Nghiên cứu điều chế và thử nghiệm tác dụng hạ đường huyết của cao dược liệu từ râu mèo, mướp đắng và mắc cỡ

Đã nghiên cứu quy trình chiết xuất với các dung môi khác nhau: cồn và nước và thu được các sản phẩm sau: - Cao chiết cồn hỗn hợp các dược liệu ký hiệu là Cao HHA - Cao chiết nước hỗn hợp

Trang 1

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

********

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu điều chế và thử tác dụng hạ đường huyết của cao

dược liệu Mướp đắng, Râu mèo và Mắc cỡ”

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC

CƠ QUAN QUẢN LÝ: SỞ KHOA HỌC& CÔNG NGHỆ TP.HCM

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM SÂM & DƯỢC LIỆU TP.HCM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 6/2016

Trang 2

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Bệnh đái tháo đường là bệnh mạn tính đang có xu hướng gia tăng trên toàn thế giới, hậu quả của biến chứng thường nặng nề, để lại cho gia đình và người bệnh gánh nặng về chi phí, đồng thời còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống và đặc biệt là hàng năm thế giới mất một nguồn lao động rất đáng kể do giảm 5-

10 năm tuổi thọ

Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO), chi phí để cho việc khám, điều trị và phòng chống bệnh đái tháo đường rất lớn, khoảng 232-430 tỷ USD/năm Hiện nay, để điều trị các bệnh đái tháo đường, các dược phẩm tây y thường để lại những tác dụng phụ đáng kể ảnh hưởng đến thể trạng chung cho người bệnh, đặc biệt gây tổn hại gan và thận, đây là các cơ quan thanh lọc chất độc cho cơ thể Chính vì thế, xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới từ thảo dược trên thế giới và tại Việt Nam ngày càng tăng

Theo kinh nghiêm dân gian, Việt Nam đã có nhiều bài thuốc điều trị bệnh đái tháo đường hiệu quả, một trong số đó có bài thuốc từ các dược liệu Râu mèo, dây lá quả non Mướp đắng và Mắc cỡ của lương y Đinh Bá Luyện, tuy nhiên, tác dụng chống đái tháo đường này chỉ được điều trị theo kinh nghiệm và sử dụng dưới dạng thuốc thang Chính vì thế, việc hiện đại hóa bài thuốc để thành một dược phẩm an toàn và hiệu quả cần phải được nghiên cứu một cách khoa học trên các thực nghiệm tiền lâm sàng là vấn đề rất cần thiết và hoàn toàn phù hợp với “Chương trình mục tiêu quốc gia phòng, chống bệnh đái tháo đường” mà nhà nước Việt Nam đang thực hiện

Dựa vào tính cấp thiết nêu trên, đề tài “Nghiên cứu điều chế và thử nghiệm tác dụng hạ đường huyết của cao dược liệu từ Râu mèo, Mướp đắng và Mắc cỡ”

được thực hiện

Báo cáo này trình bày các kết quả nghiên cứu trong thời gian từ tháng 6/ 2014-6/2016 với 2 nội dung là:

Nội dung 1:Nghiên cứu công thức chế phẩm đảm bảo tính khả thi công nghệ,

có hiệu quả kinh tế và có tác dụng dược lý hạ đường huyết

Nôi dung 2: Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao dược liệu có tính an toàn và có tác dụng dược lý tốt nhất

Các kết quả thu được như sau:

Trang 3

Nội dung 1:Nghiên cứu công thức chế phẩm đảm bảo tính khả thi công nghệ, có hiệu quả kinh tế và có tác dụng dược lý hạ đường huyết

Đã kiểm định chất lượng nguồn nguyên liệu có trong chuyên luận của Dược điển Việt Nam IV như Râu mèo và đã xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn cơ sở đối với nguyên liệu chưa có trong chuyên luận Dược Điển Việt Nam IV như quả Mướp đắng và Mắc cỡ

Đã nghiên cứu quy trình chiết xuất với các dung môi khác nhau: cồn và nước và thu được các sản phẩm sau:

- Cao chiết cồn hỗn hợp các dược liệu (ký hiệu là Cao HHA)

- Cao chiết nước hỗn hợp các dược liệu (Ký hiệu là Cao HHB)

- Cao chiết cồn Mắc cỡ (ký hiệu Cao PUD)

- Cao chiết cồn quả Mướp đắng (ký hiệu là Cao CHA)

- Cao chiết cồn Râu mèo (ký hiệu là Cao STA)

Đã khảo sát độc tính cấp của 5 mẫu cao dược liệu:

- Đã xác định được liều LD50 của cao cồn quả Mướp đắng qua đường uống là

Đã khảo sát tác dụng hạ glucose huyết của các loại cao dược liệu

- Mẫu cao cồn quả Mướp đắng (CHA) liều 0,9 g/kg thể trọng, khi cho chuột uống trong 10 ngày liên tục, có tác dụng làm giảm nồng độ glucose huyết 32,28% , đạt ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với nhóm chứng bệnh lý

- Mẫucao Râu mèo (STA) liều 0,7g và 1,4 g/ kg thể trọng, khi cho chuột uống trong 10 ngày liên tục, đều có tác dụng giảm glucose huyết với giá trị giảm

Trang 4

lần lượt 25,81% và 27,53%, đạt ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với nhóm chứng bệnh lý

- Mẫu cao Mắc cỡ (PUD) với các liều 0,5g/kg và 1,0g/kg thể trọng, khi cho chuột uống trong 10 ngày liên tục, nồng độ glucose huyết giảm lần lượt là 46,48% và 40,53%, đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng bệnh lý

- Mẫu cao chiết cồn hỗn hợp các dược liệu (HHA), liều 0,72g và 1,44 g/ kg thể trọng, khi cho chuột uống trong 10 ngày liên tục, chưa thể hiện tác dụng hạ glucose huyết trên mô hình chuột đái tháo đường gây bởi streptozocin với liều 160 mg/kg thể trọng chuột

- Mẫu cao chiết nước hỗn hợp các dược liệu (HHB) liều 1,44 g/kg thể trọng, khi cho chuột uống trong 10 ngày liên tục, nồng độ glucose huyết đã giảm 33,15%, đạt ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với nhóm chứng bệnh lý

Nhận xét:

Như vậy, nhóm tác giả đã hoàn thành nội dung 1 theo hợp đồng và kết quả là đã chọn đuợc công thức chế phẩm đảm bảo tính khả thi công nghệ là chiết với dung môi nước, một kỹ thuật hiện nay hầu như các công ty dược phẩm đều sử dụng, có hiệu quả kinh tế và đặc biệt có tác dụng dược lý hạ glucose huyết, với thành phần công thức như sau:

o Quả Mướp đắngkhô: 840 g

Trang 5

Đã khảo sát chất lượng của 3 mẫu chiết cao nước hỗn hợp các dược liệu trong quy mô phòng theo các yêu cầu của tiêu chuẩn cơ sở đã được xây dựng như về

độ ẩm, định tính, định lượng, thử giới hạn nhiễm khuẩn

Sau khi chọn đuợc công thức cao chiết nước hỗn hợp các dược liệu (cao HHB),

có tác dụng hạ glucose huyết, nhóm nghiên cứu cũng đã khảo sát trên 2 mẫu cao chiết nước khác (cao HHB2 và cao HHB3) về tác dụng hạ đường huyết trên mô hình gây tăng đường huyết thực nghiệm Kết quả thu được là cả 3 mẫu cao chiết nước hỗn hợp các dược liệu, có cùng công thức, đều có tác dụng hạ đường huyết trên mô hình gây tăng đường huyết thực nghiệm

Đã theo dõi sự thay đổi của mẫu cao chiết nước hỗn hợp các dược liệu (HHB) có tác dụng dược lý theo thời gian trong điều kiện tự nhiên 12 tháng, chất lượng khảo sát về mặt định tính, định lượng đều năm trong khoảng cho phép theo tiêu chẩn cơ sở mà nhóm xây dựng Các kết quả này làm tiền đề cho việc khảo sát tính ổn định của sản phẩm dưới các dạng như viên nang, trà hay cốm từ cao chiết nước hỗn hợp các dược liệutrong điều kiện tự nhiên

Trang 6

MỤC LỤC

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I MỤC LỤC V NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT VII DANH MỤC CÁC HÌNH VIII DANH MỤC CÁC BẢNG X DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ XII

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 7

1.1 Tổng quan tình hình bệnh đái tháo đường 7

1.2 Tổng quan về các dược liệu nghiên cứu 8

1.2.1 Cây Mướp đắng 8

1.2.2 Cây Râu mèo 11

1.2.3 Mắc cỡ 14

1.3 Tổng quan về các phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm 17

1.4 Tính cấp thiết cần nghiên cứu của đề tài 18

1.5 Mục tiêu của đề tài 19

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu 20

2.1.1 Đặc điểm vi học 20

2.1.2 Khảo sát độ tinh khiết 21

2.1.3 Định tính 24

2.1.4 Định lượng 28

2.2 Chiết cao dược liệu 35

2.2.1 Cao chiết cồn các dược liệu riêng rẽ (Quả Mướp đắng, Râu mèo, Mắc cỡ) và hỗn hợp các dược liệu 35

2.2.2 Cao chiết nước các dược liệu phối trộn (Quả Mướp đắng, Râu mèo, Mắc cỡ) 38

2.3 Tiêu chuẩn hóa cao chiết nước hỗn hợp các dược liệu (cao HHB) 39

2.3.1 Xác định độ ẩm 39

2.3.2 Độ tro toàn phần 39

2.3.3 Định tính 39

2.3.4 Định lượng 43

2.4 Thử nghiệm dược lý 45

Trang 7

2.5 Thử giới hạn nhiễm khuẩn 47

2.6 Theo dõi độ ổn định của cao hỗn hợp dược liệu chiết nước HHB 47

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 49

3.1 Nội dung 1 49

3.1.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu 49

3.1.2 Kết quả chiết xuất các loại cao dược liệu 80

3.1.3 Kết quả các thử nghiệm dược lý 82

3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao dược liệu có tính an toàn và có tác dụng dược lý tốt nhất 94

3.2.1 Chiết xuất 2 mẫu cao nước hỗn hợp các dược liệu có công thức có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất theo quy trình đã chọn 94

3.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao dược liệu có tác dụng dược lý cao HHB 96

3.2.3 Thử giới hạn nhiễm khuẩn 108

3.2.4 Khảo sát 3 mẫu cao hỗn hợp dược liệu chiết nước HHB, HHB2, HHB3 108

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 114

4.1 Kết luận 114

4.2 Đề nghị 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO TK 1

Trang 8

DĐVN Dược Điển Việt Nam

TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

HHA Cao chiết cồn hỗn hợp các dược liệu

HHB Cao chiết nước hỗn hợp các dược liệu

CHA Cao chiết cồn quả Mướp đắng

STA Cao chiết cồn Râu mèo

PUD Cao chiết cồn Mắc cỡ

HHA Cao chiết cồn hỗn hợp các dược liệu

HHB Cao chiết nước hỗn hợp các dược liệu (mẫu 1) HHB2 Cao chiết nước hỗn hợp các dược liệu (mẫu 2) HHB3 Cao chiết nước hỗn hợp các dược liệu (mẫu 3)

Trang 9

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Quả và hạt Mướp đắng tươi 49

Hình 2 Đặc điểm giải phẫu quả Mướp đắng xem dưới vật kính 40X 50

Hình 3 Thành phần bột Mướp đắng xem dưới vật kính 40X 50

Hình 4 Sắc ký đồ kiểm tra charantin trong nguyên liệu 52

Hình 5 Sắc ký đồ mẫu trắng 53

Hình 6 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 53

Hình 7 Sắc ký đồ mẫu thử 53

Hình 8 Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn 54

Hình 9 Đường biểu diển quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ 55

Hình 10 Cây Râu mèo 58

Hình 11 Toàn vi phẫucủa lá cây Râu mèo 59

Hình 12 Đặc điểm vi phẫu lá cây Râu mèo 60

Hình 13 Toàn vi phẫu cuống lá Râu mèo 61

Hình 14 Đặc điểm vi phẫu cuống lá Râu mèo 61

Hình 15 Các cấu tử trong bột dược liệu Râu mèo 62

Hình 16 Sắc ký đồ nguyên liệu so với dược liệu đối chiếu 64

Hình 17 Sắc ký đồ sự hiện diện của sinensetin trong nguyên liệu Râu mèo 66

Hình 18 Sắc ký đồ sự hiện diện acid oleanolic của nguyên liệu 66

Hình 22 Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn sinensetin 68

Hình 24 Vi phẫu Mắc cỡ 72

Hình 25 Các cấu tử trong bột dược liệu Mắc cỡ 73

Hình 26 Sắc ký đồ nguyên liệu so với dược liệu đối chiếu 75

Trang 10

Hình 30 Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn 76

Hình 32 Tác dụng hạ glucose huyết của cao cồn Mướp đắng 87

Hình 33.Tác dụng hạ glucose huyết của cao cồn Râu mèo 89

Hình 34.Tác dụng hạ glucose huyết của cao cồn Mắc cỡ 90

Hình 35 Tác dụng hạ glucose huyết của cao cồn hỗn hợp dược liệu HHA 91

Hình 36 Nồng độ glucose huyết (mmol/ L) sau TN 92

Hình 37 Sắc ký đồ sự hiện diện của Mướp đắng trong cao HHB 97

Hình 40 Sắc ký đồ sự hiện diện của Râu mèo trong cao HHB 98

Hình 43 Sắc ký đồ sự hiện diện của Mắc cỡ trong cao HHB 100

Hình 46 Sắc ký đồ sự hiện diện của sinensetin trong cao HHB 102

Hình 49 Sắc ký đồ sự hiện diện của charantin trong cao HHB 104

Hình 53 Sắc ký đồ của charantin trong cao 106

Hình 54 Sắc ký đồ mẫu sinensetin chuẩn 107

Hình 55 Sắc ký đồ của sinensetin trong cao HHB 107

Trang 11

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Một số sản phẩm từ Mướp đắng 11

Bảng 2 Một số sản phẩm từ Râu mèo 14

Bảng 3 Sản phẩm từ cây Mắc cỡ 16

Bảng 4 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc 29

Bảng 7 Kết quả độ ẩm bột quả Mướp đắng 51

Bảng 8 Độ tro toàn phần bột quả Mướp đắng 51

Bảng 9 Số liệu độ tro không tan trong acid của bột quả Mướp đắng 51

Bảng 10 Kết quả xác định khoảng tuyến tính của charantin 54

Bảng 11 Kết quả xác định độ đúng 56

Bảng 12 Kết quả phân tích tính tương thích hợp hệ thống 57

Bảng 13 Kết quả độ lặp lại 58

Bảng 14 Kết quả độ ẩm nguyên liệu 63

Bảng 15 Kết quả độ tro toàn phần của nguyên liệu 63

Bảng 16 Kết quả độ tro không tan trong acid của nguyên liệu 63

Bảng 17 Kết quả xác định khoảng tuyến tính 69

Bảng 19 Kết quả phân tích tính thích hợp hệ thống 71

Bảng 21 Độ ẩm của dược liệu Mắc cỡ 74

Bảng 22 Độ tro toàn phần của dược liệu Mắc cỡ 74

Bảng 23 Độ tro không tan trong acid của dược liệu Mắc cỡ 74

Bảng 24 Các thông số sắc ký của mẫu chuẩn và mẫu thử 77

Bảng 25 Kết quả xác định khoảng tuyến tính 77

Bảng 27 Kết quả phân tích tính thích hợp hệ thống 79

Bảng 29 Kết quả chiết xuất các loại cao dược liệu 81

Bảng 30 Số liệu thử độc tính cấp của cao chiết CHA 82

Bảng 31 Số liệu thử độc tính cấp mẫu cao STA 83

Trang 12

Bảng 32 Số liệu thử độc tính cấp mẫu caoPUD 84

Bảng 33 Số liệu thử độc tính cấp của cao HHA 84

Bảng 34 Số liệu thử độc tính cấp của cao hỗn hợp dược liệu (Cao HHB) 85

Bảng 35 Tác dụng hạ glucose huyết của mẫu CHA 87

Bảng 36 Tác dụng hạ glucose huyết của mẫu STA 88

Bảng 37 Sự thay đổi nồng độ glucose huyết (mmol/L) của các nhóm trước và sau thực nghiệm 89

Bảng 38 Tác dụng hạ glucose huyết của cao HHA 91

Bảng 40 Kết quả chiết xuất các mẫu cao nước HHB2, HHB3 95

Bảng 41 Kết quả độ ẩm cao HHB 96

Bảng 42.Kết quả độ tro cao HHB 96

Bảng 43 Kết quả định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học 96

Bảng 44 Kết quả định tính hợp chất alkaloid bằng phản ứng hóa học 96

Bảng 45 Kết quả hàm lượng charantin trong cao dược liệu 106

Bảng 46 Kết quả hàm lượng sinensetin trong cao HHB 107

Bảng 47 Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn mẫu cao HHB 108

Bảng 48 Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn của 3 mẫu cao HHB, HHB1, HHB2 108

Bảng 50 Chất lượng của các mẫu cao HHB, HHB2, HHB3 111

Bảng 51 Độ ổn định của mẫu cao HHB (thời gian từ tháng 5/2015 đến tháng 5/2016) 113

Trang 13

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1 Quy trình chiết xuất cao cồn 36

Sơ đồ 2 Quy trình chiết xuất cao nước 38

Sơ đồ 3 Quy trình chiết mẫu dược liệu sử dụng chấm sắc ký 41

Sơ đồ 4 Quy trình chiết xuất cao nước 94

Trang 14

Chủ nhiệm đề tài: ThS Dương Thị Mộng Ngọc

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Sâm & Dược liệu TP HCM

Thực hiện Hợp đồng đặt hàng số: 41/HĐĐH-SKHCN ngày 27 tháng 6 năm

2014

Thời gian thực hiện hợp đồng: 6/2014 – 6/2016

Kinh phí được duyệt: 970.000.000 đ

Kinh phí đã cấp:

- 485.000.000 đ theo thông báo số 67/TB-SKHCN ngày 13/6/2014

- 291.000.000 đ theo thông báo số 178/TB-SKHCN ngày 11/9/2015 Mục tiêu: (Theo đề cương đã duyệt):

Nghiên cứu điều chế và thử nghiệm tác dụng hạ đường huyết của cao dược liệu từ Râu mèo, Mướp đắng và Mắc cỡ, đảm bảo được tính khả thi công nghệ và có hiệu quả kinh tế

Nội dung: (Theo đề cương đã duyệt):

1 Nội dung 1: Nghiên cứu công thức chế phẩmđảm bảo tính khả thi công nghệ, có hiệu quả kinh tế và có tác dụng dược lý hạ đường huyết

1.1 Tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu

Các nguyên liệu nghiên cứu phải đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam IV hoặc phải đạt theo tiêu chuẩn cơ sở nhóm nghiên cứu xây dựng đối với nguyên liệu chưa có trong chuyên luận Dược Điển Việt Nam IV

Trang 15

TT Các nội dung, công việc chủ yếu cần được thực hiện

1.2 Nghiên cứu quy trình chiết xuất với các dung môi khác nhau: cồn

Quy trình chiết xuất có 2 công thức khác nhau

1.3 Khảo sát độc tính cấp của công thức

Xác định được liều gây độc tính cấp (LD50), hoặc liều tối đa cho uống nhưng không gây chết chuột thử nghiệm (Dmax)

1.4 Nghiên cứu, phân tích, sàng lọc liều của các công thức xác định liều thử nghiệm dược lý tiếp theo thử tác dụng dược lý

Xác định sơ bộ các liều để thử tác dụng dược lý

1.5 Khảo sát tác dụng hạ đường huyết trên mô hình thực nghiệm gây tăng đường huyết của các công thức để lựa chọn công thức an toàn và có hiệu quả nhất (công thức được chọn gọi là: chế phẩm) Xác định được liều an toàn của chế phẩm có tác dụng hạ đường huyết trên các mô hình gây tăng đường huyết thực nghiệm

2 Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm có tính an toàn và có tác dụng dược lý tốt nhất

2.1 Chiết xuất 2 lô có công thức có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất theo quy trình đã chọn

Quy trình chiết xuất đảm bảo tính khả thi công nghệ, có hiệu quả kinh tế

2.2 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao dược liệu

Cao dược liệu phải đạt theo tiêu chuẩn cơ sở nhóm nghiên cứu xây dựng

2.3 Theo dõi độ ổn định về chất lượng của 3 lô cao dược liệu trong điều kiện tự nhiên trong thời gian 12 tháng

Trang 16

TT Các nội dung, công việc chủ yếu cần được thực hiện

Cao dược liệu phải có chất lượng ổn định trong điều kiện tự nhiên

trong thời gian theo dõi

2.4 Khảo sát tính ổn định về tác dụng hạ đường huyết trên mô hình

thực nghiệm gây tăng đường huyết của cao dược liệu

Xác định được tính ổn định về tác dụng hạ đường huyết trên các

mô hình gây tăng đường huyết thực nghiệm của 3 lô cao dược liệu

Những nội dung đã thực hiện ở giai đoạn 1 (từ tháng 6/2014 đến 6/2015) (Phụ lục số 3 của bản hợp đồng)

I Giai đoạn 1: từ tháng 6/2014 đến tháng 6/2015 - Kinh phí: 485.000.000

đồng

1 Nội dung 1: Nghiên cứu công

thức chế phẩm đảm bảo tính

khả thi công nghệ, có hiệu quả

kinh tế và có tác dụng dược lý

hạ đường huyết

2 Thu mua, xử lý, tiêu chuẩn hóa

nguồn nguyên liệu

Các nguyên liệu nghiên cứu phải đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam IV hoặc phải đạt theo tiêu chuẩn cơ sở nhóm nghiên cứu xây dựng đối với nguyên liệu chưa có trong chuyên luận Dược Điển Việt Nam IV

Đã hoàn thành

3 Nghiên cứu quy trình chiết xuất

với 2 phương pháp khác nhau đạt

hiệu quả và kinh tế

Quy trình chiết xuất có 2 công thức khác nhau

Đã hoàn thành

Trang 17

TT Nội dung thực hiện Sản phẩm cần đạt Kết quả

5 Nghiên cứu, phân tích, sàng lọc

liều của các công thức xác định

liều thử nghiệm dược lý tiếp theo

thử tác dụng dược lý

Xác định sơ bộ các liều để thử tác dụng dược lý

Đã hoàn thành

thành

6 Khảo sát tác dụng hạ đường

huyết trên mô hình thực nghiệm

gây tăng đường huyết của các

công thức phối hợp để lựa chọn

công thức an toàn và có hiệu quả

nhất

Xác định được liều an toàn của chế phẩm có tác dụng hạ đường huyết trên các mô hình gây tăng đường huyết thực nghiệm

Đã hoàn thành

thành

II Giai đoạn 2: từ tháng 7/2015 đến tháng 6/2016

1 Nội dung 2: Nghiên cứu xây

dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm

cao dược liệu có tính an toàn và

có tác dụng dược lý tốt nhất

Trang 18

TT Nội dung thực hiện Sản phẩm cần đạt Kết quả

2 Chiết xuất 2 lô có công thức có

tác dụng hạ đường huyết tốt nhất

theo quy trình đã chọn

Quy trình chiết xuất đảm bảo tính khả thi công nghệ, có hiệu quả kinh tế,

Đã hoàn thành

3 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm

nghiệm cao dược liệu

Cao dược liệu phải đạt theo tiêu chuẩn cơ sở nhóm nghiên cứu xây dựng

Đã hoàn thành

4 Theo dõi độ ổn định của lô chiết

cao theo thời gian trong điều kiện

5 Khảo sát độ ổn định về của các

mẫu cao chiết về tác dụng hạ

đường huyết trên mô hình gây

tăng đường huyết thực nghiệm

Xác định được tính ổn định về tác dụng hạ đường huyết trên

mô hình gây tăng đường huyết thực nghiệm của 3 lô cao dược liệu

Đã hoàn thành

Báo cáo tổng kết và nghiệm thu

cơ sở

Hồ sơ nghiệm thu cấp cơ sở Đã hoàn

thành Báo cáo tổng kết và nghiệm thu

chính thức tại cơ quan quản lý đề

tài

Báo cáo toàn văn, báo cáo tóm tắt, dĩa CD

Đã hoàn thành

Danh sách những cơ quan phối hợp:

- Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Khoa xét nghiệm - Trung tâm Y

tế Dự phòng Long An

- Phòng Dược lý – Hóa sinh Viện Dược liệu

Danh sách những người thực hiện chính:

01 Trung Tâm Sâm & Dược liệu TP HCM ThS Dương Thị Mộng Ngọc

02 Trung Tâm Sâm & Dược liệu TP HCM ThS Nguyễn Thị Ngọc Đan

03 Trung Tâm Sâm & Dược liệu TP HCM CN Nguyễn Văn Trí

Trang 19

STT CƠ QUAN CÁN BỘ NGHIÊN CỨU

04 Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Khoa xét

nghiệm - Trung tâm Y tế Dự phòng Long An

ThS Lê Minh Triết

05 Phòng Dược lý - Hóa sinh

Viện Dược liệu – Hà Nội

TS Phạm thị Nguyệt Hằng

ThS Phí Thị Xuyến

ThS Nguyễn Thị Phượng

ThS Đỗ Thị Phương

Trang 20

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tình hình bệnh đái tháo đường [4, 18, 42]

- Định nghĩa

ĐTĐ một nhóm các bệnh lý chuyển hóa đặc trưng bởi tăng glucose huyết

do khiếm khuyết tiết insulin, khiếm khuyến hoạt động insulin hoặc cả hai Tình trạng tăng glucose mạn tính trong ĐTĐ sẽ gây tổn thương, rối loạn chức năng, suy yếu nhiều cơ quan, đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu

- Phân loại:

ĐTĐ được phân thành hai loại chính:

 ĐTĐ type 1 hay ĐTĐ phụ thuộc insulin, Tỷ lệ mắc bệnh 10 – 15%

 ĐTĐ type 2: kháng insulin hay “nghèo” insulin, tỷ lệ mắc bệnh 85-90% Ngoài ra, ĐTĐ còn có những nhóm khác như:

 ĐTĐ đặc biệt hay còn gọi là ĐTĐ thứ phát: xuất phát từ các bệnh ở tuyến tụy, bệnh nội tiết như bệnh Cushing, thậm chí có thể là do bất thường trong di truyền

 ĐTĐ thai kỳ: là tình trạng rối loạn dung nạp glucose được phát hiện lần đầu tiên trong thai kỳ, với tỷ lệ 3 – 5% số phụ nữ có thai

 Rối loạn chuyển hóa glucose huyết

- Dịch tễ học

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới, và theo liên đoàn ĐTĐ quốc tế - IDF (International Diabetes Federation), trong năm 2012 toàn cầu hiện nay

có trên 371 triệu người mắc bệnh ĐTĐ và dự báo con số này sẽ tăng lên

552 triệu người vào năm 2030 Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ càng cao khi tuổi càng cao (>65 tuổi) Tỷ lệ bệnh ĐTĐở Việt Nam tăng rất nhanh Năm 2011, số người mắc bệnh ĐTĐlà 1,7 triệu người, năm 2012 con số này đã tăng lên 3,16 triệu người Việt Nam nằm trong nhóm nước có tỷ lệ bệnh đái tháo

đường tăng nhanh nhất trên thế giới (Thông báo của GS.Phạm Song, Chủ tịch Tổng Hội y học Việt Nam tại hội thảo “Công bố dự án xã hội hoá hoạt động truyền thông chương trình mục tiêu quốc gia phòng, chống bệnh đái tháo đường” ngày 27/8/2011 tại Hà Nội)

Trang 21

- Biến chứng

Phần lớn bệnh nhân đái tháo đường đang phải đối mặt với các biến chứng của bệnh, đặc biệt là các biến chứng mãn tính như: biến chứng hư thận, hư võng mạc mắt, tim mạch tổn thương, nhiễm trùng … Hậu quả của biến chứng thường nặng nề, để lại cho gia đình và người bệnh gánh nặng về chi phí, đồng thời còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống và đặc biệt là hàng năm thế giới mất một nguồn lao động rất đáng kể do giảm 5-10 năm tuổi thọ

- Điều trị

Hiện nay, để điều trị các bệnh đái tháo đường, bệnh nhân phải dùng thường xuyên các dược phẩm tây y đắt tiền như diamicron, glucophase, insulin bên cạnh vấn đề tốn kém về tiền bạc do phải điều trị suốt đời, các dược phẩm tây y thường

để lại những tác dụng phụ đáng kể ảnh hưởng đến thể trạng chung cho người bệnh, đặc biệt gây tổn hại gan và thận, đây là các cơ quan thanh lọc chất độc cho cơ thể Chính vì thế, xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới từ thảo dược trên thế giới ngày càng tăng Điều này thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu tìm kiếm nguồn thuốc từ hợp chất tự nhiên có hiệu quả điều trị bệnh đái tháo đường an toàn hơn mà không gây tác dụng phụ, điển hình như bài thuốc thang của lương y Đinh Bá Luyện đã được sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường trong nhân dân, gồm 3 dược liệu là: Râu mèo tươi (50 g), Mướp đắng tươi (50 g), Cây Mắc cỡ khô (06 g) Dùng 1,5 L nước sắc còn 200 mL, uống hàng ngày, trong vòng

Tên nước ngoài: Bitter melon, bitter gourd (Anh), balsam (Mỹ)

Tên Việt Nam: Mướp đắng, Khổ qua

Mô tả thực vật

Cây Mướp đắng thuộc loại dây leo, dây bò dài 5 - 7 m, thân màu xanh nhạt

có góc cạnh, leo được nhờ có nhiều tua cuốn, ở ngọn có lông tơ Lá đơn, nhám, mọc sole, dài 5 - 10 cm, rộng 4 - 8 cm, phiến lá mỏng chia làm 5 - 7 thùy hình

Trang 22

trứng, mép có răng cưa đều, mặt dưới lá màu xanh nhạt hơn mặt trên lá, gân lá nổi

rõ ở mặt dưới, phiến lá có lông ngắn Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái cùng gốc, có cuống dài

Trái hình thoi, dài 5 - 8 cm, gốc và đầu thuôn nhọn Mặt vỏ có nhiều u lồi

to nhỏ không đều Trái khi chưa chín có màu xanh hoặc xanh vàng nhạt, khi chín

có màu vàng hồng Khi chín, trái nứt dần ra từ đầu, tách ra làm ba phần để lộ chùm áo hạt màu đỏ bên trong

Hạt dẹt, dài 13 - 15 mm, rộng 7 - 8 mm, hình răng ngựa, thắt đột ngột ở hai đầu Vỏ hạt cứng, quanh hạt có màng màu đỏ như màng hạt gấc

Quả, lá, hạt Quả thu hái khi có màu vàng lục dùng tươi Hạt lấy ở quả chín, phơi khô Lá và rễ thu hái quanh năm dùng tươi

Thành phần hóa học của quả Mướp đắng

Quả Mướp đắng chứa các triterpen khung cucurbitan tồn tại cả dưới dạng aglycon và dạng glycosid của chúng, một số triterpen có khung olean kết hợp nhiều phân tử đường có tính chất của saponin (tính tạo bọt, tính phá huyết…) như goyasaponin I,II,III Một số là các sterolid dạng aglycon và dạng glycosid, điển hình như charantin là hỗn hợp 2 steroid glycosid Ngoài ra còn có các acid, các

lipid, các vitamin B1, B2, PP, E, β-caroten, các chất khoáng: Ca, Mg, Cu, Fe…

Hạt Mướp đắng chứa: các triterpenglycosid: momordicosid A, momordicosid B, các hợp chất lectin, các chất béo…

Công dụng

Khả năng hạ đường huyết được nghiên cứu chứng minh ở thú vật và người Trong quả Mướp đắng, có ít nhất 3 nhóm thành phần hóa học có tác dụng hạ đường máu và những tác dụng khác có lợi cho việc điều trị bệnh đái tháo đường Những thành phần này gồm một hỗn hợp những glycosid steroid gọi là charantin, những peptid tác dụng kiểu insulin, và những alkaloid Cơ chế tác dụng bao gồm giảm đường huyết và cải thiện dung nạp glucose

Ở Ấn Độ, Philippin, Puerto Rico quả Mướp đắng dùng làm thuốc trị đái tháo đường

Quả Mướp đắng còn xanh, thái mỏng, phơi khô, tán bột Mỗi ngày uống 10

- 20 g, chia làm 2 – 3 lần, chữa đái tháo đường type 2

Trang 23

Ngoài ra, cây Mướp đắng còn có tác dụng chống lại các gốc tự do làm nguyên nhân gây lão hóa và phát sinh các bệnh tim mạch, tăng huyết áp, rối loạn lipd máu, tổn thương thần kinh, viêm đường tiết niệu, đái tháo đường, và trị các bệnh về da

Các công trình nghiên cứu trong nước và nước ngoài

o Các công trình nghiên cứu trong nước

- Đoàn Thị Nhu và cộng sự đã xác định được chế phẩm Morantin điều chế từ quả Mướp đắng không thể hiện độc tính và có tác dụng hạ glucose huyết 28,47% trên mô hình thỏ gây tăng đường huyết bằng alloxan [7]

- Mai Phương Mai, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Thị Hạnh đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết của cao quả Mướp đắng trên mô hình gây tăng đường huyết thực nghiệm bằng streptozotocin trên chuột nhắt [6]

- Nguyễn Thị Hoàng Diễm, Võ Phùng Nguyên, Nguyễn Thị Bay đã nghiên cứu bài thuốc Khổ qua có tác dụng làm giảm 25,93% glucose huyết của chuột sau khi sử dụng thuốc này 11 ngày Tác động này được đối chứng với tác động của gliclazid sau khi dùng 11 ngày là 50,21% [3]

- Hứa Hoàng Oanh, Nguyễn Quỳnh Hương đã chứng minh viên nang Khổ qua – Đa búp đỏ ở liều 60g/kg/ngày có tác dụng làm giảm 25,7% glucose huyết vào ngày thứ 8 trên chuột nhắt trắng gây tăng đường huyết bằng alloxan và có hiệu quả tương đương gliclazid (ở liều 0,3mg/kg/ngày hạ 31,18% glucose huyết vào ngày thứ 8) [7]

- Nguyễn Thị Nguyên Sinh, Nguyễn Phương Dung đã chứng minh cao chiết Khổ qua - Đậu bắp trên chuột nhắt trắng có tác dụng làm giảm glucose huyết từ 33,91 % sau khi dùng 21 ngày trên chuột nhắt trắng và có hiệu quả

hạ đường huyết tương đương Daonil (ở liều 0,3mg/kg/ngày hạ glucose huyết 36,33% sau ngày thứ 21) [8]

o Các công trình nghiên cứu nước ngoài

- Tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết quả Mướp đắng hoặc khi khẩu phần ăn hàng ngày có thêm 10% bột quả Mướp đắng, có dụng hạ đường huyết đáng kể trên mô hình gây tăng glucose huyết bằng streptozotocin hay alloxan [16, 19, 26, 30, 39]

Trang 24

- Nilesh K Rai và cộng sự đã chứng minh có sự tương quan giữa nồng độ các nguyên tử Na, K, Mg, Ca, Fe, Al trong cao chiết nước quả Mướp đắng

và vai trò của chúng trong kiểm soát lượng đường huyết trên mô hình đái tháo đường thực nghiệm [35]

- Ngoài tác dụng hạ đường huyết, các nhà khoa học cũng đã chứng minh được một số tác dụng dược lý khác các của quả Mướp đắng: Điều hòa rối loạn chuyển hóa lipid, kháng khuẩn, kháng nấm, bảo vệ gan, kháng oxy hoá [22, 36, 38]

Nơi sản xuất: Công Ty Cổ

Phần Dược phẩm Việt Đức

KHÁNG ĐƯỜNG ẨM

Thành phần : Bằng lăng, Mướp đắng và chè xanh

Nơi sản xuất: Xí nghiệp Dược phẩm 120

1.2.2 Cây Râu mèo [9]

Tên khoa học: Orthosiphon stamineus Benth

Tên nước ngoài: Ở nhiều vùng khác nhau O stamineus Benth còn được

biết đến với nhiều tên gọi như Misai Kucing (Malaysia); Balbas - pusa hoặc Kabling - gubat (Philippines); Kapen prey (Campuchia); Hnwàdméew (Lào); Ha Yaa Nuat Maeo, Rau Meo hoặc Cay Bac (Thái Lan); Kumis Kucing hoặc Remujung (Indonesia); Moustaches de Chat (Pháp); trà Java (châu Âu)

Tên Việt Nam: Râu mèo hoặc Bông bạc

Trang 25

Họ: Hoa môi (Lamiaceae)

Đặc điểm thực vật

Râu mèo là loại cây thảo lâu năm cao 30 - 60 cm, thân có cạnh ít phân nhánh Lá mọc đối chéo chữ thập, các cặp lá hơi xa nhau, có cuống ngắn (0,5 - 2 cm), phiến lá gần hình thoi, dài 4 - 8 cm, rộng 2 - 4 cm, mép lá có răng cưa ở 2/3 phía trên Ở một số chủng thì có cuống và thân chính giữa màu tía Cụm hoa ở ngọn, thưa gồm 6 - 10 vòng, mỗi vòng có 6 hoa Đài hình chuông có 5 răng Tràng

2 môi màu trắng hay lơ nhạt, nhị mọc thò ra ngoài gấp 2 - 3 lần tràng trông như Râu mèo Quả bế tư, nhỏ nhẵn Mùa hoa quả vào tháng 4 - 7 (Ngô Vân Thu và Trần Hùng, 2011)

- Cây Râu mèo có chứa coumarin là esculetin (6,7 - dihydroxy benzo-α-pyron)

Lá và ngọn cây chứa acid caffeic và các dẫn chất của acid caffeic, chủ yếu là acid rosmarinic Acid rosmarinic là depsid của acid caffeic với acid α-hydroxydihydrocaffeic và là thành phần hay gặp trong họ Lamiaceae

- Lá Râu mèo chứa một saponin, một alcaloid, tinh dầu 0,2 - 0,6%, tanin và acid hữu cơ (acid tartric, acid citric và acid glycolic) Saponin khi thủy phân cho sapogenin và đường arabinose và glucose (hoặc fructose) Lá cây có hàm lượng kali cao (0,7 - 0,8%) và một glycosid đắng là orthosiphonin Ngoài ra,

Râu mèo còn chứa các thành phần khác như: betain, cholin, β - sitosterol, các

protein có hoạt tính sinh học và các alcol triterpenoid (acid oleanolic, acid ursolic, acid betulinic) và một số chất khác

Công dụng

- Theo kinh nghiệm dân gian, Râu mèo được dùng làm thuốc lợi tiểu trong điều trị bệnh viêm thận, sỏi thận, sỏi mật, tê thấp, phù thũng, viêm gan

Trang 26

Ngoài ra, Râu mèo còn có tác dụng tốt đối với các bệnh đường tiêu hóa, bệnh gout, thấp khớp, đau lưng, đau nhức khớp xương

- Cao lỏng Râu mèo được dùng làm thuốchạ đường huyết trong bệnh đái tháo đường

- Bài thuốc hỗ trợ điều trị đái tháo đường (của lương y Đinh Bá Luyện): Râu mèo (tươi) 50 g, kết hợp Khổ qua (dây, lá, quả non, tươi) 50 g, Mắc cỡ (sao vàng) 6 g Tất cả rửa sạch, cho 800 mL nước sắc còn 250 mL, uống trong ngày, liên tục 1 tháng, sau đó đi kiểm tra máu

Các công trình nghiên cứu

- K Sriplang, Yakugaku Zasshi đã chứng minh được cao nước lá Râu mèocó tác dụng làm giảm tăng đường huyết và cải tiến sự rối loạn chuyển hóa lipid

ở mô hình gây tăng glucose huyết bằng streptozotocin [21, 43].

- Mohamed EA, Mohamed AJ, Asmawi MZ, Sadikun A, Ebrika OS, Yam

MF đã chiết tách được Cƒ2-B (Cloroform fraction 2-B) (Một phân đoạn được chiết tách từ cao cloroform lá Râu mèo gồm: hợp chất terpenoid và flavonoid bao gồm sinensetin) ở liều 1 g/kg thể trọng chuột có tác dụng chống tăng đường huyết ở mô hình gây tăng glucose huyết bằng glucose

150 mg/kg thể trọng [27]

- Ngoài tác dụng hạ đường huyết, các nhà khoa học cũng đã chứng minh được một số tác dụng dược lý khác các của Râu mèo: Kháng oxy hóa, kháng khuẩn, tăng cường miễn dịch, bảo vệ gan, bảo vệ thận, điều hòa lipid máu trong các trường hợp rối loạn chuyển hóa lipid, lợi tiểu, chống tăng huyết áp [15, 40, 44]

Trang 27

Một số sản phẩm từ Râu mèo

Bảng 2 Một số sản phẩm từ Râu mèo

Kim tiền thảo - Râu mèo

Thành phần: Kim tiền thảo và Râu mèo

Công dụng: Chữa các bệnh đường tiết

Nơi sản xuất: Trung Tâm Nghiên Cứu

Cây Trồng & Chế Biến Cây Thuốc Hà Nội

1.2.3 Mắc cỡ [9]

Phân loại thực vật

- Tên khoa học: Mimosa pudica Linn

- Tên nước ngoài: Sensitive plant, humble plant, mimosa, shamebush (Anh), sensitive (Pháp)

- Tên Việt Nam: Trinh nữ, cỏ thẹn, hàm tu thảo, cây xấu hổ, nhả nả nhẻn (Tày), Mắc cỡ

- Họ: Trinh nữ (Mimosaceae)

Mô tả

Cây nhỏ, mọc thành bụi lớn, cao 30-40 cm Thân cành lòa xòa, uốn éo, có lông

và gai nhỏ Lá kép chân vịt, mọc so le, có cuống dài, mang 4 nhánh lá chét xếp lông chim, lá chét nhỏ ở gốc và đầu nhánh, to hơn ở phần giữa, tất cả đều cụp lại khi đụng phải

Cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm rất nhiều hoa nhỏ xếp thành đầu tròn, màu tím hồng, đài nhỏ hình đấu, tràng 4 cánh dính nhau ở nửa dưới, nhị 4, rất mảnh, bầu 4 noãn Quả thắt lại giữa các hạt, có nhiều lông cứng

Mùa hoa quả: tháng 6-8

Trang 28

Phân bố, sinh thái

- Chi Mimosa có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu

vực nhiệt đới châu Mỹ, châu Phi và châu Á Ở Việt Nam có 4 loài, trong

đó có cây Mắc cỡ Ở Việt Nam, Mắc cỡ phân bố rải rác ở khắp nơi, từ đồng bằng đến miền núi độ cao dưới 1000m

- Hạt Mắc cỡ chứa hạt nhầy (17%) gồm các thành phần D- xylose và acid D-glucuronic Thành phần chất dầu béo gồm các acid palmitic 8,7%,

stearic 8,90%, oleic 31,0%; linoleic 51%; linolenic 0,4%, dầu béo này tương tự như dầu đậu tương và có thể có cùng một công dụng

Công dụng

- Cả cây Mắc cỡ được dùng chữa suy nhược thần kinh, mất ngủ, viêm phế quản, viêm kết mạc cấp, viêm gan, viêm dạ dày – ruột, phong thấp tê bại, bệnh gút, sốt, cao huyết áp Ngày 15-25g sắc uống

- Dùng ngoài trị chấn thương, viêm mủ da Lấy cây tươi, giã, đắp rễ và hạt chữa hen suyễn và gây nôn Rễ còn chữa sốt rét, kinh nguyệt không đều

- Chú ý: theo y học cổ truyền, Mắc cỡ có tác dụng gây tê, mê, không được dùng liều cao Phụ nữ có thai cũng không được dùng Mắc cỡ

Các công trình nghiên cứu

- Umamaheswari S, Mainzen Prince PS cho thấy việc kết hợp 8 dược liệu

cổ truyền của Ấn Độ (trong đó có lá Mắc cỡ) có hiệu quả điều trị tăng đường huyết ở mô hình thực nghiệm tốt hơn là sử dụng riêng từng cây thuốc [41]

Trang 29

- N.G Sutar, Manosroi J và cộng sự đã chứng minh được cao chiết ethanol

từ lá Mắc cỡ có tác dụng làm giảm lượng đường huyết đáng kể trên mô hình gây tăng glucose huyết thực nghiệm bằng alloxan, đối chứng với Metformin [34]

- Ngoài tác dụng hạ đường huyết, các nhà khoa học cũng đã chứng minh được một số tác dụng dược lý khác các của Mắc cỡ: kháng ung thư, bảo vệ gan, kháng oxy hóa, kháng khuẩn [13, 23, 33, 37]

OPC

Ilogen

Ilogen Excel kết hợp từ 8 loại thảo mộc trong

đó có mắc cỡ giúp chữa trị bệnh tiểu đường phụ thuộc insulin,bảo vệ gan và thận

Nơi sản xuất: Pankajakasthuri Herbals India (P)

Ltd

Trà Trinh nữ

Được chế biến từ cây mắc cỡ (cây trinh nữ) kết hợp với lạc tiên, lá sen - Là thức uống giải khát dùng thường xuyên có công dụng dưỡng tâm,

Trang 30

1.3 Tổng quan về các phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm

Các phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm bằng cách cắt bỏ tuyến tụy [14]

- Cắt bỏ hoàn toàn tuyến tụy: chó bị cắt bỏ hoàn toàn tuyến tụy biểu hiện tình trạng bệnh với những triệu chứng điển hình như: khát nhiều, tiểu nhiều, gầy nhiều và sẽ chết trong khoảng từ 10 đến 30 ngày trong tình trạng kiệt sức

- Cắt bỏ một phần tuyến tụy: mức độ nghiệm trọng của bệnh tỷ lệ thuận với phần tụy bị cắt bỏ Tuy nhiên, tình trạng bệnh có thể được cải thiện do hoạt động bù trừ, cũng có thể trầm trọng hơn do sự hoại tử của những tế bào còn lại

Gây đái tháo đường bằng hormon [12]

Một số hormon vỏ thượng thận, hormon tuyến giáp, hormon tuyến yên có thể gây tình trạng ĐTĐ như trên chó và mèo Tình trạng bệnh tương tự như ĐTĐ type 1

Gây đái tháo đường bằng virus [14]

Tình trạng nhiễm trùng virus (cytomegalovirus, virus Coxsackie B, virus rubeol) làm biểu hiện một số gen tự miễn kháng tuyến tụy hoặc hoạt hóa tế bào lympho không đặc hiệu ở tuyến tụy, gây ĐTĐ type 1

Thú vật chuyển đổi gen [14, 20]

Những kỹ thuật di truyền cho phép nhận được những thú thử nghiệm như chuột cống Zuker dùng nghiên cứu ĐTĐ

Kháng thể kháng insulin gây tình trạng ĐTĐ [17]

Triệu chứng ĐTĐ ngắn hạn được ghi nhận khi tiêm huyết thanh của chuột lang có chứa kháng thể kháng insulin cho những giống thú vật khác

Gây ĐTĐ bằng những chất hóa học [14, 20]

Có nhiều chất hóa học có thể gây độc trên tế bào β của tuyến tụy như

alloxan, streptozotocin, dithizon, 8-hydroxyquinolon, berryllium nitrat, cyclophosphamid và pentamidin Trong số những chất này, alloxan và streptozotocin được sử dụng nhiều nhất trong thực nghiệm Acid uric, dẫn

xuất quinolon và acid dehydroascorbic cũng phá hủy tế bào β của tuyến tụy

nhưng chúng không được sử dụng trong thực nghiệm

Trang 31

1.4 Tính cấp thiết cần nghiên cứu của đề tài

Bệnh ĐTĐ là bệnh mạn tính đang có xu hướng gia tăng trên thế giới nói chung và ở Việt Nam Phần lớn bệnh nhân đái tháo đường đang phải đối mặt với các biến chứng của bệnh, đặc biệt là các biến chứng mãn tính như: biến chứng hư thận, hư võng mạc mắt, tim mạch tổn thương, nhiễm trùng

… Hậu quả của biến chứng thường nặng nề, để lại cho gia đình và người bệnh gánh nặng về chi phí, đồng thời còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống và đặc biệt là hàng năm thế giới mất một nguồn lao động rất đáng kể do giảm 5-10 năm tuổi thọ

Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO), chi phí để cho việc khám, điều trị và phòng chống bệnh đái tháo đường rất lớn, khoảng 232-

430 tỷ USD/năm Hiện nay, để điều trị các bệnh đái tháo đường, bệnh nhân phải dùng thường xuyên các dược phẩm tây y đắt tiền như diamicron, glucophase, insulin bên cạnh vấn đề tốn kém về tiền bạc do phải điều trị suốt đời, các dược phẩm tây y thường để lại những tác dụng phụ đáng kể ảnh hưởng đến thể trạng chung cho người bệnh, đặc biệt gây tổn hại gan và thận, đây là các cơ quan thanh lọc chất độc cho cơ thể Chính vì thế, xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới từ thảo dược trên thế giới ngày càng tăng

Theo kinh nghiệm dân gian, Việt Nam đã có nhiều bài thuốc điều trị bệnh ĐTĐ hiệu quả, một trong số đó có bài thuốc từ Râu mèo, dây lá quả non Mướp đắng và Mắc cỡ của lương y Đinh Bá Luyện Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam cũng đã có những công trình nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các dược liệu riêng rẽ như quả Mướp đắng, Râu mèo hoặc Mắc cỡ, tuy nhiên, cho đến thời điểm này, chưa có công trình nghiên cứu nào chứng minh tác dụng hạ glucose huyết của cao chiết từ hỗn hợp 3 dược liệu này Chính vì thế, tác dụng chống đái tháo đường của hỗn hợp các dược liệu này cần phải được nghiên cứu một cách khoa học trên các thực nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng, nhằm hướng đến một dược phẩm điều trị bệnh ĐTĐ đảm bảo tính an toàn và hiệu quả là vấn đề rất cần thiết

Trang 32

và hoàn toàn phù hợp với “Chương trình mục tiêu quốc gia phòng, chống bệnh đái tháo đường” mà nhà nước Việt Nam đang thực hiện

Hơn thế nữa, dựa trên sự phân bố rộng rãi của nguồn nguyên liệu (Râu mèo, Mướp đắng, Mắc cỡ), các dược liệu này lại dễ trồng và giá thành rẻ, nếu sự kết hợp 3 dược liệu này có hiệu quả thì sẽ nâng cao giá trị sử dụng nguồn tài nguyên của 3 dược liệu này và cũng sẽ là thành quả góp phần tạo dựng nên một sản phẩm mang thương hiệu Việt Nam phù hợp với đề án đã được Thủ tướng Chính phủ phê duyệt “Phát triển công nghiệp dược và xây dựng mô hình hệ thống cung ứng thuốc của VN giai đoạn 2007-2015 và tầm nhìn đến 2020” tại Quyết định số 43/2007/QĐ-TTg ngày 29/3/2007,

trong đó chỉ rõ: “Phát huy tiềm năng, thế mạnh về dược liệu và thuốc y học

cổ truyền; đẩy mạnh công tác quy hoạch, nuôi trồng và chế biến dược liệu, xây dựng công nghiệp bào chế thuốc từ dược liệu và thuốc y học cổ truyền trở thành một phần quan trọng của ngành Dược Việt Nam; đảm bảo số lượng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu và thuốc y học cổ truyền chiếm 30%

số thuốc được sản xuất trong nước vào năm 2015 và 40% vào năm 2020.”

Dựa vào tính cấp thiết và các cơ sở luận cứ khoa học nêu trên, đề tài

“Nghiên cứu điều chế và thử nghiệm tác dụng hạ đường huyết của cao dược liệu từ Râu mèo, Mướp đắng và Mắc cỡ”được thực hiện nhằm khảo

sát tác dụng làm giảm glucose huyết của các loại cao chiết từ hỗn hợp các dược liệu này, đồng thời qua kết quả của nghiên cứu này sẽ chọn được cao chiết hỗn hợp dược liệu có tác dụng tối ưu để có thể nghiên cứu sâu hơn nhằm phát triển thành một dược phẩm hỗ trợ trong điều trị ở các bệnh nhân

ĐTĐ

1.5 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu điều chế và thử nghiệm tác dụng hạ đường huyết của cao dược liệu từ Râu mèo, Mướp đắng và Mắc cỡ, đảm bảo được tính khả thi công nghệ và có hiệu quả kinh tế

Trang 33

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu

- Dược liệu được rửa, làm sạch tạp chất, phơi khô đến độ ẩm an toàn, sau đó các dược liệu xay thành bột, kích thước qua rây số 2000 (rây có kích thước

2 mm)

- Kiểm nghiệm chất lượng nguyên liệu: theo tiêu chuẩn cơ sở (dựa trên cơ sở các tiêu chuẩn qui định trong Dược Điển Việt nam IV và dựa vào các phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng đặc trưng cho các nhóm chức)

Nhuộm vi phẫu: Dùng phương pháp nhuộm kép carmin - lục iod

Cách tiến hành như sau:

- Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel từ 15 - 30 phút ( cho đến khi thấy lát cắt trở nên trắng), rửa bằng nước cất nhiều lần

- Ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic 1% - 3% trong 2 phút để tẩy javel còn sót lại Rửa bằng nước cất

- Ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch cloral hydrat ( nếu thấy lát cắt chưa thật trắng và trong) khoảng 15 phút Rửa bằng nước cất

- Ngâm vào dung dịch lục iod - carmin khoảng 5 - 10 phút Rửa bằng nước

Trang 34

cất đến khi nước rửa hết màu

- Vi phẫu sau khi nhuộm xong có thể ngâm vào nước cất hay dung dịch glycerin 30% để giữ mẫu được lâu Nếu không cần bảo quản, vi phẫu chuẩn bị xong có thể soi bằng nước hay bằng dung dịch glycerin 30%

- Quan sát dưới kính hiển vi và vẽ hình lại hoặc có thể chụp hình

2.1.1.2 Phương pháp soi bột

- Chuẩn bị mẫu: lấy bộ phận dược liệu cần khảo sát, cắt nhỏ, sấy ở nhiệt độ khoảng 60oC, tán nhỏ, nghiền nát toàn bộ và rây qua rây số 32 cho tới khi tất cả dược liệu trở thành bột mịn

- Cảm quan: màu sắc, mùi vị, độ mịn, nhám, xơ…

- Lên tiêu bản soi bột: Cho một giọt chất lỏng thích hợp vào giữa phiến kính, dùng que sạch trộn đều bột, lấy một ít cho vào giữa giọt chất lỏng, dùng một góc của lá kính khuấy nhẹ để phân tán bột và đậy lá kính lại Lấy ngón tay trỏ di chuyển nhẹ trên lá kính để các phân tử của bột tách rời ra và phân tán đều Loại bỏ phần bột và nước thừa nằm phía ngoài lá kính bằng giấy thấm, lau sạch mặt trên phiến kính và lá kính trước khi soi kính hiển vi

2.1.2 Khảo sát độ tinh khiết[1]

- Tiến hành

Trang 35

Sấy khô bì trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC trong tủ sấy Cân và ghi lại khối lượng

Cân khoảng 2 g dược liệu cho vào bì, đem sấy ở 105oC trong tủ sấy dưới

áp suất thường trong 4 giờ Làm nguội trong bình hút ẩm khoảng 15 phút rồi cân ngay Sấy tiếp và cân sau mỗi 2 giờ, lặp lại đến khi khối lượng không đổi (chênh lệch giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,5 mg) Quy trình được lặp lại 3 lần

- Tính toán

%100

A   

p

a p

trong đó:

A : độ ẩm (khối lượng/khối lượng, %)

p : khối lượng dược liệu trước khi sấy (g)

a : khối lượng dược liệu sau khi sấy (g)

có thể có thêm những tạp chất vô cơ (như đất, cát) lẫn vào dược liệu

Tro toàn phần là khối lượng cắn vô cơ còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một dược liệu Cắn vô cơ cấu tạo chủ yếu là các carbonat và oxyd kim loại

 Tiến hành

Nung một chén nung bằng sứ cho tới khối lượng không đổi (khoảng 2 giờ),

để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén không

Trang 36

Cân khoảng 5 g dược liệu cho vào chén nung Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi dược liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói

Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 500 - 600oC cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen) trong 4 giờ Dùng kẹp sắt lấy chén nung

ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm Cân và ghi lại khối lượng

Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 2 giờ nữa Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén

có tro (a) chênh lệch không quá 0,5 mg

Quy trình được lặp lại 3 lần

 Công thức

Tro toàn phần tính trên nguyên liệu khô kiệt theo công thức:

%100)

b a X

trong đó:

X: tro toàn phần của dược liệu (%)

a: khối lượng chén có tro (g)

b: khối lượng chén không (g)

c: khối lượng dược liệu dùng (g)

A: độ ẩm của dược liệu (%)

2.1.2.3 Độ tro không tan trong acid

Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 9.7

Trang 37

Tập trung chất không tan vào một phễu lọc thủy tinh xốp đã cân bì hoặc vào một giấy lọc không tro Rửa (cả tro và lọc) bằng nước cất nóng tới khi dịch lọc cho phản ứng trung tính (thử bằng giấy quỳ)

Cho cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô, đốt rồi nung ở 500 - 600

oC trong 2 giờ Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân Nung tiếp đến khi giữa hai lần cân liên tiếp, khối lượng chênh lệch nhau không quá 1 mg

Quy trình được lặp lại 3 lần

 Công thức

Tro không tan trong acid trên nguyên liệu khô kiệt được tính theo công thức:

%100)

b a X

trong đó:

X: tro không tan trong acid của cao (%)

a: khối lượng chén có tro (g)

b: khối lượng chén không (g)

c: khối lượng cao dùng (g)

Râu mèo

 Hợp chất flavonoid

Tiến hành:

Trang 38

Cân khoảng 5g bột dược liệu, cho vào cốc có mỏ 100mL, thêm vào 20 mLmethanol, đặt vào bể chiết siêu âm chiết trong vòng 15 phút, lọc qua giấy lọc, lấy dịch lọc thực hiện các phản ứng:

- Lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, dung dịch có màu xanh rêu

- Lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch natri hydroxyd 20%, có sự tăng màu vàng của dịch thử

- Lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch nhôm (III) clorid 5%, có sự tăng màu vàng của dung dịch thử

- Lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg và 1 mL HClđđ, dung dịch thử chuyển màu sang đỏ

 Phản ứng chung của các triterpen

Cân khoảng 5 g bột dược liệu, cho vào cốc có mỏ 125 mL, thêm 30 mL CHCl3 (TT) Chiết trong bể siêu âm trong vòng 15 phút, lọc qua giấy lọc thu dịch lọc, cô cách thủy đến cắn Dùng một ít cắn này cho vào sát đáy một ống nghiệm, thêm vào 1mL anhydrid acetic, 0,5 mL cloroform và vài giọt acid sulfuric đậm đặc theo thành ống nghiệm, mặt phân cách 2 chất lỏng phải có màu đỏ tím

- Ống nghiệm 1: thêm vài giọt thuốc thử Dragendorff, phải xuất hiện tủa màu

đỏ cam

- Ống nghiệm 2: thêm vài giọt thuốc thử Bouchardat, phải xuất hiện tủa màu nâu

Trang 39

- Ống nghiệm 3: thêm vài giọt thuốc thử Mayer phải xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt

2.1.3.2 Định tính các hợp chất hóa thực vật bằng sắc ký lớp mỏng [1]

Quả Mướp đắng

 Kiểm tra sự hiện diện của charantin trong nguyên liệu bằng phương pháp SKLM

Dung dịch thử: Cân khoảng 5 g bột dược liệu, chiết siêu âm với MeOH 20 mL/lần

x 5 lần Lọc và thu dịch chiết Cô trên bếp cách thủy cho cạn bớt rồi chấm sắc ký

Dung dịch chuẩn: Cân 1 mg chuẩn charantin hòa trong 1 mL MeOH thu được dung dịch chuẩn chấm sắc ký

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt ba vết trên bản sắc ký, 10 µl charantin, 10 µl dịch chiết mẫu thử, vết thứ 3 chấm trùng 10 µl charantin và 10 µl dịch chiết mẫu thử Tiến hành chạy sắc ký trên 3 hệ dung môi khai triển

Cloroform – ethyl acetat – methanol (9:1:1)

Toluen – ethyl acetat – methanol (4:3:2)

Cloroform – methanol – benzen (80: 1: 0,5)

Cách phát hiện:

Phun dung dịch H2SO410% trong cồn, sấy ở 105oC trong 5 phút

Quan sát dưới ánh sáng thường

Quan sát dưới đèn UV ở bước sóng 365 nm

Dung dịch đối chiếu: Lấy 1 g Râu mèo (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mẫu thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 l mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký, làm khô bản mỏng và phun hỗn hợp dung dịch acid boric 10 % - dung

Trang 40

dịch acid oxalic 10 % (2: 1), sau đó sấy ở 105 oC đến khi hiện rõ vết Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, vết màu vàng cho phát quang màu xanh lá mạ sáng

 Kiểm tra sự hiện diện sinensetin trong nguyên liệu

Bản mỏng: Silicagel 60F254 (Merck)

Mẫu chuẩn: Cân 1 mg sinensetin và hòa tan với 1 mL MeOH (1 mg/mL)

Mẫu thử: Cân khoảng 5g bột dược liệu, cho vào cốc có mỏ 100mL, thêm vào 20

mL methanol, đặt vào bể chiết siêu âm chiết trong vòng 15 phút, lọc qua giấy lọc

Hệ dung môi triển khai

 Toluen - EtOAc – MeOH (4: 3 :1)

 Cyclohexan - EtOAc - aceton (7: 1: 4)

Quan sát dưới đèn tử Ngọại ở bước sóng 254 nm và 365 nm

Phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, sấy ở 105oC khoảng 10 phút đến khi

xuất hiện rõ vết và quan sát dưới ánh sáng thường

Yêu cầu:Trên sắc ký đồ của mẫu thử và chấm trùng phải xuất hiện một vết có màu sắc và giá trị Rf tương ứng với màu sắc và giá trị Rf của vết trên sắc ký đồ mẫu chuẩn

 Kiểm tra sự hiện diện acid oleanolic trong nguyên liệu

Bản mỏng: Silicagel 60F254 (Merck)

Mẫu chuẩn: Cân 1 mg acid oleanolic và hòa tan với 1 mLcloroform (1 mg/mL) Mẫu thử: Cân 1 g dược liệu và chiết với 5 mLcloroform bằng lắc siêu âm khoảng

10 phút Sau đó, lọc và dùng dịch chiết làm dung dịch thử

Hệ dung môi triển khai

 Toluen: EtOAc (7: 3)

 n-hexan: EtOAc: MeOH (4: 1: 0,1)

Định dạng
Số trang	135
Dung lượng	3,01 MB