tạo mô hình đái tháo đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết từ nấm hoàng chi ganoderma colossum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ==    == ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HUỲNH THỊ THÚY KIỀU TẠO MÔ HÌNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

==    ==

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HUỲNH THỊ THÚY KIỀU

TẠO MÔ HÌNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG VÀ THỦ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA CÁC DỊCH CHIẾT TỪ

NẤM HOÀNG CHI GANODERMA COLOSSUM

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa: 2007-2011

Nha Trang, tháng 07 năm 2011

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học

và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm chỉ dẫn, góp ý và giảng dạy nhiệt tình để tôi có được những kiến thức quý báu vững bước vào chặng đường phía trước

Tôi xin dành lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS Nguyễn Thị Hải Thanh, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện CNSH&MT, Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu, các phương pháp nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Viện chăn nuôi suối Dầu, các thầy cô ở tổ nghiên cứu - Viện CNSH&MT đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn đến em Quỳnh Châu, Thị Ngọc và chị Minh Nhật đã quan tâm, nhiệt tình và giúp đỡ để bài luận văn được hoàn thành

Cuối cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình, bạn bè, các bạn lớp 49 Công nghệ sinh học đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

Nha Trang, tháng 07 năm 2011

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) 3

1.1.1 Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.2 Phân loại và cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ 4

1.2 Đái tháo đường với y học cổ truyền (YHCT) 6

1.2.1 Quan niệm của y học cổ truyền về ĐTĐ 6

1.2.2 Các thuốc đông y điều trị ĐTĐ 6

1.3 Phương pháp gây mô hình ĐTĐ trên động vật thực nghiệm 7

1.3.1 Một số mô hình gây ĐTĐ mô phỏng ĐTĐ type 1 trên động vật thực nghiệm 7

1.3.2 Streptozocin và ứng dụng trong mô hình ĐTĐ type1 8

1.4 Nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum) 9

1.4.1 Đặc điểm chung 9

1.4.2 Phân bố sinh thái 10

1.4.3 Thành phần hóa học [3] 10

1.4.4 Tác dụng dược lý[7] 13

1.4.5 Tình hình nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của nấm Hoàng chi trên Thế giới và ở Việt Nam 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Động vật nghiên cứu 18

2.1.2 Dược liệu nghiên cứu 18

2.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Tạo mô hình ĐTĐ trên chuột nhắt trắng theo kiểu mô phỏng ĐTĐ typ 1 23

2.3.2 Phương pháp định lượng glucose huyết 24

2.3.3 Các phương pháp định tính, định lượng các chất có hoạt tính sinh học trong nấm Hoàng chi25 2.3.4 Các phương pháp ngâm chiết 28

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của dịch chiết trên chuột gây ĐTĐ 28

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả gây ĐTĐ mô phỏng ĐTĐ typ 1 trên chuột nhắt trắng 31

3.1.1 Nồng độ glucose huyết 31

3.1.2 Khả năng dung nạp glucose 33

3.1.3 Khả năng dung nạp glucose sau khi uống các phân đoạn dịch chiết 34

3.2 Khảo sát một số thành phần hóa học cơ bản của quả thể nấm Hoàng chi Ganoderma colossum 37

3.2.1 Thành phần chất xơ cellulose 38

3.2.2 Thành phần polysacharide tổng số 40

3.2.3 Thành phần triterpenoid tổng số 43

3.2.4 Định tính alkaloid tổng số 45

3.3 Kết quả các quá trình ngâm chiết 47

3.3.1 Chiết bằng nước nóng 47

3.3.2 Chiết phân đoạn 48

3.3.3 Chiết polysacharide thô 51

3.4 Tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ nấm Hoàng chi Ganoderma colossum trên mô hình chuột gây ĐTĐ 53

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 56

4.1 Kết luận 56

4.2 Đề xuất ý kiến 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Tài liệu tiếng Việt 57

Tài liệu tiếng Anh 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Streptozocin của hãng Santa Cruz 9

Hình 2.1: Chuột nhắt trắng chủng Swiss 18

Hình 2.2: Nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum) 18

Hình 2.3: Máy đo đường huyết 19

Hình 2.4: Bộ kít thử 19

Hình 2.5: Máy nghiền mẫu 20

Hình 2.6: Bình hút chân không 20

Hình 2.7: Máy cô quay chân không 20

Hình 2.8: Bình chiết phân đoạn 20

Hình 2.9: Máy đo quang phổ nhiều bước sóng 21

Hình 2.10: Cân phân tích 21

Hình 2.11:Tủ sấy 21

Hình 2.12: Bể ổn nhiệt 22

Hình 2.13: Máy ly tâm 22

Hình 2.14: Sơ đồ nghiên cứu 23

Hình 2.15: Phương pháp lấy máu đo glucose huyết 25

Hình 3.1: Nồng độ glucose huyết ở các lô chuột sau khi tiêm các mức liều STZ 32

Hình 3.2: Gây mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ 33

Hình 3.3: Khả năng dung nạp glucose huyết của các lô chuột 34

Hình 3.4: Khả năng dung nạp glucose của các lô chuột sau khi uống dịch chiết 3h 36

Hình 3.5: Quy trình định lượng thành phần chất xơ cellulose 38

Hình 3.6: Hàm lượng (%) chất xơ cellulose của nấm Hoàng chi 39

Hình 3.7: Quy trình định lượng polysacharide tổng số 40

Hình 3.8: Khảo sát khả năng loại protein liên kết polysaccharide của thuốc thử Sevage 41

Hình 3.9: Phản ứng Molish 42

Hình 3.10 Quy trình tách chiết hợp chất triterpenoid tổng số 43

Hình 3.11: Phản ứng Liebermann – Burchard 44

Hình 3.12: Quy trình định tính alkaloid tổng số 45

Hình 3.13: Phản ứng Mayer 45

Hình 3.14: Sơ đồ quy trình thu dịch chiết Hoàng chi bằng dung môi nước nóng 47

Hình 3.15: Dịch chiết nấm Hoàng chi 48

Hình 3.16: Quy trình thu dịch chiết nấm Hoàng chi bằng dung môi cồn 800 49

Hình 3.17: Quy trình thu dịch chiết phân đoạn 50

Hình 3.18: Quy trình thu polysacharide thô 51

Hình 3.19: Hiệu suất điều chế các dịch chiết từ nấm Hoàng chi 52

54

Hình 3.21: Cho chuột uống thuốc 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ năm 1999 của một số quốc gia [11] 4

31

Bảng 3.2: Khả năng dung nạp glucose của các lô chuột sau 3h uống gucose 34

Bảng 3.3: Khả năng dung nạp glucose của các lô chuột sau khi uống dịch chiết 3h 35

Bảng 3.4: Hàm lượng (%) thành phần chất xơ cellulose có trong nấm Hoàng chi 38

Bảng 3.5: Khảo sát khả năng loại protein liên kết polysaccharide của thuốc thử Sevage 41

52

53

MỞ ĐẦU

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một trong những bệnh rối loạn chuyển hóa có mức tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lượng cũng như chi phí điều trị, ngày càng trở thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế giới Theo dự báo của các chuyên gia y tế từ những năm 90 của thế kỉ 20 “Thế kỉ 21 là thế kỉ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa” Theo WHO, năm 2025 sẽ có 300 -

330 triệu người mắc bệnh, chiếm tỷ lệ khoảng 5.4% dân số toàn cầu, trong đó ĐTĐ type 2 chiếm 85-95% Với tốc độ phát triển nhanh chóng như hiện nay, bệnh ĐTĐ sẽ trở thành “đại dịch” trên toàn thế giới và là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các nước phát triển

Việt Nam nằm trong số các quốc gia có số người mắc bệnh ĐTĐ tăng nhanh nhất thế giới (PGS.TS Tạ Văn Bình) Số liệu điều tra quốc gia năm 2002-2003 tỷ lệ mắc bệnh trong cả nước là 2.7% Hiệp hội ĐTĐ quốc tế và WHO phân loại tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở Việt Nam nằm trong khu vực các nước có tỷ lệ gia tăng ĐTĐ trong cộng đồng khoảng 2%-4.99%

Với nhu cầu điều trị và dự phòng ĐTĐ, hàng loạt các thuốc tổng hợp đã được các tập đoàn, các công ty dược phẩm nghiên cứu và phát triển như sulfonylurea, các biguanid, thiazolidindion dành cho ĐTĐ type 2 và insulin dành cho ĐTĐ type 1 Tuy nhiên các thuốc có nguồn gốc tổng hợp không phải là giải pháp tối ưu đối với các nước đang phát triển như Việt Nam, do giá thành điều trị cao, đồng thời thuốc có phản ứng phụ và tác dụng không mong muốn Thuốc có nguồn gốc thảo dược đang là hướng ưu tiên phát triển với ưu điểm là nguồn dược liệu sẵn có, dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít tác dụng phụ, dễ được cộng đồng chấp nhận, đặc biệt là các nước kém phát triển và đang phát triển

Một trong số dược thảo đang được quan tâm nhất hiện nay là nấm Linh chi hay còn gọi là Lục bảo Linh chi Trong Lục bảo Linh chi phải kể đến nấm Hoàng chi với những tính năng thần dược có tác dụng đặc biệt với các triệu chứng suy giảm miễn dịch, căng thẳng thần kinh, suy sụp tinh thần Điều đáng chú ý là nấm Hoàng chi có tác dụng đặc biệt trong việc loại trừ chất cholesterol trong các thành mạch lọc sạch máu thúc đẩy quá trình lưu thông máu; khôi phục tế bào đảo tụy; cải thiện cơ bản thiểu năng insulin là nguyên nhân chính gây ra bệnh tiểu đường Nghiên cứu của Lin JM

(1995) cho thấy nấm Hoàng chi có tác dụng phục hồi chức năng gan trong bệnh tiểu đường và làm chậm quá trình phát bệnh ở những bệnh nhân mắc bệnh này

Xây dựng các mô hình bệnh lý để thử thuốc có ý nghĩa quan trọng nhằm đáp ứng những tiêu chuẩn về phát triển các sản phẩm thuốc mới của bộ Y tế Việt Nam và WHO Đã có một số mô hình ĐTĐ được áp dụng ở Việt Nam, tuy nhiên vẫn cần có sự

bổ sung nhằm mục đích hoàn thiện và phong phú các phương pháp đánh giá tác dụng

hạ đường huyết của thảo dược

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài “Tạo mô hình đái tháo đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết từ nấm

Hoàng chi Ganoderma colossum” với các nội dung chính:

- Tạo mô hình ĐTĐ trên chuột nhắt trắng bằng Streptozocin

- Định tính, định lượng thành phần các chất có trong nấm Hoàng chi: polysaccharide, triterpenoid, alkaloid, cellulose

- Thu dịch chiết nấm Hoàng chi

- Thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết từ nấm Hoàng chi trên chuột

nhắt trắng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ)

Theo WHO, ĐTĐ là một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin

Các chuyên gia thuộc Uỷ ban chuẩn đoán và phân loại bệnh đái tháo đường Hoa

Kỳ đưa ra định nghĩa về bệnh đái tháo đường như sau: Đái tháo đường là một nhóm các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là tăng glucose trong máu, hậu quả của sự thiếu hụt bài tiết insulin, khiếm khuyết trong hoạt động của insulin hoặc cả hai Tăng glucose máu mạn tính thường kết hợp với sự hủy hoại, sự tăng rối loạn chức năng và sự suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu [11,26]

1.1.1 Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam

* Trên thế giới:

ĐTĐ là bệnh không lây nhiễm có tốc độ phát triển nhanh chóng nhất trên thế giới chủ yếu là các nước đang phát triển Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế thế giới: năm 1995 cả thế giới có 135 triệu người mắc bệnh ĐTĐ chiếm 4% dân số thế giới, đến năm 2010 có 221 triệu người và dự báo đến năm 2025 là 330 triệu người mắc căn bệnh này, chiếm 5.4% Cũng theo thống kê của WHO, cứ 30 giây lại có một người mắc bệnh ĐTĐ bị cắt cụt chi; mỗi ngày có 5.000 người mất khả năng nhìn do biến chứng về mắt của bệnh ĐTĐ; mỗi năm có khoảng 3.2 triệu người chết vì các bệnh liên quan tới ĐTĐ Như vậy, ĐTĐ đang là gánh nặng thực sự cho sự phát triển kinh tế, xã hội và sức khỏe của con người toàn thế giới trong thế kỷ 21 Chính vì vậy, WHO đã nhận định rằng: “Thế kỷ XXI là thế kỷ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa mà điển hình là bệnh ĐTĐ Những gì mà đại dịch HIV/AIDS đã hoành hành 20 năm cuối thế kỷ XX, thì đó sẽ là ĐTĐ trong 20 năm đầu thế kỷ XXI”

Bảng 1.1: Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ năm 1999 của một số quốc gia [11]

Nước Dân số

( Triệu)

Số ca ĐTĐ (Triệu)

Tỷ lệ % Typ1

( Triệu)

Typ2 (Triệu)

Tại Việt Nam, cùng với sự tăng trưởng của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ trong 10 năm qua có xu hướng gia tăng Tuy nhiên những số liệu về bệnh ĐTĐ mới chỉ giới hạn ở một số thành phố lớn như Hà Nội, Huế, Thành phố Hồ Chí Minh, Hải Phòng, trong lứa tuối 30-64 là 4.0%, tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose là 5.1%, riêng quận Hoàn Kiếm (Hà Nội) lên tới 7% Phần lớn người bệnh phát hiện và điều trị muộn Vì vậy, mỗi năm có trên 70% bệnh nhân không được phát hiện và điều trị kịp thời Vùng đồng bằng, ven biển tỷ lệ mang bệnh ĐTĐ ở lứa tuối 30-64 là 2.7%

1.1.2 Phân loại và cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ

Năm 1997, Uỷ ban chuyên gia về chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ của WHO

đã đề nghị phân loại ĐTĐ mới dựa trên những tiến bộ khoa học trong những năm gần

đây Phân loại này dựa vào hiểu biết về nguyên nhân sinh bệnh Cách phân loại được tóm tắt dưới đây:

a Đái tháo đường type 1

Đái tháo đường type 1 là tình trạng tăng đường huyết mạn tính do hậu quả của tình trạng thiếu hụt insulin tuyệt đối hoặc tương đối kèm theo các rối loạn chuyển hóa protid, lipid Các rối loạn này có thể đưa đến các biến chứng cấp tính và mạn tính

Cơ chế bệnh sinh

Do yếu tố di truyền kém sản xuất insulin, phát bệnh tự nhiên, ít phụ thuộc vào điều kiện môi trường Bệnh gặp ở 0.2-0.5 % số người trong quần thể và chiếm 5-10%

số người mắc bệnh tiểu đường

Các giai đoạn trong ĐTĐ type 1[11]:

- Giai đoạn 1: Bản chất di truyền–nhạy cảm gene

- Giai đoạn 2: Khởi phát quá trình tự miễn

- Giai đoạn 3: Phát triển một loạt các kháng thể

- Giai đoạn 4: Tổn thương chức năng tế bào β đảo tụy

- Giai đoạn 5: Đái tháo đường lâm sàng, phá hủy hoàn toàn hoặc gần như hoàn toàn tế bào β đảo tụy Biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin có kèm biến chứng

Đặc điểm lâm sàng

Bệnh nhân ĐTĐ type 1 có đặc điểm lâm sàng phức tạp Thiếu hụt insulin tuyệt

đối làm tăng đường huyết và axit béo quá mức dẫn tới tăng áp lực thẩm thấu và tăng

thể ceton trong máu Bệnh nhân thường đi tiểu nhiều, khát nhiều, sụt cân, mờ mắt, mệt mỏi…

Điều trị

Bệnh nhân ĐTĐ type1 bắt buộc phải điều trị bằng insulin

Insulin là hormon do tế bào β trong tuyến tụy bài tiết dưới dạng preproinsulin, sau đó được cắt nhỏ hơn để tạo thành proinsulin Cấu tạo phân tử insulin gồm 2 chuỗi peptid, chuỗi A có 21 acid amin, chuỗi B có 30 acid amin Hai chuỗi này liên kết với nhau bằng hai cầu disulfid, khi hai chuỗi này tách nhau thì hoạt tính của insulin sẽ biến mất

Bệnh nhân ĐTĐ type1 cần được kiểm tra thường xuyên ở giai đoạn đầu để tìm hiểu insulin phù hợp, sau đó khám định kì hàng tuần, hàng tháng

b Đái tháo đường type 2

Đái tháo đường type 2 là tình trạng tăng đường huyết do hậu quả của kháng insulin ở cơ quan đích kèm theo suy giảm chức năng tế bào β hoặc do suy giảm chức năng tế bào β kèm theo kháng insulin của cơ quan đích

Cơ chế bệnh sinh:

Sinh bệnh học ĐTĐ type 2 diễn biến qua 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Nồng độ glucose trong máu vẫn ở mức bình thường, nhưng có hiện tượng kháng insulin vì mức insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu

- Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần và xuất hiện tăng glucose huyết sau bữa ăn

- Giai đoạn 3: Sự kháng insulin không thay đổi, nhưng bài tiết insulin suy giảm

và gây tăng glucose huyết lúc đói Bệnh ĐTĐ biểu hiện qua bên ngoài

Trong số các yếu tố môi trường đóng vai trò thúc đẩy sự phát triển bệnh thì béo phì là yếu tố thường được đề cập nhất Béo phì làm gia tăng tình trạng kháng insulin Nhiều bằng chứng cho thấy kiểm soát tốt tình trạng tăng cân béo phì sẽ làm giảm đáng

kể tình trạng kháng insulin và kiểm soát tốt glucose huyết.[11]

1.2 Đái tháo đường với y học cổ truyền (YHCT)

1.2.1 Quan niệm của y học cổ truyền về ĐTĐ

YHCT đề cập đến nguyên nhân gây bệnh ĐTĐ là do thần chí thất điều (yếu tố stress), như do “can khí uất kết, uất trệ sinh nhiệt hóa táo thương âm…sinh ra miệng khát, uống nước nhiều, hay đói” Tóm lại, theo phương diện YHCT, nguyên nhân gây bệnh ĐTĐ chủ yếu là do: bấm thụ âm hư, ăn uống không điều độ hoặc do tình chí rối loạn Bên cạnh đó, yếu tố di truyền trong gia đình cũng được lưu ý

1.2.2 Các thuốc đông y điều trị ĐTĐ

Việt Nam là nước có nguồn dược liệu rất phong phú Bên cạnh chế độ ăn uống

và tập luyện hợp lý thì việc sử dụng thảo mộc trong điều trị bệnh ĐTĐ từ lâu đã được biết đến với nhiều tác dụng tích cực Dưới đây là một số thảo mộc rất sẵn trong nước

có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ

Bầu đắng: Trong quả bầu đắng có nhiều insulin dưới dạng tự nhiên, không có tác

dụng phụ với sức khỏe, giúp hạ mức độ đường trong máu

Tỏi: Có tác dụng giảm cholesterol và giúp giảm đường máu Uống 3-4g nước ép tỏi

tươi với nước mỗi ngày giúp giảm đường trong máu hiệu quả

Cỏ cari: Là loại thảo mộc giúp điều chỉnh lượng đường trong máu, có thể dùng dưới

dạng bột hoặc gia vị cho vào thức ăn khi đun nấu

Nghệ: Nghệ có tác dụng tăng cường hoạt động của các tế bào thuộc tuyến tụy giúp sản

sinh ra nhiều insulin hơn Nên uống bột nghệ với nước ấm

Quế: Quế có tác dụng hỗ trợ trong việc giảm lượng đường máu, nên cho quế vào thức

ăn hàng ngày sẽ rất tốt cho những người bị bệnh ĐTĐ

Hành tây: Hành tây có tác dụng dự phòng sự tăng đường máu bởi một số chất vẫn

thường gây ĐTĐ trên động vật thí nghiệm Trên lâm sàng, cho bệnh nhân ĐTĐ uống dịch ép hành tây đã có tác dụng làm giảm đường máu

Mướp đắng: Qủa mướp đắng còn xanh có tác dụng hạ đường máu trên động vật đã

được gây ĐTĐ thực nghiệm Khi cho động vật uống hàng ngày trong thời gian dài, nó làm chậm sự phát triển bệnh võng mạc và đục thủy tinh thể của mắt Qủa mướp đắng

có tác dụng làm tăng khả năng dung nạp glucose của bệnh nhân ĐTĐ Hoạt chất chính trong máu là charantin, glycosid steroid

Khoai lang: Khoai lang là một thức ăn tốt cho bệnh nhân đái tháo đường Khoai lang

trắng chứa caiapo-một hoạt chất giúp kiểm soát tốt lượng đường và cholesterol trong máu ở người ĐTĐ type 2

1.3 Phương pháp gây mô hình ĐTĐ trên động vật thực nghiệm

1.3.1 Một số mô hình gây ĐTĐ mô phỏng ĐTĐ type 1 trên động vật thực nghiệm

* Andrew và cộng sự (1999) tiến hành gây ĐTĐ trên chuột nhắt chủng 129/SV

(Taconic Farms) 10 tuần tuổi bằng tiêm STZ liều 200mg/kg pha trong Citrate natri 0.1M, pH 5.5 Nhóm đối chứng tiêm citrat natri 10 ml/kg

* Mô hình của Judith M.Thomas và cộng sự (2001) sử dụng liều đơn STZ

140mg/kg pha trong đệm Citrate natri (0.1M, pH 4.5) gây ĐTĐ type 1 bằng tiêm màng bụng trên khỉ nâu 2-3 tuổi, 3.1-3.8kg Sau 3 ngày tiêm STZ, những con khỉ nào thể hiện mức glucose >250mg/dl được xem như bị ĐTĐ

* J Andrew Pospisilik và cộng sự (2003) sử dụng chuột cống chủng Wistar

(250g) tiêm màng bụng liều đơn STZ 50mg/kg để gây ĐTĐ, STZ được pha trong đệm Citrate natri (pH 4.5), trước khi tiêm thuốc chuột được nhịn đói 4-6 giờ

* Sachin và cộng sự đã khảo sát liều tiêm STZ để gây ĐTĐ trên chuột nhắt

trắng chủng Swiss với các mức liều đơn 180mg/kg, 100mg/kg và liều đa 40mg/kg tiêm

trong 5 ngày Kết quả cho thấy liều đơn 180mg/kg gây ĐTĐ type 1 cho chuột sau 1 tuần nhưng tỷ lệ chuột chết sau thí nghiệm cao hơn tiêm liều thấp 40mg/kg trong 5 ngày Liều đơn 100mg/kg không gây được ĐTĐ Mô hình cũng khẳng định trong 3 mức liều khảo sát thì tiêm liều thấp 40mg/kg trong nhiều ngày là phương pháp gây ĐTĐ type 1 hiệu quả nhất trên mô hình chuột nhắt trắng

1.3.2 Streptozocin và ứng dụng trong mô hình ĐTĐ type1

Lịch sử phát triển

STZ là một kháng sinh được phân lập vào cuối thập niên 50 của thể kỉ XX Thuốc được các nhà nghiên cứu công ty Dược Upjohn ở Michigan phát hiện từ một

chủng nấm sợi Streptomyces achromogenes có trong mẫu đất lấy ở bang Kansas (Mỹ)

Giữa thập niên 60 các nhà khoa học đã phát hiện ra tính độc chọn lọc của STZ đối với các tế bào β đảo tụy, trong khi các tế bào này lại điều tiết nồng độ glucose huyết bằng cách tiết ra các hormon insulin Đây là một gợi ý sử dụng thuốc để gây mô

hình ĐTĐ type 1và điều trị ung thư tụy.[13]

Tính chất vật lý và hóa học

STZ gồm hai chuỗi đồng phân lập thể là α và β Tinh thể màu hơi vàng, trắng đục hòa tan trong nước, cồn thấp độ, ít tan trong dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong dung môi hữu cơ không phân cực Chất tinh khiết dễ hút ẩm không khí và nhạy cảm với ánh sáng STZ phân hủy thành diazomethane trong dung dịch kiềm ở 00C Công thức mạch thẳng: C8H15N3O7; trọng lượng phân tử: 265.22 g/mol; thời gian bán hủy: 5-15 phút

- STZ cũng được nghiên cứu làm thuốc kháng sinh

Cơ chế hoạt động của STZ

Khi được hấp thụ vào các tế bào β, STZ được phân cắt thành glucose và một nửa còn lại là methylnitrosourea Vì có tính alkyl hóa nên tác động tới các đại phân tử sinh học dẫn tới phá hủy tế bào β Đích hướng tới là các DNA ty thể, qua đó tác động đến các chức năng tín hiệu quá trình trao đổi chất trong ty thể của tế bào β, điều này cũng giải thích STZ có khả năng ức chế insulin

Hình 1.1: Streptozocin của hãng Santa Cruz

1.4 Nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum)

1.4.1 Đặc điểm chung

Theo Lý Thời Trần thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau được gọi là Lục bảo Linh chi gồm: Xích chi (Linh chi đỏ); Hắc chi (Linh chi đen); Thanh chi (Linh chi xanh); Bạch chi (Linh chi trắng); Hoàng chi (Linh chi vàng); Tử chi (Linh chi tím)

Trong đó, Hoàng chi có tên khoa học là Ganoderma colossum loài đặc biệt quý hiếm, vừa mới phát hiện và đã được nuôi trồng thành công tại Thừa Thiên Huế Trong

thư tịch cổ nấm Hoàng chi còn được gọi với tên khác như tiên thảo, nấm trường thọ

Về hình thái và cấu trúc nấm Hoàng chi cũng giống các nấm Linh chi khác: tai nấm hóa gỗ hình quạt hoặc thận; khi non, mặt trên tán nấm màu vàng chanh và khi già màu vàng sậm, có ít vòng đồng tâm và vòng này thể hiện rõ rệt, toàn bộ tán nấm đều

có màu vàng, không cuống, mặt dưới có các lỗ thụ tầng to có màu kem khi non và hơi bạc khi già có 3-4 lỗ thụ tầng Thịt nấm màu trắng kem, xốp, dày khoảng 20 mm, lớp sắc tố vàng bên trên rất mỏng, dễ bể khi khô, lớp thụ tầng này dày khoảng 10mm Bào

tử đảm khá lớn so với các loài nấm Linh chi khác, hình trứng thuôn, kích thước từ

Tên khoa học: Ganoderma colossum Hình 1.2: Nấm Hoàng chi

1.4.2 Phân bố sinh thái

Nấm Hoàng chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới đặc biệt ở các quốc gia như: Hàn Quốc; Đài Loan; Nhật Bản; Thái Lan; Hoa Kỳ; Malaysia; Việt Nam; Indonesia; Srilanca Nấm Hoàng chi thường phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu là chất xơ Với công nghệ ngày càng hiện đại, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu thành công các nguồn nguyên liệu nuôi trồng nấm Hoàng chi thay cho mùn cưa cao su trước đây Kết quả này đã góp phần tránh lãng phí và hạn chế sự ô nhiễm môi trường bởi nguyên liệu được sử dụng là phế thải của các nhà máy đường, công nghiệp dệt như: bã mía, bông thải…

Đến nay nấm Hoàng chi có thể tìm thấy ở hầu hết các tỉnh thành Việt Nam Nấm Hoàng chi không chỉ được tìm thấy ở rừng núi cao mà còn tìm thấy ở cả đồng bằng và trải dài từ Bắc đến Nam

Các nguyên tố vô cơ như: Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg, Mn, Zn

Polysaccharide

Có trên 200 loại polysaccharide được li trích và thu nhận từ nấm Hoàng chi

Polysaccharide gồm 2 loại chính:

GL-A: Gal: Glu Rham: Xyl (3,2; 2,7; 1,8; 1,0) M= 23.000 Da

GL-B: Glu Rham: Xyl (6,8; 2,0; 1,0) M=25.000 Da

GL-A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Galacta, còn GL-B có thành phần chính là Glu, nên gọi là Glucan

Hầu hết các polysaccharide hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của DNA và RNA Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng

Polysaccharide có nguồn gốc từ nấm Hoàng chi dùng điều trị ung thư được công nhận sáng chế ở Nhật Năm 1976, Công ty Kureha Chemical Industry sản xuất chế phẩm ly trích từ nấm Hoàng chi có tác dụng kháng carcinogen Năm 1982, Công

ty Teikoko Chemical Industry sản xuất sản phẩm từ nấm Hoàng chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế neoplasm Bằng sáng chế Mỹ 4051314, do Ohtsuka & al (1977) sản xuất từ nấm Hoàng chi chất mucopolysaccharide dùng chống ung thư

Ganoderic acid

Ganoderic acid là một cyclopropene hoặc cyclopentene Hàm lượng ganoderic acid thay đổi theo giống nấm Hoàng chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng Hàm lượng ganoderic acid cao thì có nhiều vị đắng [4]

Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren Các triterpenoid có bộ khung chính từ 27-30 nguyên tử carbon (C28H48) rất thường gặp trong thực vật Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như –OH; eter –O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C Đặc tính chung là tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, chloroform, ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid

Bảng 1.2: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Hoàng chi

(Lê Xuân Thám, 1996)

Ganoderic acid R,S Ức chế giải phóng histamin

Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp

Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganodermic acid Ức chế tổng hợp cholesterol

Triterpenoid đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải phóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan Hiện nay, đã tìm thấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic, trong đó ganodosteron được xem là chất kích thích hoạt động của gan và bảo vệ gan

ly trích akaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ điều chế dạng thuốc để uống

Alkaloid là những chất có hoạt tính sinh học nhiều ứng dụng trong ngành y dược và nhiều chất rất độc Các alkaloid ở nấm Hoàng chi có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alkaloid

+ Saponin triterpenoid tetracyclic: Phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan

- Saponin steroid: Gồm các nhóm chính spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan

- Hợp chất saponin trong nấm Hoàng chi có nhiều công dụng trong y học như: + Trị long đờm, chữa ho

+ Là chất phụ gia trong một số vaccine

+ Tác dụng thông tiểu

+ Tác dụng kháng viêm, chống khối u

Germanium hữu cơ

Germanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm

1885 Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của oxygen Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên tới 1.5 lần Vì thế làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa

Cơ thể con người là thành phần của các electron Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý Germadium hữu cơ trong nấm Hoàng chi sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khỏe Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất Germadium sẽ điều hòa và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển

1.4.4 Tác dụng dược lý[7]

Tác dụng điều trị ĐTĐ

Nấm Hoàng chi tác dụng đặc biệt trong việc loại trừ chất cholesterol trong các thành mạch lọc sạch máu thúc đẩy quá trình lưu thông máu; cải thiện cơ bản thiểu năng insulin nguyên nhân gây bệnh ĐTĐ Nghiên cứu của Lin JM (1995) cho thấy

nấm Hoàng chi có tác dụng phục hồi chức năng gan trong ĐTĐ Ngoài ra, theo khảo cứu của Mizuno T (1996) nấm Hoàng chi còn làm giảm glucose huyết ở chuột bình

thường và chuột gây ĐTĐ (theo báo khoa học phổ thông, chuyên đề Nấm và sức khỏe

2006, 63:801) Vì vậy sử dụng nấm Hoàng chi để phòng bệnh ĐTĐ sẽ đem lại hiệu

quả cao

Tác dụng chống ung thƣ

Polysaccharide là hoạt chất chủ yếu có tác dụng tăng cường miễn dịch và kháng

u (OkaiS và cs-1983) Phân tử lượng của hợp chất này lớn hơn 104 Tác dụng kháng u phụ thuộc vào cấu tạo của các polysaccharid, chủ yếu phụ thuộc vào sự sắp xếp của các chuỗi phân tử và số lượng nhóm OH trên các chuỗi, thường là các chất có khả năng tan trong nước nóng, có các chuỗi phân tử chính D-glycopyranosy (14)- - và và (16)- - và chuỗi (13)- -arabinosa

Tác dụng chống quá trình làm lão hoá

Nấm Hoàng chi tác dụng dọn các gốc tự do Năm 1956, Harmarn đưa ra lý thuyết gốc tự do Ông cho rằng các phân tử trong tế bào giải phóng ra các gốc tự do và chuyển các gốc tự do này thúc đẩy quá trình lão hóa Gốc tự do không ngừng sản sinh trong quá trình trao đổi chất của tế bào, làm tổn thương ngay các tế bào, giảm hoạt tính của các enzyme, phát sinh sai sót trong quá trình tổng hợp và hấp thụ các acid amin, xuất hiện các biểu hiện dị thường trong các màng tế bào, thúc đẩy quá trình lão hóa và xuất hiện các trạng thái bệnh lý cùng tuổi tác tăng lên, khả năng chống oxy hóa, các enzyme chống oxy hóa nội sinh, khả năng phòng vệ các gốc tự do tự sản sinh trong cơ

thể mỗi năm một giảm làm tăng quá trình lão hóa

Tác dụng trên thần kinh trung ƣơng

Các nhà nghiên cứu Viện Y học Bắc Kinh đã tiến hành nghiên cứu trên đối tượng chuột nhắt và đưa ra kết quả dịch chiết cồn ethanol, khi tiêm phúc mạch chuột nhắt trắng với liều 5g/kg thể trọng thì sau 1-2 ngày xuất hiện tác dụng trấn tĩnh thần kinh, làm giảm rõ rệt các hoạt động Tác dụng trấn tĩnh có thể duy trì sau 2 giờ Nấm

Hoàng chi còn có tác dụng giảm cơn co giật do nicotin gây ra

Tác dụng lên hệ tuần hoàn

Nấm Hoàng chi có tác dụng rất tốt đối hệ tuần hoàn như: Ổn định huyết áp; lọc sạch máu tăng cường tuần hoàn máu; giảm mệt mỏi; hỗ trợ thần kinh; chống đau đầu

và tứ chi; điều hoà kinh nguyệt; làm da dẻ hồng hào chống các bệnh ngoài da như dị ứng

Tác dụng giảm đau

Các nhà khoa học Trung Quốc cũng nghiên cứu đối tượng chuột nhắt đã chứng minh được nấm Hoàng chi có tác dụng ức chế phản ứng xoay mình của chuột nhắt, có tác dụng làm giảm đau Hiệu quả điều trị của nấm Hoàng chi trên các bệnh nhân bị suy nhược thần kinh, mất ngủ, còn được coi là tác dụng bảo vệ hệ thần kinh trung ương, giảm hưng phấn, giảm kích thích ngoại cảnh, từ đó giúp cho bệnh nhân chìm trong giấc ngủ, tạo điều kiện cho tế bào não nghỉ ngơi và tăng cường quá trình trao đổi chất của tế bào thần kinh, giúp cho thần kinh trung ương điều tiết chuẩn xác hệ thần kinh thực vật và hoạt động nội tạng nâng cao khả năng bảo vệ cơ thể

Tác dụng cường tim

Nhóm nghiên cứu thuộc Viện Y Học Bắc Kinh đã chứng minh, nấm Hoàng chi

có tác dụng cường tim rõ rệt, có tác dụng gia tăng lực co bóp tim, gia tăng lưu lượng máu qua tim, còn nhịp tim thay đổi không đáng kể Polysaccharide trong nấm Hoàng chi hòa tan trong thuốc cũng có tác dụng cường tim rõ rệt

Tác dụng cân bằng trao đổi chất

Khả năng tổng hợp và hấp thụ các acid amin và protein của người già bị giảm sút, làm cho quá trình trao đổi chất trong tế bào bị rối loạn, đẩy nhanh quá trình già hóa tế bào và làm chết tế bào Polysaccharide trong nấm Hoàng chi, làm tăng khả năng giải độc của gan, làm tăng khả năng tổng hợp protein trong tủy xương, giảm các tổn thương trong tế bào tủy xương

Tác dụng bảo vệ gan

Nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Y Bắc Kinh đã tiến hành thí nghiệm nghiên cứu trên chuột nhắt trắng và chứng minh được nấm Hoàng chi có thể bảo vệ gan, làm giảm nhẹ tổn thương tế bào gan do CCl4 (tetrachlorurcacbon)gây ra

Tác dụng lên hệ tiêu hóa

Nấm Hoàng chi có tác dụng làm giảm vết loét dạ dày, ức chế vết loét chảy máu

ở thượng vị giảm tiết dịch vị và giảm diện tích loét do acid gây ra

1.4.5 Tình hình nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của nấm Hoàng chi trên Thế giới và ở Việt Nam

Hiện nay, theo tổ chức Y tế thế giới, bệnh ĐTĐ đã được công nhận là bệnh đặc biệt nghiêm trọng đe dọa đến sức khỏe và sự phát triển kinh tế ở tất cả các quốc gia trên thế giới Chính vì vậy vào năm 1989, Hội nghị lần thứ 42 của World Health Assembly-Hội nghị Y tế toàn cầu đã thông qua lời kêu gọi toàn cầu hành động về phòng và kiểm soát bệnh ĐTĐ theo khung của Nghị quyết WHA42.36 Trong đó, việc nghiên cứu, tìm hiểu ứng dụng thảo dược vào chữa bệnh ĐTĐ đem lại hiệu quả cao trong việc điều trị ĐTĐ cũng được quan tâm đến Có rất nhiều thảo dược được sử dụng trong việc chữa trị bệnh ĐTĐ như: actiso; bồ công anh; bí đao; nhàu; mướp đắng; ổi; nhân sâm; dây thìa canh… Trong các loại thảo dược chữa bệnh ĐTĐ thì nấm Hoàng chi là một loại thảo dược đã được nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết từ rất lâu và đã đem lại hiệu quả như mong muốn Hikino và cộng sự (1985) lần đầu tiên báo cáo là 2 loại glycan, ganoderan A và B, có trong dịch chiết nước của quả thể nấm Hoàng chi, có tác dụng hạ glucose đáng kể trên chuột gây ĐTĐ bằng alloxan Zhang

và Lin (2004) ghi nhận rằng ảnh hưởng hạ đường huyết của các polysaccharide từ nấm

Hoàng chi là do đẩy mạnh dòng ion Ca2+ vào trong tế bào β ở đảo tụy và vì vậy giải

phóng insulin Xử lý polysaccharide của nấm Hoàng chi trong điều kiện invitro có tác

dụng bảo vệ các tế bào đảo tụy gây độc bởi alloxan thông qua việc ức chế sự hoạt hóa của NF-kappa B và làm chậm sự tạo thành các gốc tự do, yếu tố gây ra sự phá hủy đảo tụy (Zhang và cộng sự, 2003) Thêm vào đó, polysaccharide của nấm Hoàng chi ngăn chặn/trì hoãn các biến chứng ở thận cũng như làm chậm việc tăng nồng độ của glucose huyết và làm giảm mức triglyceride trong máu chuột gây tiểu đường bằng streptozocin (Zhang và cộng sự, 2003) Ngoài ra dịch chiết nước từ quả thể nấm Hoàng chi còn làm chậm sự tăng glucose huyết trên chuột béo phì gây đái tháo đường, làm giảm mức độ biểu hiện gen PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase) trong gan Zhang cũng khẳng định, polysaccharide có khối lượng phân tử trung bình khoảng 584900 và liên kết với chuỗi peptit 17 axit amin Tỷ lệ giữa polysaccharide với peptit là 93.51% : 6.49% Polysaccharide đó có chứa rhamnose, xylose, fructose, galactose, mannose và glucose với tỷ lệ 0.793: 0.964: 2.944: 0.167 :0.384: 7.94, liên kết với nhau bằng liên kết glycozit Bột có màu nâu đỏ và tan được trong nước

Năm 2009, Seto và cộng sự đã sử dụng dịch chiết nấm Hoàng chi để chữa bệnh ĐTĐ type 2 trên chuột nhắt trắng được gây béo phì có khối lượng 58.2±3.4g Chuột bị ĐTĐ type 2 được uống dịch chiết nấm Hoàng chi liều 300mg/kg trong 4 tuần đã giảm 56.76% lượng đường huyết trong máu và cũng giảm được 15% trọng lượng so với lúc

bị ĐTĐ

Năm 2010, Qian Yang và cộng sự đã sử dụng dịch chiết polysacharide thô được chiết từ nấm Hoàng chi để chữa bệnh ĐTĐ Động vật thí nghiệm là chuột cống có khối lượng 257±20g được gây ĐTĐ bằng STZ với liều 65mg/kg Sau 40 ngày cho chuột bị ĐTĐ uống dịch chiết polysacharide thô với liều 300mg/kg đã giảm 76.04% lượng đường huyết trong máu

Ở Việt Nam, theo tiến sĩ Ngô Anh, thời Pháp, nấm Hoàng chi từng được các chuyên gia Pháp công bố có ở miền Bắc, tuy nhiên, từ đó đến năm 2005 chưa có một nghiên cứu nào mới Năm 2005 tiến sĩ Ngô Anh là người đầu tiên trồng thành công nấm Hoàng chi ở Việt Nam Đến năm 2010, nhóm nghiên cứu trường Đại học khoa học, Đại học Huế đã tiến hành xác định một số hợp chất và tác dụng bảo vệ dịch chiết nấm Hoàng chi trên tế bào nấm men khi bị chiếu tia cực tím Tuy nhiện, sản phẩm chữa bệnh ĐTĐ từ nấm Hoàng chi được cho là có khả năng điều trị bệnh ĐTĐ nhưng cho đến nay vẫn chưa có một công bố chính thức nào về tác dụng hạ đường huyết của nấm Hoàng chi ở Việt Nam

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Động vật nghiên cứu

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cân nặng 18–22g do viện chăn nuôi Suối Dầu

Nha Trang cung cấp Chuột được nuôi trong phòng điều hòa nhiệt độ 22±20C với chu

kỳ ngày 12h và đêm 12h; được ăn bằng thức ăn cho bộ gậm nhấm do Viện vaccine và sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp

Hình 2.1: Chuột nhắt trắng chủng Swiss

2.1.2 Dược liệu nghiên cứu

Hình 2.2: Nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum)

Qủa thể nấm Hoàng chi Ganoderma colossum được TS.Ngô Anh nuôi trồng tại

Phòng thí nghiệm Nuôi trồng nấm, Bộ môn Thực vật, Khoa sinh, Trường Đại học Khoa học Huế

2.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

- Streptozocin của hãng Santa Cruz

- Ethanol 960, HCl, NaOH, H2SO4, n- Butanol, Anilin, Glucose, KI, NaHSO3,

C6H5Na3O7.5H2O, folin, hexan, chloroform, etylacetat, nước cất

- Máy đo đường huyết Medisense Optium Xceed

- Bộ kít thử Medisense optium blood glucose electrodes

- Bình chiết phân đoạn, máy cô quay chân không, máy đo quang phổ nhiều

bước sóng, bình hút chân không, cân phân tích, máy ly tâm, lò vi sóng, tủ sấy, máy nghiền mẫu Các thiết bị đều đảm bảo tiêu chuẩn về độ chính xác và an toàn

Sau đây là một số hình ảnh máy móc thiết bị chủ yếu trong quá trình thực hiện

đề tài:

Hình 2.3: Máy đo đường huyết Hình 2.4: Bộ kít thử

Hình 2.9: Máy đo quang phổ nhiều bước sóng

Hình 2.10: Cân phân tích Hình 2.11:Tủ sấy

Hình 2.12: Bể ổn nhiệt

Hình 2.13: Máy ly tâm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu theo các hướng sau:

Hình 2.14: Sơ đồ nghiên cứu

2.3.1 Tạo mô hình ĐTĐ trên chuột nhắt trắng theo kiểu mô phỏng ĐTĐ typ 1

Tối ưu hóa liều STZ là một việc làm quan trọng trong quá trình gây tăng đường huyết trên động vật thực nghiệm Liều gây mô hình ĐTĐ ổn định trong thời gian dài

sẽ giúp đánh giá thuốc nghiên cứu một cách khách quan và hiệu quả

Tạo mô hình chuột ĐTĐ thực nghiệm

Khảo sát thành phần hóa học của quả thể nấm

Xử lý mẫu nấm

Chiết nước

nóng

Chiết polysaccharide thô

Chiết phân đoạn n-hexan; chloroform;

etylacetat

Chiết nước

nóng

Chiết polysaccharide thô

DC n-hexan

DC chlo roform

DC etyl acetat

DC nước cuối

Thử khả năng hạ đường huyết trên chuột ĐTĐ

2.3.1.1 Sàng lọc và chọn liều gây ĐTĐ type 1 trên chuột nhắt trắng

– 170mg/kg Trước khi tiêm thuốc chuột được phân thành các lô, nhịn đói 4-6 giờ và tiêm màng bụng liều đơn STZ như sau:

- Lô 1: Chuột được tiêm STZ liều 120mg/kg;

- Lô 2: Chuột được tiêm STZ liều 150mg/kg;

- Lô 3: Chuột được tiêm STZ liều 170mg/kg;

- Lô đối chứng: Đệm Natri citrat 0.01M (pH=4.5) liều 10ml/kg;

Cho chuột uống nước đường sacarozơ 10% qua đêm để tránh hạ đường huyết đột xuất sau khi tiêm thuốc

Đo nồng độ glucose huyết tại các thời điểm 0h, 2 ngày và 7 ngày sau khi tiêm thuốc Sau khi tiêm STZ chuột được duy trì chế độ ăn như ban đầu Chuột có nồng độ glucose huyết ≥10mmol/l được coi là bị ĐTĐ

2.3.1.2 Thử khả năng dung nạp glucose huyết trên chuột gây ĐTĐ

Vào ngày thứ 7 sau khi tiêm STZ, lô chuột được gây ĐTĐ và lô chuột đối chứng cho nhịn đói qua đêm và uống glucose 30% với liều 3g/kg cân nặng Định lượng glucose huyết tại các thời điểm 0h, 1h, 3h sau khi uống glucose

2.3.1.3 Thử khả năng dung nạp glucose sau khi uống các phân đoạn dịch chiết

Sau khi cho chuột nhịn đói 12h, chuột được cho uống các phân đoạn dịch chiết

từ nấm Hoàng chi Tiếp đó, sau 3h cho uống dung dịch glucose 30% liều 3g/kg Định lượng glucose huyết sau khi uống dung dịch glucose ở các thời điểm 0h, 3h

2.3.2 Phương pháp định lượng glucose huyết

+ Phản ứng 2: Hydro peroxide vừa tạo ra sẽ phản ứng với O-Dianisidin tạo phức màu và được thiết bị đo quang học trong máy Medisense Optimum Xceed chuyển hóa định lượng biểu thị bằng số mmol/L hoặc mg/dl glucose

b) Tiến hành

Ấn nút điều khiển để khởi động máy Gắn que thử vào máy Dùng kim châm chuyên dụng châm vào mạch máu ở đuôi chuột, để máu chảy tự nhiên, thấm bỏ giọt đầu tiên, phủ kín giọt máu lên vùng phản ứng của que thử Sau 5 giây, kết quả nồng độ đường huyết sẽ hiển thị trên màn hình

Hình 2.15: Phương pháp lấy máu đo glucose huyết

2.3.3 Các phương pháp định tính, định lượng các chất có hoạt tính sinh học trong nấm Hoàng chi

2.3.3.1 Định lượng cellulose [9]

a) Nguyên tắc:

Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền của cellulose đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu Các chất khác thường đi kèm theo cellulose như hemicellulose, lignin, tinh bột…, ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm nên bị oxi hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu

b) Tiến hành

10g bột nấm Hoàng chi cho vào bình cầu 500ml dung dịch NaOH 0,5%, lắp ống sinh hàn hoàn lưu trong 30 phút kể từ lúc sôi Chú ý không để bọt trào lên Kỹ thuật này dùng để hòa tan tinh bột và những pectin có tính acid và ít kết hợp với cellulose nhưng không ảnh hưởng đến cellulose

Lọc qua giấy lọc Rửa cặn còn lại với dung dịch NaOH 0.5% nóng Cho cặn cellulose tác dụng với 20ml HCl 10% Thêm vào đó 20ml dung dịch hypoclorit natri từng giọt một vừa cho vừa khuấy đều Để yên trong 5 phút rồi ly tâm