Tạo mô hình tiểu đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết một số chế phẩm tự nhiên

Tạo mô hình tiểu đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết một số chế phẩm tự nhiênvà thử tác dụng hạ đường huyết một số chế phẩm tự nhiên

1đại học quốc gia hà nộitrờng đại học khoa học tự nhiên------------------------Nguyễn Trung QuânTạo mô hình tiểu đờng trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đờng huyết một số chế phẩm tự nhiênChuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30Luận văn thạc sĩ khoa họcNgời hớng dẫn khoa học: Ts. Hoàng Thị Mỹ NhungHà Nội - 2009 Lời cảm ơnTrớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Bộ môn Tế Bào Mô Phôi và Lý Sinh, Khoa Sinh Học đã tận tình hớng dẫn, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu, các phơng pháp nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành luận văn này.Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban đốc Viện Y học cổ truyền Quân đội, TS. Nguyễn Thị Tuyết Nga và tập thể khoa Nghiên cứu Thực nghiệm, đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học đặc biệt là các thầy cô giáo thuộc bộ môn Tế Bào Mô Phôi và Lý Sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian qua.Cuối cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin gửi lời cảm ơn đến những ngời thân trong gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua. Hà Nội, tháng 12 năm 2009Tác giả Nguyễn Trung QuânNhững chữ viết tắt2 ACTH Adrenocorticotropic hormoneADN Acid deoxyribonucleicAnti - GAD Glutamic acid decarboxylase antibodies Tế bào beta- đảo tụy LangerhansCDC Centers for Disease Control and Prevention(Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Mỹ)CNT Chuột nhắt trắngCv Coefficient of variation(Hệ số biến thiên)ĐTĐ Đái tháo đờngFDA Food and Drug AdministrationICA Islet cells antibodiesIDM International Diabetes MellitusLD50Lethal dose 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm)MLH Lipid Mobilising HormonNOD Non-Obese DiabeticSTH Somatotropic HormonSTZ Streptozocin (Streptozotocin)WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)Mục lục3 Lời cảm ơnNhững chữ viết tắtMục lụcTrangMở đầu 1Chơng 1- Tổng quan . 31.1.Tổng quan về bệnh ĐTĐ. 31.1.1.Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và ở Việt Nam .31.1.2.Chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ .41.1.3.Sinh lý bệnh ĐTĐ . .61.1.4.Thuốc điều trị . 101.2.Mô hình bệnh ĐTĐ trên động vật thực nghiệm . .121.2.1.Khái lợc về mô hình bệnh lý trên động vật thực nghiệm .121.2.2.Streptozocin và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1 131.2.3.Alloxan và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1 . . 161.2.4.Mô hình ĐTĐ typ 2 .191.3.Cây Bông ổi (Lantana camara L) .191.3.1.Đặc điểm hình thái và phân bố . . 191.3.2.Thành phần hóa học . 211.3.3.Công dụng và tác dụng duợc lý .22Chơng 2- Đối tợng, Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 242.1.Đối tợng 242.2.Vật liệu, hóa chất 242.3.Phơng pháp nghiên cứu .252.3.1.Thử gây mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ và Alloxan trên CNT 252.3.2.Phơng pháp thu dịch chiết từ cây Bông ổi 272.3.3.Phơng pháp thử độc tính cấp của dịch chiết cây Bông ổi 272.3.4.Sàng lọc tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết trên CNT bình th-ờng 282.3.5. Thử khả năng dung nạp glucose huyết trên CNT bình thờng của dịch chiết Bông ổi 292.3.6.Thử tác dụng hạ glucose huyết trên CNT gây ĐTĐ typ 1 bằng STZ 302.3.7.Thử tác dụng hạ glucose huyết trên CNT gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ và chế độ giàu dinh dỡng .312.3.8.Phơng pháp định lợng glucose huyết324 2.3.9.Phơng pháp xử lý số liệu33Chơng 3- Kết quả và thảo luận . 353.1.Gây mô hình ĐTĐ typ 1353.1.1.Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng alloxan353.1.2.Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng STZ .383.2.Thu dịch chiết nghiên cứu và thử độc tính cấp của dịch chiết cây Bông ổi .403.2.1. Thu dịch chiết Bông ổi . 403.2.2. Thử độc tính cấp dịch chiết cây Bông ổi 413.3. Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên CNT 433.3.1. Sàng lọc liều có tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết Bông ổi 433.3.2.Thử tác dụng dung nạp glucose huyết của dịch chiết Bông ổi trên CNT bình thờng .463.3.3.Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 1 đợc gây bằng STZ .493.3.4.Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 2 đợc gây bằng STZ và chế độ ăn . 51Kết luận 54Tài liệu tham khảo . 55Mở đầuTiểu đờng (đái tháo đờng) là một trong những bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa có mức tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lợng cũng nh chi phí điều trị trở thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Dự báo của các chuyên gia y tế từ những năm 90 của thế kỉ 20 đã và đang trở thành hiện thực Thế kỉ 21 là thế kỉ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa. Theo WHO, năm 2025, sẽ có 300-330 triệu ngời mắc bệnh, chiếm tỷ lệ khoảng 5,4% dân số toàn cầu, trong đó ĐTĐ type 2 chiếm 85-95%. Với tốc độ phát triển nhanh chóng (tăng 170%), bệnh ĐTĐ ở các quốc gia đang phát triển sẽ trở thành đại dịch. ở 5 Mỹ, theo thông báo của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh CDC, bệnh ĐTĐ tăng 14% trong 2 năm (2003-2005) và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở Mỹ.[1,5,17]Việt Nam nằm trong số các quốc gia có số ngời mắc bệnh ĐTĐ tăng nhanh chóng. Số liệu điều tra quốc gia năm 2002-2003 thông báo tỷ lệ mắc bệnh trong cả nớc là 2,7%. Hiệp hội ĐTĐ quốc tế và WHO phân loại tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đờng ở Việt Nam nằm trong khu vực 2 (tỷ lệ 2%-4,99%) cùng với các nớc trong khu vực nh Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia. [1]Với nhu cầu điều trị và dự phòng ĐTĐ, hàng loạt các thuốc tổng hợp đã đợc các tập đoàn, các công ty dợc phẩm nghiên cứu và phát triển nh sulfonylurea, các biguanid, thiazolidindion. Tuy nhiên các thuốc có nguồn gốc tổng hợp không phải là giải pháp tối u đối với quốc gia đang phát triển nh Việt Nam, lý do đa ra là giá thành điều trị cao, thuốc tổng hợp có phản ứng phụ với tác dụng không mong muốn. Thuốc có nguồn gốc thảo dợc đang đợc các nớc quan tâm và phát triển với u điểm là nguồn dợc liệu sẵn có, dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít tác dụng phụ dễ đợc cộng đồng chấp nhận, đặc biệt là các nớc kém phát triển và đang phát triển. [11,12,17]Để đánh giá hiệu quả tiền lâm sàng của các thuốc có nguồn gốc thảo dợc thì cần phải có những nghiên cứu đánh giá tác dụng dợc lý. Những nghiên cứu này nhằm sàng lọc đánh giá hiệu quả tiền lâm sàng của các thuốc trớc khi đa vào thử nghiệm lâm sàng. Xây dựng các mô hình bệnh lý để thử thuốc có ý nghĩa quan trọng nhằm đáp ứng những tiêu chuẩn về phát triển các sản phẩm thuốc mới của Bộ Y tế Việt Nam và WHO. Đã có một số các mô hình ĐTĐ đợc áp dụng ở Việt Nam, tuy nhiên vẫn cần có sự bổ xung nhằm mục đích hoàn thiện và phong phú các phơng pháp đánh giá tác dụng hạ đờng huyết của thuốc thảo dợc. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài Tạo mô hình tiểu đ-ờng trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đờng huyết một số chế phẩm tự nhiên với các nội dụng chính: - Xây dựng mô hình tiểu đờng (ĐTĐ) trên chuột nhắt trắng.6 - Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi (Lantana camara L. ) trên chuột nhắt trắng.Chơng 1 Tổng quan tài liệu1.1. Tổng quan về bệnh ĐTĐBệnh ĐTĐ, theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), là một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc vì có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin.[1,39,50] Các chuyên gia thuộc ủy ban chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ Hoa Kỳ lại đa ra định nghĩa về ĐTĐ nh sau: là một nhóm các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là tăng glucose máu, hậu quả của sự thiếu hụt bài tiết insulin; khiếm khuyết trong hoạt động của insulin; hoặc cả hai. Tăng glucose máu mạn tính thờng kết hợp với sự hủy 7 hoại, sự tăng rối loạn chức năng và sự suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu.[1,26]1.1.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam* Trên thế giới:ĐTĐ là bệnh không lây nhiễm có tốc độ phát triển nhanh chóng nhất trên thế giới. Điều đáng lo ngại là ĐTĐ tăng nhanh chóng ở các nớc đang phát triển. Theo thông báo của IDM: năm 1994 cả thế giới có 110 triệu ngời mắc bệnh ĐTĐ; đến năm 2000 con số này là 151 triệu ngời, dự báo đến năm 2010 con số này sẽ là 221 triệu ngời. [1,42]Bảng 1. Số liệu thông báo về tỷ lệ mắc ĐTĐ năm 1999 của một số quốc gia [1]NớcDân số(triệu)Số ca TĐ(triệu)Tỷ lệ %Typ 1(triệu)Typ 2 (triệu)Thái Lan 62 4,0 6,7 0,046 1,8Mỹ 250 10 4,0 0,75 9,0ấn Độ1200 38 4,0 0,176 38Hồng Kông 6,0 0,24 4,0 0,007 0,23Pakistan 160 4,6 3,0 0,4 4,2Đài Loan 20 0,424 2,1 0,004 0,04Trung Quốc 1300 24 2,0 1,2 23Indonesia 210 2,7 1,3 0,009-0,036 1,8-3,6WHO dự tính đến năm 2025 sẽ có 300-330 triệu ngời mắc bệnh ĐTĐ chiếm 5,4% dân số toàn cầu, còn theo Quỹ ĐTĐ thế giới (WDF) sẽ khoảng 300-339 triệu. Trong đó ở các nớc phát triển tăng 42%; các nớc đang phát triển tăng 170%. Theo CDC, ở Mỹ bệnh ĐTĐ tăng 14% trong 2 năm, từ 18,2 triệu ngời mắc bệnh ĐTĐ năm 2003 đến 20,8 triệu ngời năm 2005.[42]Số liệu thống kê của WHO cho thấy ĐTĐ typ 2 chiếm 85-95% tổng số ngời mắc bệnh ĐTĐ. Nghiên cứu sàng lọc ở Nhật Bản và Trung Quốc cho thấy, tỷ lệ ĐTĐ typ 2: ĐTĐ typ 1 ở lứa tuổi học sinh trung học là 4:1.[1,50]* ở Việt NamKết quả điều tra quốc gia năm 2002-2003 về tình hình ĐTĐ [1] cho thấy:- Tỷ lệ ĐTĐ toàn quốc là 2,7%, trong đó ĐTĐ ở nữ là 3,7%, ở nam là 3,3%.8 - Xét theo khu vực thì vùng đô thị và khu công nghiệp có tỷ lệ mắc ĐTĐ là 4,4% trong khi ở vùng núi cao tỷ lệ này là 2,1%.- Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở nhóm đối tợng có yếu tố nguy cơ, tuổi từ 30-64 chiếm tỷ lệ cao 10,5%. Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose là 13,8%.Theo phân loại của Hiệp hội Đái tháo đờng quốc tế và WHO, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ của Việt Nam nằm trong khu vực 2 (tỷ lệ 2-4,99%) cùng với các nớc trong khu vực nh Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia thấp hơn so với các nớc khu vực 3 (5%-7,99%) nh Nhật Bản, Hàn Quốc, Singapore. [1]1.1.2. Chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐa) Chẩn đoán:Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ, đợc Hiệp hội ĐTĐ Mỹ kiến nghị năm 1997 và đợc nhóm các chuyên gia về bệnh ĐTĐ của WHO công nhận vào năm 1998, tuyên bố áp dụng vào năm 1999 với 3 tiêu chí:(1) Có các triệu chứng của ĐTĐ lâm sàng; mức glucose huyết tơng ở thời điểm bất kì 11,1mmol/l (200mg/dl). (2) Mức glucose huyết tơng lúc đói 7,0mmol/l (126mg/dl)(3) Mức glucose huyết tơng 11,1mmol/l (200mg/dl) ở thời điểm 2 giờ sau nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đờng uống 75 gam đờng (loại anhydrous) hoặc 82,5 gam đờng (loại monohydrat). [1,18]Bảng 2. Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ theo IDM năm 2005. [1]Đặc điểm ĐTĐ typ 1 ĐTĐ typ 2Khởi phát Rầm rộ, kết hợp nhiều triệu chứngChậm, thờng không có triệu chứngBiểu hiện lâm sàng- Sút cân nhanh chóng- Đái nhiều- Uống nhiều nớc- Thể trạng béo- Tiền sử gia đình có ngời mắc bệnh đái tháo đờng typ 2.- Đặc tính dân tộc , có tỷ lệ mắc bệnh cao.- Chứng gai đen (Acanthosis nigricans)- Hội chứng buồng trứng đa nangNhiễm ceton Dơng tính Thờng không cóC-peptid Thấp/mất Bình thờng hoặc tăng9 Kháng thể - ICA dơng tính- Anti-GAD dơng tính - ICA âm tính- Anti-GAD âm tínhĐiều trị - Bắt buộc dùng insulin - Thay đổi lối sống- Dùng các thuốc hạ glucose máu bằng đờng uống.- Dùng insulinKết hợp với bệnh tự miễn khác Có Khôngb) Phân loại:* ĐTĐ typ 1Phân loại theo hình thái miễn dịch- Typ 1a: Chiếm 80%, thể này có các loại tự kháng thể kháng tế bào đảo tụy thoáng qua ngay từ lúc khởi đầu của bệnh. Loại này ít khi kết hợp với một bệnh tự miễn dịch nào khác, thờng có các typ HLA B15, HLA DR4. Thờng xảy ra sau khi bị nhiễm virus gây phá hủy tế bào . - Typ 1b: Các kháng thể kháng tế bào đảo tụy dai dẳng với hàm lợng cao. Th-ờng kết hợp với các rối loạn miễn dịch khác nh bệnh lý tuyến giáp; bệnh tuyến vỏ thợng thận; giảm chức năng tuyến sinh dục; thiếu máu ác tính. Đa số ngời bệnh là nữ giới có typ HLA- B8 và HLA- DR3.Phân loại theo diễn biến lâm sàng- ĐTĐ typ 1 thể không phụ thuộc insulin (thoáng qua)- ĐTĐ phụ thuộc insulin.* ĐTĐ typ 2- Những rối loạn không đồng nhất biểu hiện bằng giảm nhạy cảm với insulin ở gan, cơ vân, mô mỡ và sự suy chức năng của của tế bào , dẫn tới rối loạn bài tiết insulin.* ĐTĐ typ 1 không qua trung gian miễn dịchĐây là những trờng hợp ĐTĐ thiếu insulin nhng không có bằng chứng tự miễn. Thể bệnh này có yếu tố di truyền rất rõ. Đặc điểm lâm sàng là có những đợt thiếu insulin xen lẫn những giai đoạn bình thờng. [1]1.1.3. Sinh lý bệnh ĐTĐ10 [...]... glabrra) [17]v.v[10] 1.2 Mô hình bệnh ĐTĐ trên động vật thực nghiệm 1.2.1 Khái lợc về mô hình bệnh lý trên động vật thực nghiệm Mô hình động vật là mô hình mà ở đó động vật đợc gây bệnh hoặc tổn thơng tơng tự nh trên ngời Những điều kiện thử nghiệm này thờng đợc gọi là mô hình bệnh lý trên động vật Việc sử dụng các mô hình động vật cho phép các nhà nghiên cứu thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng,... Để có một mô hình phù hợp phản ánh một cách xác thực, các bệnh đợc mô hình hóa phải tơng tự về nguyên nhân và cơ chế gây bệnh giống nh ở ngời Mô hình động vật thờng đợc sử dụng trong nghiên cứu y sinh học (nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh, hoặc trong chẩn đoán, điều trị hoặc phát triển các thuốc nghiên cứu mới) Các mô hình bệnh lý trên động vật có thể có bản chất tự nhiên hoặc đợc gây ra bằng các tác nhân... trong mô hình bệnh động kinh - Làm tắc động mạch não giữa để gây mô hình bệnh đột quỵ - Tiêm virus hoặc vi khuẩn gây mô hình nhiễm khuẩn hoặc các bệnh cúm 17 - Sử dụng các tia ion phóng xạ để gây khối u - Chọn lọc di truyền chuột NOD gây mô hình ĐTĐ đờng - Cắt buồng trứng để gây bệnh loãng xơng - Dùng Plasmodium yoelii gây mô hình bệnh sốt rét Việc nghiên cứu và ứng dụng các mô hình bệnh lý trên các... thỏ, chuột cống, chuột nhắt trắng) đã trở nên phổ biến đặc biệt là trong nghiên cứu y dợc học [20,48] Một số các lĩnh vực khác cũng sử dụng mô hình động vật cho các nghiên cứu của mình nh tâm lý học, xã hội học quan sát hành vi động vật (mô hình hành vi) Hiện nay các nhà nghiên cứu đã phát triển rất nhiều các phơng pháp khác nhau trên cùng một loại mô hình bệnh nhằm tìm ra các mô hình phù hợp nhất và. .. định và từ từ mà không có sự thay đổi về nồng độ insulin máu Do nicotinamide là một chất chống oxi hóa bảo vệ tế bào bằng hoạt tính dọn gốc tự do (STZ sinh ra gốc tự do) và hạn chế tổn thơng tế bào beta đảo tụy trong ĐTĐ typ 2 [45] c) Chọn lọc và lai tạo Một số cá thể thuộc chủng chuột cống Wistar, chuột nhắt KK có biểu hiện rối loạn dung nạp glucose và tăng glucose huyết và kháng insulin mạnh trong tự. .. 9g/kg - Lô 4: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 12g/kg - Lô 5: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 15g/kg - Lô 6: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 18g/kg 2.3.4 Sàng lọc tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết trên CNT bình thờng a) Phơng pháp sàng lọc tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết nớc trên CNT bình thờng Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, trọng lợng từ 18-22g 30 chuột nhắt trắng chia... trong tự nhiên Nhằm tạo ra các chủng chuột có biểu hiện tăng glucose huyết và kháng insulin mạnh, các nhà nghiên cứu đã lai tạo giữa chuột nhắt chủng KK có rối loạn dung nạp glucose với chuột béo bệu lông vàng, tạo ra con lai KK-Ay có glucose huyết tăng cao và kháng insulin mạnh [17, 21,23, 29] Ngoài ra còn có chuột nhắt ob/ob(obese), db/db(diabetes), chuột cống ZDF (Zucker diabetic fatty), chuột cống... dùng liều cao chuột có thể bị ngộ độc hoặc chết làm ảnh hởng đến thí nghiệm Các nghiên cứu thử tác dụng hạ đờng huyết của thuốc đều rất cần sự ổn định đờng huyết trong thời gian dài (thờng vợt quá thời gian thí nghiệm) Tế bào đảo tụy bị phá vỡ thì sau một thời gian chuột chết - Liều gây mô hình ĐTĐ ổn định trong thời gian dài sẽ giúp đánh giá thuốc nghiên cứu một cách khách quan và hiệu quả Hình 10 Sự... 6,0g/kg - Lô 4: Chuột uống dịch chiết cồn với liều 1,6g/kg -3h (uống thuốc) 0h 35 1/2h 1h 2h Chỉ số glucose huyết ở thời điểm 0; 1/2; 1; 2 so sánh với thời điểm -3h Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P . học tự nhiên- -----------------------Nguyễn Trung QuânTạo mô hình tiểu đờng trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đờng huyết một số chế phẩm tự nhiênChuyên. huyết một số chế phẩm tự nhiên với các nội dụng chính: - Xây dựng mô hình tiểu đờng (ĐTĐ) trên chuột nhắt trắng. 6 - Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết