,97;76,83 C6 62,92;62,78 62,57;62,45 C CH3CO- 22,17; 176,80 β-Man(14)-β-Glc 71,77 β-Man(14)-β-Man 71,56 Phổ hai chiều HSQC LKGM-E tương tác đặc trưng cho vòng pyranose quy kết xác sau: 18 Mannose: C1/H1 (102,15; 101,99/5,26), C2/H2 (72,52; 72,18/4,41), C3/H3 (77,79;78,90/4,32), (73,63; C5/H5 73,15/4,30), (77,26/4,01), C4/H4 C6/H6 (62,92; 62,78/4,28; 4,20) Glucose: C1/H1 (104,45/5,03; 5,02), C2/H2 (75,35; 75,11/3,87), C3/H3 (76,19/4,22), C4/H4 (80,86/4,16), C5/H5 (76,97; 76,83/4,08), C6/H6 (62,57; 62,45/4,49) Qua phương pháp phổ cho thấy KGM-E có cấu trúc không thay đổi nhiều so với glucomannan ban đầu Tỷ lệ M/G Tỷ lệ M/G 1,2, độ acetyl hóa DA 7,56 % độ tan 92,5% 3.4 Hoạt tính hạ đường huyết LKGM-E 3.4.1 Hoạt tính hạ đường huyết LKGM-E mơ hình in vitro chứng AICAR m100 m50 m25 m12,5 m6,25 actin p-AMPK Hình 3.31 Hình ảnh mức độ biểu p-AMPK actin thu kĩ thuật Western Trong nghiên cứu chúng tơi, tác dụng hoạt hóa AMPK glucomannan thủy phân tiến hành đánh giá tế bào vân chuột nhắt nguyên phát (C2C12) sau biệt hóa thành tế bào trưởng thành phương pháp Western lot Đây phương pháp đại có độ nhạy cao, phát protein phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể tương ứng nên cho kết có độ tin cậy cao 19 So sánh tỷ lệ mức độ biểu p-AMPK/ β-actin lơ tế bào có ủ mẫu thử với lơ chứng để đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK mẫu thử Kết thực nghiệm cho thấy Konjac glucomannan thủy phân nồng độ 100μg/ml nồng độ 50μg/ml làm tăng đáng kể mức độ biểu p-AMPK (lần lượt 1,47 lần 1,81 lần so với lô chứng, p