TẠO MÔ HÌNH TIỂU ĐƯỜNG TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG VÀ THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT 1 SỐ CHẾ PHẨM TỰ NHIÊN

TẠO MÔ HÌNH TIỂU ĐƯỜNG TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG VÀ THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT 1 SỐ CHẾ PHẨM TỰ NHIÊN

đại học quốc gia hà nội

trờng đại học khoa học tự nhiên

-Nguyễn Trung Quân

Tạo mô hình tiểu đờng trên chuột nhắt trắng

và thử tác dụng hạ đờng huyết một số

Lời cảm ơnTrớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Hoàng Thị Mỹ Nhung – Bộ môn Tế Bào Mô Phôi và Lý Sinh, Khoa Sinh Học

đã tận tình hớng dẫn, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu, các phơng pháp nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban đốc Viện Y học cổ truyền Quân đội, TS Nguyễn Thị Tuyết Nga và tập thể khoa Nghiên cứu Thực nghiệm, đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trờng Đại học Khoa học

Tự nhiên, Khoa Sinh học đặc biệt là các thầy cô giáo thuộc bộ môn Tế Bào Mô Phôi và Lý Sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian qua

Cuối cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin gửi lời cảm ơn đến những ngời thân trong gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

Hà Nội, tháng 12 năm 2009

Tác giả

Nguyễn Trung Quân

Những chữ viết tắt

ACTH Adrenocorticotropic hormone

Anti - GAD Glutamic acid decarboxylase antibodies

β Tế bào beta- đảo tụy Langerhans

CDC Centers for Disease Control and Prevention

(Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Mỹ)

Cv Coefficient of variation

(Hệ số biến thiên)

FDA Food and Drug Administration

ICA Islet cells antibodies

IDM International Diabetes Mellitus

(Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm)

Lời cảm ơn

Những chữ viết tắt

Mục lục

Trang

Chơng 1- Tổng quan……… 3

1.1 Tổng quan về bệnh ĐTĐ.……… 3

1.1.1 Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và ở Việt Nam……… 3

1.1.2 Chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ 4

1.1.3 Sinh lý bệnh ĐTĐ……….… 6

1.1.4 Thuốc điều trị ………… ……… 10

1.2 Mô hình bệnh ĐTĐ trên động vật thực nghiệm……… 12

1.2.1 Khái lợc về mô hình bệnh lý trên động vật thực nghiệm ……… 12

1.2.2 Streptozocin và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1 …… 13

1.2.3 Alloxan và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1……… ……… 16

1.2.4 Mô hình ĐTĐ typ 2…… ………… ……… 19

1.3 Cây Bông ổi (Lantana camara L)……… 19

1.3.1 Đặc điểm hình thái và phân bố … ………… 19

1.3.2 Thành phần hóa học … ……… 21

1.3.3 Công dụng và tác dụng duợc lý……… 22

Chơng 2- Đối tợng, Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 24 2.1 Đối tợng……… 24

2.2 Vật liệu, hóa chất……… 24

2.3 Phơng pháp nghiên cứu……… 25

2.3.1 Thử gây mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ và Alloxan trên CNT 25

2.3.2 Phơng pháp thu dịch chiết từ cây Bông ổi … 27

2.3.3 Phơng pháp thử độc tính cấp của dịch chiết cây Bông ổi……… 27

2.3.4 Sàng lọc tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết trên CNT bình th-ờng……… 28

2.3.5 Thử khả năng dung nạp glucose huyết trên CNT bình thờng của dịch chiết Bông ổi……… 29

2.3.6 Thử tác dụng hạ glucose huyết trên CNT gây ĐTĐ typ 1 bằng STZ ……… 30

2.3.7 Thử tác dụng hạ glucose huyết trên CNT gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ và chế độ giàu dinh dỡng……… 31

2.3.8 Phơng pháp định lợng glucose huyết……… 32

2.3.9 Phơng pháp xử lý số liệu……… 33

Chơng 3- Kết quả và thảo luận……… 35

3.1 Gây mô hình ĐTĐ typ 1……… 35

3.1.1 Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng alloxan……… 35

3.1.2 Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng STZ……… 38

3.2 Thu dịch chiết nghiên cứu và thử độc tính cấp của dịch chiết cây Bông ổi……… 40

3.2.1 Thu dịch chiết Bông ổi……… 40

3.2.2 Thử độc tính cấp dịch chiết cây Bông ổi ……… 41

3.3 Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên CNT 43 3.3.1 Sàng lọc liều có tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết Bông ổi 43 3.3.2 Thử tác dụng dung nạp glucose huyết của dịch chiết Bông ổi trên CNT bình thờng……… 46

3.3.3 Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 1 đợc gây bằng STZ……… 49

3.3.4 Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 2 đợc gây bằng STZ và chế độ ăn………… …… 51

Kết luận ……… 54

Tài liệu tham khảo 55

Mở đầu

Tiểu đờng (đái tháo đờng) là một trong những bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa có mức tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lợng cũng nh chi phí

điều trị trở thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế giới

Dự báo của các chuyên gia y tế từ những năm 90 của thế kỉ 20 đã và đang trở thành hiện thực “Thế kỉ 21 là thế kỉ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa” Theo WHO, năm 2025, sẽ có 300-330 triệu ngời mắc bệnh, chiếm tỷ lệ khoảng 5,4% dân

số toàn cầu, trong đó ĐTĐ type 2 chiếm 85-95% Với tốc độ phát triển nhanh chóng (tăng 170%), bệnh ĐTĐ ở các quốc gia đang phát triển sẽ trở thành “đại dịch” ở

Mỹ, theo thông báo của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh CDC, bệnh ĐTĐ tăng 14% trong 2 năm (2003-2005) và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở Mỹ.[1,5,17]

Việt Nam nằm trong số các quốc gia có số ngời mắc bệnh ĐTĐ tăng nhanh chóng Số liệu điều tra quốc gia năm 2002-2003 thông báo tỷ lệ mắc bệnh trong cả nớc là 2,7% Hiệp hội ĐTĐ quốc tế và WHO phân loại tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đờng

ở Việt Nam nằm trong khu vực 2 (tỷ lệ 2%-4,99%) cùng với các nớc trong khu vực

nh Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia [1]

Với nhu cầu điều trị và dự phòng ĐTĐ, hàng loạt các thuốc tổng hợp đã đợc các tập đoàn, các công ty dợc phẩm nghiên cứu và phát triển nh sulfonylurea, các biguanid, thiazolidindion Tuy nhiên các thuốc có nguồn gốc tổng hợp không phải là giải pháp tối u đối với quốc gia đang phát triển nh Việt Nam, lý do đa ra là giá thành

điều trị cao, thuốc tổng hợp có phản ứng phụ với tác dụng không mong muốn Thuốc

có nguồn gốc thảo dợc đang đợc các nớc quan tâm và phát triển với u điểm là nguồn dợc liệu sẵn có, dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít tác dụng phụ dễ đợc cộng đồng chấp nhận, đặc biệt là các nớc kém phát triển và đang phát triển [11,12,17]

Để đánh giá hiệu quả tiền lâm sàng của các thuốc có nguồn gốc thảo dợc thì cần phải có những nghiên cứu đánh giá tác dụng dợc lý Những nghiên cứu này nhằm sàng lọc đánh giá hiệu quả tiền lâm sàng của các thuốc trớc khi đa vào thử nghiệm lâm sàng Xây dựng các mô hình bệnh lý để thử thuốc có ý nghĩa quan trọng nhằm đáp ứng những tiêu chuẩn về phát triển các sản phẩm thuốc mới của Bộ Y tế – Việt Nam và WHO Đã có một số các mô hình ĐTĐ đợc áp dụng ở Việt Nam, tuy nhiên vẫn cần có sự bổ xung nhằm mục đích hoàn thiện và phong phú các phơng pháp đánh giá tác dụng hạ đờng huyết của thuốc thảo dợc

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài “Tạo mô hình tiểu ờng trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đờng huyết một số chế phẩm tự nhiên” với các nội dụng chính:

đ Xây dựng mô hình tiểu đờng (ĐTĐ) trên chuột nhắt trắng.

- Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi (Lantana camara L ) trên chuột nhắt trắng.

Chơng 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Tổng quan về bệnh ĐTĐ

Bệnh ĐTĐ, theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), là một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc vì có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin”.[1,39,50]

Các chuyên gia thuộc “ủy ban chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ Hoa Kỳ” lại

đa ra định nghĩa về ĐTĐ nh sau: là một nhóm các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là tăng glucose máu, hậu quả của sự thiếu hụt bài tiết insulin; khiếm khuyết trong hoạt

động của insulin; hoặc cả hai Tăng glucose máu mạn tính thờng kết hợp với sự hủy

hoại, sự tăng rối loạn chức năng và sự suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt

là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu.[1,26]

1.1.1 Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam

* Trên thế giới:

ĐTĐ là bệnh không lây nhiễm có tốc độ phát triển nhanh chóng nhất trên thế giới Điều đáng lo ngại là ĐTĐ tăng nhanh chóng ở các nớc đang phát triển Theo thông báo của IDM: năm 1994 cả thế giới có 110 triệu ngời mắc bệnh ĐTĐ; đến năm 2000 con số này là 151 triệu ngời, dự báo đến năm 2010 con số này sẽ là 221 triệu ngời [1,42]

Bảng 1 Số liệu thông báo về tỷ lệ mắc ĐTĐ năm 1999 của một số quốc gia [1]

Nớc Dân số(triệu) Số ca TĐ(triệu) Tỷ lệ % (triệu)Typ 1 Typ 2 (triệu)

Số liệu thống kê của WHO cho thấy ĐTĐ typ 2 chiếm 85-95% tổng số ngời mắc bệnh ĐTĐ Nghiên cứu sàng lọc ở Nhật Bản và Trung Quốc cho thấy, tỷ lệ

ĐTĐ typ 2: ĐTĐ typ 1 ở lứa tuổi học sinh trung học là 4:1.[1,50]

* ở Việt Nam

Kết quả điều tra quốc gia năm 2002-2003 về tình hình ĐTĐ [1] cho thấy:

- Tỷ lệ ĐTĐ toàn quốc là 2,7%, trong đó ĐTĐ ở nữ là 3,7%, ở nam là 3,3%

- Xét theo khu vực thì vùng đô thị và khu công nghiệp có tỷ lệ mắc ĐTĐ là 4,4% trong khi ở vùng núi cao tỷ lệ này là 2,1%.

- Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở nhóm đối tợng có yếu tố nguy cơ, tuổi từ 30-64 chiếm tỷ lệ cao 10,5% Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose là 13,8%

Theo phân loại của Hiệp hội Đái tháo đờng quốc tế và WHO, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ của Việt Nam nằm trong khu vực 2 (tỷ lệ 2-4,99%) cùng với các nớc trong khu vực

nh Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia thấp hơn so với các nớc khu vực 3 (5%-7,99%)

nh Nhật Bản, Hàn Quốc, Singapore [1]

1.1.2 Chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ

a) Chẩn đoán:

Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ, đợc Hiệp hội ĐTĐ Mỹ kiến nghị năm 1997

và đợc nhóm các chuyên gia về bệnh ĐTĐ của WHO công nhận vào năm 1998, tuyên bố áp dụng vào năm 1999 với 3 tiêu chí:

(1) Có các triệu chứng của ĐTĐ lâm sàng; mức glucose huyết tơng ở thời

điểm bất kì ≥ 11,1mmol/l (200mg/dl)

(2) Mức glucose huyết tơng lúc đói ≥ 7,0mmol/l (126mg/dl)

(3) Mức glucose huyết tơng ≥ 11,1mmol/l (200mg/dl) ở thời điểm 2 giờ sau nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đờng uống 75 gam đờng (loại anhydrous) hoặc 82,5 gam đờng (loại monohydrat) [1,18]

Bảng 2 Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ theo IDM năm 2005 [1]

- Tiền sử gia đình có ngời mắc bệnh

đái tháo đờng typ 2

- Đặc tính dân tộc , có tỷ lệ mắc bệnh cao

- Chứng gai đen (Acanthosis nigricans)

- Hội chứng buồng trứng đa nang

Kháng thể - ICA dơng tính

- Anti-GAD dơng tính

- ICA âm tính

- Anti-GAD âm tính

Điều trị - Bắt buộc dùng insulin - Thay đổi lối sống

- Dùng các thuốc hạ glucose máu bằng đờng uống

- Dùng insulinKết hợp với

Phân loại theo hình thái miễn dịch

- Typ 1a: Chiếm 80%, thể này có các loại tự kháng thể kháng tế bào đảo tụy thoáng qua ngay từ lúc khởi đầu của bệnh Loại này ít khi kết hợp với một bệnh tự miễn dịch nào khác, thờng có các typ HLA – B15, HLA –DR4 Thờng xảy ra sau khi bị nhiễm virus gây phá hủy tế bào β

- Typ 1b: Các kháng thể kháng tế bào đảo tụy dai dẳng với hàm lợng cao ờng kết hợp với các rối loạn miễn dịch khác nh bệnh lý tuyến giáp; bệnh tuyến vỏ thợng thận; giảm chức năng tuyến sinh dục; thiếu máu ác tính Đa số ngời bệnh là nữ giới có typ HLA- B8 và HLA- DR3

Th-Phân loại theo diễn biến lâm sàng

- ĐTĐ typ 1 thể không phụ thuộc insulin (thoáng qua)

- ĐTĐ phụ thuộc insulin

* ĐTĐ typ 2

- Những rối loạn không đồng nhất biểu hiện bằng giảm nhạy cảm với insulin

ở gan, cơ vân, mô mỡ và sự suy chức năng của của tế bào β, dẫn tới rối loạn bài tiết insulin

* ĐTĐ typ 1 không qua trung gian miễn dịch

Đây là những trờng hợp ĐTĐ thiếu insulin nhng không có bằng chứng tự miễn Thể bệnh này có yếu tố di truyền rất rõ Đặc điểm lâm sàng là có những đợt thiếu insulin xen lẫn những giai đoạn bình thờng [1]

1.1.3 Sinh lý bệnh ĐTĐ

a) Điều hòa cân bằng glucose máu

Trong điều kiện sinh lý bình thờng, glucose máu khoảng 5,6 mmol/l (100mg/dl) Khi cơ thể sử dụng nhiều glucid (lao động nặng, hng phấn thần kinh, sốt, ) glucose máu có thể lên tới 6,7 – 8,3 mmol/l (120 – 150 mg/dl) Trong…trạng thái ngủ nghỉ glucose máu có thể giảm tới 4,5 mmol/l (80mg/dl)

Nếu vợt quá 8,9 mmol/L (160mg/dl) thì glucose bị đào thải qua thận, nếu giảm xuống dới 3,3 mmol/L (60mg/dl) thì các tế bào thiếu năng lợng, có thể dẫn tới hôn mê

Bằng cơ chế điều hòa, cơ thể ngời bình thờng đợc duy trì lợng glucose máu trong khoảng 4,5 – 6,7 mmol/l (80-120mg/dl) Cơ chế điều hòa đợc kiểm soát bởi

hệ nội tiết và hệ thần kinh [18]

* Vai trò điều hòa của hệ nội tiết

Một số nội tiết tố có tác dụng lên enzym chuyển hóa glucid qua đó tác động đến sự cân bằng glucose huyết Có hai nhóm nội tiết tố kiểm soát đối lập nhau:

- Insulin làm giảm glucose máu

- Tập hợp các nội tiết tố và các chất làm tăng glucose máu

• Insulin:

Insulin do tế bào β của đảo tụy Langerhans tiết ra có tác dụng làm giảm glucose máu Insulin là một protein gồm 51 acid amin, đợc chia thành 2 chuỗi alpha (21 acid amin) và β (gồm 30 acid amin), đợc nối với nhau bằng các cầu nối S – S Thời gian bán hủy của insulin là 3- 5phút

Trung bình mỗi ngày tụy tiết ra 40-50 đơn vị insulin (IU), để đảm bảo nồng

độ glucose trong máu đợc duy trì giới hạn từ 4,4-5,3 mmol/l (80-95 mg/dl) Nồng độ insulin cơ bản trong huyết tơng cũng đảm bảo sự bài tiết glucose của gan với tỷ lệ 1,9-2,1mg/kg/phút [1,18]

Bảng3 Tóm tắt vai trò sinh lý của insulinTình trạng insulin cao (sau ăn) Tình trạng insulin thấp (lúc đói)

Phân hủy protein và tiết acid amin

• Hệ đối kháng với insulin:

Có tác dụng làm tăng glucose máu

- Adrenalin: kích thích tạo AMP vòng của tế bào đích, tăng hoạt hóa enzym phosphorylase ở gan làm tăng thoái hóa glucogen tạo glucose

- Glucagon: tác dụng tơng tự nh adrenalin nhng mạnh hơn và kéo dài hơn Glucagon còn kích thích phân hủy mỡ do enzym lipase đợc hoạt hóa bởi AMP vòng

- Glucocorticoid: ngăn cản glucose thấm vào tế bào (trừ tế bào não) Tăng hoạt hóa G-6-phosphatase làm tăng giải phóng glucose ở gan vào máu Tăng tân tạo glucose từ protid

- Thyroxin: tăng hấp thu đờng ở ruột, tăng phân hủy glycogen

- STH: tăng thoái hóa glycogen bằng cách ức chế enzym hexokinase STH còn hoạt hóa insulinase

- Insulinase và kháng thể chống insulin: trực tiếp phân hủy insulin

Hình 1 Kiểm soát tiết insulin trong tế bào beta

* Vai trò của hệ thần kinh

Đến nay các nhà khoa học đã phát hiện đợc hai trung tâm (A và B) ở vùng dới

đồi tham gia điều hòa glucose huyết thông qua hormon:

- Trung tâm A: gồm những tế bào thần kinh, không có mặt của insulin vẫn thu nhận đợc glucose từ máu Trung tâm này đại diện cho các tế bào không cần insulin vẫn thu nhận đợc glucose nh: tế bào não, gan, hồng cầu Khi glucose máu giảm xuống dới 4,5mmol/l thì trung tâm A bị kích thích làm tăng tiết glucagon, adrenalin, ACTH, LMH để tăng tạo glucose đạt đợc nồng độ 5,6 mmol/l

- Trung tâm B: Đại diện cho các tế bào còn lại của cơ thể, phải có insulin mới thu nhận đợc glucose Các tế bào loại này sử dụng đợc thể ceton nh là một nguồn năng lợng bổ xung quan trọng Khi thiếu insulin, trung tâm B sẽ huy động mọi cơ chế nội tiết làm tăng glucose máu, đủ thấm vào tế bào nhờ sự chênh lệch lớn về nồng

độ glucose trong và ngoài tế bào Tuy nhiên sự chênh lệch này phải đủ lớn (tăng gấp

4 lần bình thờng) mới xảy ra sự khuếch tán Nhng khi đó thì cũng có lợng lớn glucose bị thận đào thải (gặp trong bệnh tiểu đờng thiếu hụt insulin) [18]

b) Cơ chế bệnh sinh ĐTĐ

* Cơ chế bệnh sinh ĐTĐ typ 1

- Do yếu tố di truyền kém sản xuất insulin, phát bệnh tự nhiên, ít phụ thuộc vào điều kiện môi trờng Các gen có liên quan là HLA-DR3, HLA-D4 và DQW-8, còn gen kháng là HLA-DRW2, B7.[18]

Bệnh gặp ở 0,2-0,5% số ngời trong quần thể và chiếm 5-10% số ngời mắc bệnh tiểu

đờng

Các giai đoạn trong ĐTĐ typ 1:

- Giai đoạn 1 Bản chất di truyền – nhạy cảm gen

- Giai đoạn 2 Khởi phát quá trình tự miễn

- Giai đoạn 3 Phát triển một loạt các kháng thể

- Giai đoạn 4 Tổn thơng chức năng tế bào β đảo tụy

- Giai đoạn 5 Đái tháo đờng lâm sàng, phá hủy hoàn toàn hoặc gần nh hoàn toàn tế bào β đảo tụy Biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin có kèm biến chứng [1]

* Cơ chế bệnh sinh ĐTĐ typ 2

Sinh bệnh học ĐTĐ typ 2 diễn tiến qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1 Nồng độ glucose máu vẫn ở mức bình thờng, nhng có hiện tợng kháng insulin vì mức insulin tăng cao hơn mức bình thờng trong máu

Giai đoạn 2 Tình trạng kháng insulin có xu hớng nặng dần và xuất hiện tăng glucose huyết sau bữa ăn

Giai đoạn 3 Sự kháng insulin không thay đổi, nhng bài tiết insulin suy giảm và gây tăng glucose huyết lúc đói Bệnh ĐTĐ biểu hiện ra bên ngoài

Hình 2 Các giai đoạn tiến triển của ĐTĐ typ 2 [17]

Trong số các yếu tố môi trờng đóng vai trò thúc đẩy sự phát triển bệnh thì béo phì là yếu tố thờng đợc đề cập nhất Béo phì làm gia tăng tình trạng kháng insulin Nhiều bằng chứng cho thấy kiểm soát tốt tình trạng tăng cân béo phì sẽ làm giảm

đáng kể tình trạng kháng insulin và kiểm soát glucose huyết tốt [1,17]

Tóm lại sự thiếu hụt trong bài tiết insulin và tình trạng kháng insulin là nguyên nhân gây ĐTĐ typ 2 và béo phì là yếu tố thúc đẩy phát triển bệnh

1.1.4 Thuốc điều trị ĐTĐ

Trớc sự phát triển nhanh chóng của bệnh ĐTĐ, nhu cầu thuốc điều trị là rất lớn Trên thị trờng hiện nay có nhiều loại thuốc khác nhau chủ yếu là các thuốc có nguồn gốc tổng hợp và bán tổng hợp, dựa vào tác dụng và cơ chế có thể chia thành 3 nhóm sau đây:

- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin

- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin

- Các thuốc chống tăng glucose huyết sau bữa ăn

a) Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin

- Insulin điều hòa glucose huyết chủ yếu tại các mô đích là gan, cơ và mô mỡ Sau khi bài tiết, insulin đến các mô đích gắn vào thụ thể (receptor) đặc hiệu là một glycoprotein gồm hai đơn vị α (nằm ngoài tế bào) và hai đơn vị β (nằm trong tế bào)

đợc nối với nhau bằng cầu nối disulfid Insulin gắn vào phần thụ thể α, kích thích tyrosin kinase của thụ thể β trong tế bào, khởi động chuỗi phản ứng làm tăng tính thấm màng tế bào với glucose, giúp glucose vận chuyển vào tế bào nhanh hơn Sau khi vào tế bào, glucose đợc phosphoryl hóa thành glucose- 6 phosphat (G6P); từ đó G6P chuyển thành glycogen dự trữ hoặc tiếp tục bị oxy hóa để cung cấp năng lợng cho cơ thể

Các thuốc kích thích bài tiết insulin:

- Các nhóm sulfonylurea: gắn vào các thụ thể của nó ở các tế bào β đảo tụy làm chẹn kênh K, gây khử cực màng tế bào Kênh Ca2+ phụ thuộc điện thế mở ra cho phép Ca2+ vào trong tế bào Nồng độ Ca2+ trong tế bào tăng khởi động vận chuyển các hạt chứa insulin đến bề mặt tế bào và giải phóng insulin ra ngoài Trong nghiên cứu này cũng sử dụng gliclazid (Diamicron) liều 19,2mg/kg chuột tơng đơng với liều 80mg dùng cho ngời làm thuốc đối chứng dơng [6,11,13]

- Nhóm Nateglinid (Starlig): Trong cơ thể nateglinid gắn vào thụ thể đặc hiệu (SUR 1) ở tế bào beta đảo tụy làm chẹn kệnh Ca2+, Ca2+ từ ngoài vào trong tế bào kích thích giải phóng insulin [1,17]

b) Các thuốc làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin

- Các thuốc nhóm biguanid: ức chế tân tạo glucose tại gan, tăng tổng hợp glycogen Cải thiện khả năng hấp thu glucose ở các tế bào đích (tế bào cơ và tế bào mỡ) Tác động trực tiếp lên các chất vận chuyển (GLUT1 và GLUT4) tăng khả năng vận chuyển glucose vào tế bào

- Các thuốc nhóm thiazolidinedion: thuốc cải thiện tình trạng kháng insulin, tăng tổng hợp glycogen và giảm sản xuất glucose ở gan Thiazolidindion là chất

đồng vận chọn lọc trên receptor gamma tăng sinh - hoạt hóa peroxisom nhân điều hòa gen chuyển hóa lipid và glucid kiểm soát chuyển hóa tại mô đích (cơ, mỡ) Thiazolidin đòi hỏi sự có mặt của insulin

c) Thuốc chống tăng glucose huyết sau bữa ăn

Acarbose là thuốc ức chế enzym α- glucosidase của tế bào niêm mạc ruột Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm lại quá trình hấp thu tinh bột, dextrin và các disaccharid ở ruột non, tránh đợc tình trạng tăng glucose huyết sau ăn Ngoài ra thuốc còn ức chế cạnh tranh glucoamilase, sucrase

* Nhóm thuốc thảo dợc:

- Nhiều thuốc tân dợc đợc sử dụng điều trị ĐTĐ có hiệu quả tốt tuy nhiên hầu hết các thuốc đều có tác dụng phụ không mong muốn khi sử dụng trong thời gian dài do vậy phát triển thuốc có nguồn gốc từ thảo dợc là điều tất yếu Trong nớc có nhiều nghiên cứu chứng minh đợc hiệu quả hạ glucose huyết trên thực nghiệm của một số loại thảo dợc nh: quả chuối hột (Musa balbisiana) [15], hoa của cây Cơm cháy tròn (Sambucus nigra ssp canadensis (L.) R Bolli)[4], quả Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.)[12], cây Dừa cạn (Catharanthus roseus)[14], Rễ cây Chóc máu (Salacia cochinchinensis)[11], Bằng lăng nớc (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.)[6,7], Thổ phục linh (Smilax glabrra) [17]v.v [10]…

1.2 Mô hình bệnh ĐTĐ trên động vật thực nghiệm

1.2.1 Khái lợc về mô hình bệnh lý trên động vật thực nghiệm

Mô hình động vật là mô hình mà ở đó động vật đợc gây bệnh hoặc tổn thơng tơng tự nh trên ngời Những điều kiện thử nghiệm này thờng đợc gọi là mô hình bệnh lý trên động vật Việc sử dụng các mô hình động vật cho phép các nhà nghiên cứu thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng, để bảo đảm an toàn cho các nghiên cứu lâm sàng

Để có một mô hình phù hợp phản ánh một cách xác thực, các bệnh đợc mô hình hóa phải tơng tự về nguyên nhân và cơ chế gây bệnh giống nh ở ngời Mô hình

động vật thờng đợc sử dụng trong nghiên cứu y sinh học (nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh, hoặc trong chẩn đoán, điều trị hoặc phát triển các thuốc nghiên cứu mới)

Các mô hình bệnh lý trên động vật có thể có bản chất tự nhiên hoặc đợc gây

ra bằng các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học Ví dụ nh:

- Dùng metrazol (pentylenetetrazol) trong mô hình bệnh động kinh

- Làm tắc động mạch não giữa để gây mô hình bệnh đột quỵ

- Tiêm virus hoặc vi khuẩn gây mô hình nhiễm khuẩn hoặc các bệnh cúm

- Sử dụng các tia ion phóng xạ để gây khối u.

- Chọn lọc di truyền chuột NOD gây mô hình ĐTĐ đờng

- Cắt buồng trứng để gây bệnh loãng xơng

- Dùng Plasmodium yoelii gây mô hình bệnh sốt rét

Việc nghiên cứu và ứng dụng các mô hình bệnh lý trên các loài động vật (khỉ, chó, mèo, thỏ, chuột cống, chuột nhắt trắng ) đã trở nên phổ biến đặc biệt là trong…nghiên cứu y dợc học [20,48]

Một số các lĩnh vực khác cũng sử dụng mô hình động vật cho các nghiên cứu của mình nh tâm lý học, xã hội học quan sát hành vi động vật (mô hình hành vi)

Hiện nay các nhà nghiên cứu đã phát triển rất nhiều các phơng pháp khác nhau trên cùng một loại mô hình bệnh nhằm tìm ra các mô hình phù hợp nhất và gần nhất với các trờng hợp bệnh lý trên ngời

1.2.2 Mô hình ĐTĐ typ 1

ĐTĐ typ 1 là do sự tổn thơng tế bào beta đảo tụy (do tự miễn) các mô hình

ĐTĐ cũng đợc phát triển dựa trên nguyên tắc trên Mô hình ĐTĐ typ 1 đợc xây dựng bằng nhiều con đờng nhng cơ bản có 2 phơng pháp phổ biến:

* Gây ĐTĐ typ 1 bằng hóa chất:

Alloxan:

- Chuột cống (40-200mg/kg theo đờng tiêm tĩnh mạch hoặc màng bụng)

- Chuột nhắt (50-200mg/kg theo đờng tiêm tĩnh mạch hoặc màng bụng)

- Thỏ (100-150 mg/kg tiêm màng bụng)

- Chó (50-75 mg/kg tiêm màng bụng) [45]

Streptozocin:

- Chuột cống (35-65mg/kg tiêm màng bụng hoặc tĩnh mạch)

- Chuột nhắt (100- 200mg/kg tiêm màng bụng hoặc tĩnh mạch)

- Chuột Hamster (50 mg/kg tiêm màng bụng)

- Chó (20-30 mg/kg tiêm tĩnh mạch) [45]

* Gây ĐTĐ typ 1 bằng phơng pháp lai tạo và chọn lọc giống

Có 5 mô hình trên động vật đợc gây ĐTĐ typ 1 bằng phơng pháp lai tạo và chọn lọc giống:

- Chuột nhắt NOD (nonobese diabetic).

- Chuột cống BB (Bio-Breeding)

- Chuột cống LETL (Long Evans Tokushima Lean)

- Chuột cống KDP (Komeda diabetes Prone)

- Chuột cống LEW-iddm (Lew- insulin dependent diabetes mellitus) [20, 22,29,32,45]

Trong khuôn khổ cho phép của luận văn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu gây mô hình bệnh ĐTĐ typ 1 bằng hóa chất (alloxan và streptozocin)

a) Streptozocin và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1

Streptozocin còn có tên khác là Streptozotocin, N-(Methylnitrosocarbamoyl) -

α - D - glucosamine

* Tính chất vật lý & hóa học:

- STZ gồm hai chuỗi α và β – stereoisomers Tinh thể màu hơi vàng, trắng

đục, hòa tan trong nớc, ketone, cồn thấp độ, ít tan trong dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong dung môi hữu cơ không phân cực Chất tinh khiết dễ hút ẩm không khí và nhạy cảm với ánh sáng STZ phân hủy thành diazomethane trong dung dịch kiềm ở 00C

- Công thức mạch thẳng: C8H15N3O7

- Trọng lợng phân tử: 265,22 g/mol

- Thời gian bán hủy: 5- 15 phút

Hình 3 Cấu trúc hóa học của streptozocin

* Lịch sử phát triển

Streptozocin là một kháng sinh đợc phân lập vào cuối thập niên 50 của Thế kỉ

20 Thuốc đợc các nhà nghiên cứu công ty Dợc Upjohn (một công ty của Pfizer) ở Michigan phát hiện từ một chủng nấm sợi Streptomyces achromogenes có trong mẫu đất lấy ở bang Kansas (Mỹ) Upjohn đăng kí phát minh và bản quyền vào tháng

8 – năm 1958 và đợc trao giấy chứng nhận số U.S Patent 3.027.300 tháng 3 năm 1962

Giữa thập niên 60 (TK20) các nhà khoa học đã phát hiện ra tính độc chọn lọc của STZ đối với các tế bào beta đảo tụy, trong khi các tế bào này lại điều tiết nồng

độ glucose huyết bằng cách tiết ra các hormon insulin Đây là một gợi ý sử dụng thuốc để gây mô hình ĐTĐ typ 1, và điều trị ung th tụy Năm 1982, FDA đã trao giấy phép lu hành thuốc điều trị ung th tế bào đảo tụy dới tên thơng mại là Zanosar [35]

Hình 4 Streptozocin của hãng Sigma

- Khi đợc hấp thụ vào các tế bào beta, STZ đợc phân cắt thành glucose và một nửa còn lại là methylnitrosourea Vì có tính alkyl hóa nên tác động tới các đại phân

tử sinh học (ADN) dẫn tới phá hủy tế bào beta Đích hớng tới là các ADN ty thể, qua

đó tác động đến các chức năng tín hiệu quá trình trao đổi chất trong ty thể của tế bào beta, điều này cũng giải thích STZ có khả năng ức chế tiết insulin

- Tính chọn lọc của STZ với tế bào beta: STZ là chất đồng đẳng nitrosourea trong đó N- methyl-N-nitrosourea đợc liên kết với C-2 của hexose Nitrosoure tan trong lipid nên đợc hấp thụ dễ dàng vào mô qua màng sinh chất, kết quả của việc thay thế hexose là STZ ít tan trong lipid STZ đợc tích lũy chọn lọc trong tế bào beta

đảo tụy qua kênh vận chuyển glucose GLUT2 ái lực thấp nằm trong màng sinh chất

Do vậy những tế bào không biểu hiện kênh vận chuyển glucose sẽ kháng với STZ Quan sát này cũng giải thích độc tính của STZ lớn hơn so với N-methy-N-nitrosourea trong các tế bào xuất hiện kênh vận chuyển GLUT2 kể cả khi 2 chất này

đều alkyl hóa ADN tơng tự nhau

- Tính độc của STZ đối với tế bào beta: tính độc của STZ phụ thuộc vào hoạt tính alkyl hóa ADN của nhóm methylnitrosourea, đặc biệt là vị trí O6 của guanine

Sự vận chuyển của các nhóm methyl từ STZ tới các phân tử ADN gây nên tổn thơng kéo theo một loạt chuỗi sự kiện khác kết quả là dẫn tới bẻ gãy các phân tử ADN Sự glycosyl hóa protein có thể cũng đóng góp thêm một yếu tố tổn thơng Trong nỗ lực sửa chữa ADN , các enzym poly (ADP-ribose) polymerase bị kích thích quá mức dẫn tới làm giảm dự trữ NAD+ (sau đó là ATP) Sự suy kiệt trong dự trữ năng lợng của tế bào góp phần làm tế bào beta bị phân hủy [35]

Hình 5 Sơ đồ hoạt động của STZ [35]

- Tính độc của STZ còn đợc biểu hiện ở con đờng thứ 2 khi STZ tạo ra nitric oxide (NO) làm tổn thơng ADN và ức chế chu trình Krebs NO ức chế hoạt tính của enzym aconitase, đồng thời tăng cờng loại bỏ gốc phosphate của ATP sẽ bổ xung cơ chất cho xanthine oxidase và tăng cờng sản xuất axit uric Xanthine oxidase tiếp tục xúc tác phản ứng tạo thành anion superoxyde (O2-), hydrogen pereoxide (H2O2) và gốc (OH-) Các dạng oxy phản ứng (reactive oxygen species) này cũng tập trung phá hủy ADN dẫn tới sự huy động các enzym sửa chữa ADN và mất NAD+ ,giảm dự trữ ATP dẫn tới sự phá hủy tế bào beta Cũng có nghiên cứu chứng minh đợc sự giảm NAD+ cũng dẫn tới sự ức chế sinh tổng hợp và tiết insulin ở tế bào beta [35]

b) Alloxan và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1

Alloxan còn có tên khác là Mesoxalylurea 5- Oxobarbituric acid

* Tính chất vật lý & hóa học:

- Công thức mạch thẳng: C4 H 2 N 2 O 4 H 2 O

- Trọng lợng phân tử: 160,01 g/mol

- Tan trong nớc.

- Thời gian bán hủy: 1,5 phút

Hình 6 Cấu trúc hóa học của alloxan

* Lịch sử phát triển:

Alloxan đợc Brugnatelli phân lập lần đầu tiên vào năm 1818 Nhng cho đến năm 1838, Friedrich Wohler và Justus Liebig mới công bố trong nghiên cứu về bản chất acid uric và những bổ xung về phân tích hóa học chi tiết các chất mới gồm có alloxan, alloxantin, uramil, dialuric và murexide

Năm 1943, Dunn, Sheehan và McLetchie (Trờng Đại học Glasgow) báo cáo alloxan gây ra sự phá hủy tế bào đảo tụy ở thỏ Mặc dù trớc đó đã có những phát hiện về sự tăng glucose huyết khi sử dụng alloxan nhng không đợc công bố, và thiếu những nghiên cứu kiểm chứng

Rất nhiều các nghiên cứu sau này đã chứng minh alloxan là hợp chất thích hợp gây ĐTĐ trên động vật thực nghiệm Động vật đợc gây ĐTĐ bằng alloxan có những biểu hiện lâm sàng giống biểu hiện ĐTĐ lâm sàng trên ngời: sút cân, uống nhiều nớc, đái nhiều, có đờng trong nớc tiểu, keton niệu, glucose máu và keton máu [21,26,35]

Hình 7 Alloxan của hãng Sigma

Hình 8 Các phản ứng tạo ra các dạng oxy hoạt động gây độc tế bào β A, alloxan;

AH•, gốc tự do alloxan; AH2, dialuric acid; GS•, gốc glutathione; GSSG, glutathione

bị oxy hóa; OH•, gốc tự do hydroxyl; O•-, gốc superoxide [35]

- ức chế chọn lọc tiết insulin thông qua ức chế đặc hiệu enzym glucokinase (enzym nhạy cảm glucose của tế bào beta)

- Gây ra trạng thái tiểu đờng phụ thuộc insulin thông qua sự hình thành ROS (reactive oxygen species), dạng oxy phản ứng trong chuỗi phản ứng khử Khi có mặt của các thiol nội bào đặc biệt là các glutathione, alloxan tạo ra các dạng oxy phản ứng trong chuỗi phản ứng khử với sản phẩm khử của nó là acid dialuric Acid này tự

oxy hóa tạo thành các gốc superoxide, hydro peroxide, gốc hydroxyl Những gốc hydroxyl này gây nên sự phân hủy tế bào beta.[35]

1.2.3 Mô hình ĐTĐ typ 2

ĐTĐ typ 2 là sự rối loạn phức hợp liên quan đến các yếu tố di truyền, dịch tễ học, sự phát triển và môi trờng của mỗi cá thể Gây mô hình ĐTĐ typ2 thờng dựa trên chế độ dinh dỡng, hóa chất và yếu tố di truyền (gen), kết quả làm tăng glucose huyết và kháng insulin ở mô ngoại biên [37]

a) Chế độ dinh dỡng kết hợp với hóa chất

Chuột đợc nuôi bằng chế độ dinh dỡng giàu lipid, glucid trong một thời gian dài (khoảng 4 tuần- 8 tuần), sau đó đợc tiêm STZ liều thấp (25-60mg/kg) Các chuột này có đặc điểm tăng glucose huyết không nhiều, đặc điểm nổi bật là sự tăng tiết insulin và đợc gọi là chuột Fat/feed Mục đích của phơng pháp này là tạo mô hình thiếu hụt và kháng insulin, mô phỏng theo kiểu ĐTĐ typ 2 ở ngời [36,37,41,45,46]b) Hóa chất STZ kết hợp với Nicotinamide

Gần đây, một mô hình gây ĐTĐ typ 2 đợc phát triển bằng cách kết hợp giữa STZ và nicotinamid điều trị trên chuột cống Chuột cống đợc tiêm nicotinamid (180-230mg/kg, tiêm màng bụng) 15-30 phút trớc khi tiêm STZ (50-65 mg/kg, tiêm tĩnh mạch) tăng glucose máu ổn định và từ từ mà không có sự thay đổi về nồng độ insulin máu Do nicotinamide là một chất chống oxi hóa bảo vệ tế bào bằng hoạt tính dọn gốc tự do (STZ sinh ra gốc tự do) và hạn chế tổn thơng tế bào beta đảo tụy trong ĐTĐ typ 2 [45]

c) Chọn lọc và lai tạo

Một số cá thể thuộc chủng chuột cống Wistar, chuột nhắt KK có biểu hiện…rối loạn dung nạp glucose và tăng glucose huyết và kháng insulin mạnh trong tự nhiên Nhằm tạo ra các chủng chuột có biểu hiện tăng glucose huyết và kháng insulin mạnh, các nhà nghiên cứu đã lai tạo giữa chuột nhắt chủng KK có rối loạn dung nạp glucose với chuột béo bệu lông vàng, tạo ra con lai KK-Ay có glucose huyết tăng cao và kháng insulin mạnh [17, 21,23, 29]

Ngoài ra còn có chuột nhắt ob/ob(obese), db/db(diabetes), chuột cống ZDF (Zucker diabetic fatty), chuột cống GK (Goto-kakiraki) [45]…

Trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu gây mô hình bệnh ĐTĐ typ 2 trên CNT bằng chế độ dinh dỡng cao cùng với hóa chất streptozocin liều thấp

Cụm hoa mọc ở kẽ lá và đầu cành, là những bông co lại thành đầu giả hình cầu, đờng kính 1-3cm lá bắc dạng lá; hoa không cuống, màu đỏ, trắng, vàng, tím, da cam xen kẽ Đài hình chuông, có lông; tràng có ống hình trụ hẹp, 4-5 cánh tròn, có hai môi không rõ; nhị 4-5; bầu nhẵn

Quả hạch, hình cầu, vỏ ngoài nạc bao bọc trong đài

Mùa hoa quả: tháng 4-9 [2,9]

Hình 9 Cây Bông ổi (Lantana camara L.)

* Phân bố:

Chi Latana L có khoảng 150 loài trên thế giới Phần lớn là cây bụi, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Mỹ Một số loài ở vùng nhiệt đới châu Phi và ấn Độ Vùng Đông Nám á có 2 loài có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ là Bông ổi (Lantana camara L.) và Bông ổi ba lá (Latana trifolia L.)

ở Việt Nam, chi Latana L chỉ có một loài là cây Bông ổi, cha rõ thời điểm

du nhập Cây mọc tự nhiên khắp nơi, nhất là các tỉnh trung du và vùng đồi thấp ven biển Độ cao phân bố của cây lên tới 600m

Trong tinh dầu ở lá có 62 hợp chất đợc xác định Thành phần chủ yếu đợc xác

định bao gồm caryophylene (13,57%), α-caryophyllene (11.76%), germacrene D (10.88%), isocaryo-phyllene (9.59%), γ-muurolene (6.85%) and γ-elemene (5.65%) [2,9,30]

* Thân cây Bông ổi:

Thân cây chứa 9 hợp chất triterpen là hỗn hợp α – amyrin và β – amyrin, acid oleanolic, acid 3β- acetoxyolean – 12 – en – 28 – oic, lantaden A, lantaden B, acid betulinic, acid oleanonic, acid pomolic, và một số hợp chất khác campestrol, stigmasterol và β – sitosterol.

* Rễ cây: chứa 6 oligosaccharid và 6 iridoid glucosid đợc nhận dạng là stachyose, verbascose, ajugose, verbascotetraose, lantanose A, lantanose B, thevesid, lamiridosid và geniposid

Rễ còn chứa 8 triterpenoid là acid lantanolic, acid 22β – O – angeloyl – lantanolic, acid oleanolic, acid 22β – hydroxyolenonic, acid 19α- hydroxyursolic

và acid 3β – isovaleroyl – 19α – hydroxyurlic

* Hoa chứa 0,07% tinh dầu

* Hạt chứa 9% dầu béo trong đó có các acid béo: acid linoleic, acid oleic, acid stearic, acid palmitic [2]

Toàn cây có hederagenin, acid 25 – hydroxy – 3 – oxoolean – 12 – en – 28 – oic, umuhengenin (5- hydroxy – 6, 7, 3’, 4’, 5’ – pentamethoxyflavon) [2]

- Tác dụng chống sốt rét in vitro, dùng chủng K1 kháng đa thuốc của

Plasmodium falciparum Vỏ rễ Bông ổi có tác dụng khá với IC là 5 - 10àg/ml,

mạnh nhất trong số 49 cây thuốc chữa sốt rét trong y học Tanzania

- Tác dụng trên hồi tràng ruột lang cô lập: cao nớc lá Bông ổi gây co hồi tràng ruột lang cô lập; mức độ co phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của thuốc

- Gây ngộ độc: Động vật ăn lá và ngọn cây tơi của Bông ổi liều 10g/kg sẽ bị ngộ độc với triệu chứng: chán ăn, táo bón, vàng da và nhạy cảm ánh sáng Cơ quan

bị tổn thơng nhiều nhất là gan gây ứ mật Qua nghiên cứu cho thấy Lantaden A,

lantaden C và các hợp chất triterpenoid pentacyclic có trong lá gây độc cho gan [2,9,34]

* Tính vị, công năng theo y học cổ truyền

- Lá Bông ổi có mùi hôi, tính mát, hơi độc, có tác dụng hạ sốt, giải

độc, tiêu sng

- Hoa có vị ngọt nhạt, tính mát, có tác dụng cầm máu

- Rễ có vị ngọt dịu, đắng, tính mát, có tác dụng hạ sốt, tiêu độc, giảm đau

- Hoa trị ho, lao kèm ho ra máu và cao huyết áp, ngày dùng 12g

- Rễ trị sốt lâu không dứt, quai bị, phong thấp, đau xơng, đau răng, chấn

th-ơng bầm dập, khí h Ngày 30-60g cây tơi sắc uống

- Chữa ho ra máu, phổi kết hạch, lao phổi: hoa Bông ổi phơi khô 6-10g hoặc

để cây tơi 15-20g, nấu nớc, hãm hoặc chế siro uống

- Chữa ĐTĐ: toàn cây bỏ rễ 40g sắc uống thay chè Ngoài ra, ăn thêm củ mài,

củ súng hoặc bột thiên hoa phấn, ngày 10g [2,9]

- Theo y học cổ truyền ấn Độ: dùng nớc ép lá tơi trộn với sữa bò trị rắn cắn và côn trùng cắn Dịch chiết lá trộn với nớc ép quả chanh điều trị vết thơng bên ngoài [41]

- Một nghiên cứu tổng quan của ấn Độ, Việt Nam xếp Bông ổi vào nhóm các loài thực vật có tác dụng điều trị ĐTĐ và họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) cũng có nhiều loài có triển vọng điều trị ĐTĐ [ 2, 8,19, 28,38,48]

Chơng 2 Đối tợng, Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu

2.1 Đối tợng

2.1.1 Dợc liệu

Cây Bông ổi có tên khoa học Lantana camara L thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) đợc thu mua tại Trung tâm bảo tồn cây thuốc Văn Điển – Viện Dợc liệu

Thân và lá cây Bông ổi tơi đợc phơi khô tự nhiên, dùng làm nguyên liệu chiết xuất dịch chiết cho nghiên cứu tiếp theo

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng Mus musculus (chủng Swiss) cả 2 giống đực – cái, có trọng lợng 18-22 gam đảm bảo sinh lý khỏe mạnh, đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu, đợc Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp

Hàng ngày chuột đợc nuôi bằng thức ăn tổng hợp do Viện Kiểm nghiệm vắc xin và sinh phẩm cung cấp Chế độ quang chu kỳ 12 giờ sáng: 12 giờ tối

Đối với chuột đợc lấy máu xét nghiệm, lấy hết thức ăn khỏi lồng vào 16h hàng ngày

2.2 Vật liệu

- Ethanol 960, Nacl 0,9% (dung dịch tiêm truyền)

- Hóa chất: Streptozocin, Alloxan mua của Hãng Sigma

- Thuốc đối chứng Diamicron MR (có hoạt chất chính gliclazide 80mg) của hãng Servier (Pháp)

- Máy đo đờng huyết máy đo đờng huyết tự động One touch Ultra Easy của công ty Johnson-Johnson - tập đoàn Lifescan của (Mỹ)

- Bộ kít thử One touch Ultra Easy của công ty Johnson-Johnson - tập đoàn Lifescan (Mỹ).

- Bộ chiết ngấm kiệt thủy tinh

2.3 Phơng pháp

2.3.1 Thử nghiệm gây mô hình ĐTĐ typ 1

Tối u hóa liều Alloxan, STZ là một việc làm quan trọng trong quá trình gây tăng đờng huyết trên động vật thực nghiệm

Nếu dùng liều thấp động vật có thể tự phục hồi nồng độ glucose huyết trở về trạng thái ban đầu mà không cần bất kì sự can thiệp nào của thuốc Nếu dùng liều cao chuột có thể bị ngộ độc hoặc chết làm ảnh hởng đến thí nghiệm Các nghiên cứu thử tác dụng hạ đờng huyết của thuốc đều rất cần sự ổn định đờng huyết trong thời gian dài (thờng vợt quá thời gian thí nghiệm)

Tế bào β đảo tụy bị phá vỡ thì sau một thời gian chuột chết

- Liều gây mô hình ĐTĐ ổn định trong thời gian dài sẽ giúp đánh giá thuốc nghiên cứu một cách khách quan và hiệu quả

Hình 10 Sự thay đổi nồng độ glucose máu theo thời gian dùng alloxan

(pha I-IV) và STZ (pha II - IV) [35]

a) Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng alloxan

Qua nghiên cứu tài liệu cho thấy, hầu hết tiêm tĩnh mạch dùng liều 60-100mg/kg Trong khi nếu tiêm màng bụng thì liều cao gấp 2-3 lần

Alloxan đợc tiêm tĩnh mạch ở các mức liều khác nhau:

- Lô 1: Chuột đợc tiêm Alloxan liều 40mg/kg

- Lô 2: Chuột đợc tiêm Alloxan liều 60mg/kg

- Lô 3: Chuột đợc tiêm Alloxan liều 80mg/kg

- Lô 4: Chuột đợc tiêm Alloxan liều 100mg/kg

Định lợng glucose huyết vào ngày 0; ngày thứ 3; ngày thứ 7

Chuột có glucose huyết ≥ 10mmol/L đợc coi là thành công Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05

b) Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng STZ

Có nhiều tài liệu đã công bố về các mức liều dùng STZ để gây mô hình, trong phạm vi nghiên cứu luận văn khảo sát mức liều từ 50-200mg Kết quả khảo sát này dùng cho các nghiên cứu tiếp theo Chuột đợc tiêm màng bụng STZ ở các mức liều khác nhau:

- Lô 1: Chuột đợc tiêm STZ liều 50mg/kg

- Lô 2: Chuột đợc tiêm STZ liều 100mg/kg

- Lô 3: Chuột đợc tiêm STZ liều 150mg/kg

- Lô 4: Chuột đợc tiêm STZ liều 200mg/kg

Định lợng glucose huyết vào ngày 0; ngày thứ 3; ngày thứ 7

Chuột có glucose huyết ≥ 10mmol/L đợc coi là thành công Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05

Whatman sau đó cô cao tới tỷ lệ đặc nhất có thể Kết quả thu đợc cao đặc có tỷ lệ 3:1 (tơng ứng 3g dợc liệu khô/ml)

b) Dịch chiết Cao cồn

Thân, lá cây Bông ổi khô 1kg nghiền nhỏ đợc ngâm trong cồn 700 trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Sau 24 giờ dùng bình ngấm kiệt thu dịch chiết bằng phơng pháp nhỏ giọt và bổ xung cồn 700 liên tục Dịch chiết thu hồi đợc lọc bằng giấy lọc Whatman Dịch chiết đợc cô cao cách thủy bay hơi cồn Cao cồn thu đợc tiếp tục đ-

ợc sấy khô 600C thu cắn

2.3.3 Phơng pháp thử độc tính cấp của dịch chiết cồn, nớc từ cây Bông ổi

Thử độc tính cấp đợc tiến hành trên chuột nhắt trắng Chuột nhịn đói 16h trớc khi nghiên cứu Chuột đợc cho uống thuốc với các liều tăng dần

- Thể tích: cho uống 0,5ml/chuột (liều duy nhất trong đợt thực nghiệm)

- Theo dõi liên tục diễn biến của chuột thí nghiệm trong vòng 24h đầu, tiếp tục theo dõi các biểu hiện sinh lý trong 72h tiếp theo

- Sau 07 ngày, mổ chuột còn sống ở các lô nhận xét đại thể

- Tính LD50 theo phơng pháp Litchfield- Wilcoxon

b) Dịch chiết nớc

60 chuột đợc chia thành 6 lô nghiên cứu nh sau:

- Lô 1 (chứng): Chuột đợc uống nớc cất

- Lô 2: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 15g/kg

- Lô 3: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 30g/kg

- Lô 4: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 45g/kg

- Lô 5: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 60g/kg

- Lô 6: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 75g/kg

a) Dịch chiết cồn

60 chuột đợc chia thành 6 lô nghiên cứu nh sau:

- Lô 1 (chứng): Chuột đợc uống nớc cất