a) Dịch chiết nớc
Thân, lá cây Bông ổi khô 1kg đợc ngâm trong nớc cất 2h trớc khi sắc. Thân, lá cây đợc sắc 3 lần chiết theo tỷ lệ thể tích nớc cho vào/ thể tích dịch chiết nh sau: lần 1 (4:1), lần 2 (3:1), lần 3 (2:1). Gộp dịch chiết cả 3 lần đem lọc bằng giấy
Whatman sau đó cô cao tới tỷ lệ đặc nhất có thể. Kết quả thu đợc cao đặc có tỷ lệ 3:1 (tơng ứng 3g dợc liệu khô/ml) .
b) Dịch chiết Cao cồn
Thân, lá cây Bông ổi khô 1kg nghiền nhỏ đợc ngâm trong cồn 700 trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau 24 giờ dùng bình ngấm kiệt thu dịch chiết bằng phơng pháp nhỏ giọt và bổ xung cồn 700 liên tục. Dịch chiết thu hồi đợc lọc bằng giấy lọc Whatman. Dịch chiết đợc cô cao cách thủy bay hơi cồn. Cao cồn thu đợc tiếp tục đ- ợc sấy khô 600C thu cắn.
2.3.3. Phơng pháp thử độc tính cấp của dịch chiết cồn, nớc từ cây Bông ổi
Thử độc tính cấp đợc tiến hành trên chuột nhắt trắng. Chuột nhịn đói 16h trớc khi nghiên cứu. Chuột đợc cho uống thuốc với các liều tăng dần.
- Thể tích: cho uống 0,5ml/chuột (liều duy nhất trong đợt thực nghiệm).
- Theo dõi liên tục diễn biến của chuột thí nghiệm trong vòng 24h đầu, tiếp tục theo dõi các biểu hiện sinh lý trong 72h tiếp theo.
- Sau 07 ngày, mổ chuột còn sống ở các lô nhận xét đại thể. - Tính LD50 theo phơng pháp Litchfield- Wilcoxon
b) Dịch chiết nớc
60 chuột đợc chia thành 6 lô nghiên cứu nh sau: - Lô 1 (chứng): Chuột đợc uống nớc cất
- Lô 2: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 15g/kg - Lô 3: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 30g/kg - Lô 4: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 45g/kg - Lô 5: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 60g/kg - Lô 6: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 75g/kg a) Dịch chiết cồn
60 chuột đợc chia thành 6 lô nghiên cứu nh sau: - Lô 1 (chứng): Chuột đợc uống nớc cất
- Lô 2: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 6g/kg - Lô 3: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 9g/kg - Lô 4: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 12g/kg - Lô 5: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 15g/kg - Lô 6: Chuột đợc uống dịch chiết với liều 18g/kg
2.3.4. Sàng lọc tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết trên CNT bình thờng
a) Phơng pháp sàng lọc tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết nớc trên CNT bình thờng.
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, trọng lợng từ 18-22g
30 chuột nhắt trắng chia thành 5 lô, mỗi lô 6 con đợc dùng liều nh sau: - Lô 1 (chứng): Chuột uống nớc cất
- Lô 2: Chuột uống dịch chiết với liều 3g/kg - Lô 3: Chuột uống dịch chiết với liều 6g/kg - Lô 4: Chuột uống dịch chiết với liều 10g/kg - Lô 5: Chuột uống dịch chiết với liều 15g/kg
Chuột đợc uống với thể tích hằng định 0,5ml/con với liều duy nhất. Chuột nhịn đói 12 giờ trớc khi tiến hành thực nghiệm.
Lấy máu lần 1, thời điểm 0h. Các lần tiếp theo cách nhau 1h sau khi uống thuốc (0h; 1h; 2h; 3h; 4h). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.
0h 1h 2h 3h 4h
b) Phơng pháp sàng lọc tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết cồn trên CNT bình thờng.
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, trọng lợng từ 18-22g
- Lô 1 (chứng): Chuột uống nớc cất
- Lô 2: Chuột uống dịch chiết với liều 0,4g/kg - Lô 3: Chuột uống dịch chiết với liều 0,8g/kg - Lô 4: Chuột uống dịch chiết với liều 1,6g/kg - Lô 5: Chuột uống dịch chiết với liều 3,2g/kg
Chuột đợc uống với thể tích hằng định 0,5ml/con với liều duy nhất. Chuột nhịn đói 12 giờ trớc khi tiến hành thực nghiệm.
Lấy máu lần 1, thời điểm 0h. Các lần tiếp theo cách nhau 1h sau khi uống thuốc (0h; 1h; 2h; 3h; 4h). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.
0h 1h 2h 3h 4h
2.3.5. Thử khả năng dung nạp glucose huyết trên CNT của dịch chiết Bông ổi.
Chuột đợc nhịn đói trớc khi thí nghiệm 16 giờ. Chuột đợc uống thuốc nghiên cứu và đối chứng. Tiếp đó, sau 3h cho uống dung dịch glucose 30% liều 3g/kg thể trọng (cho uống liều 0,2ml/chuột 20g). Định lợng glucose huyết sau khi uống dung dịch glucose ở các thời điểm 0h; 1/2h; 1h; 2h.
30 chuột nhắt trắng chia thành 5 lô, mỗi lô 6 con đợc dùng liều nh sau: - Lô 1: Chuột uống nớc muối sinh lý (đối chứng âm)
- Lô 2: Chuột uống glyclazid liều 19,2 mg/kg (đối chứng dơng) - Lô 3: Chuột uống dịch chiết nớc với liều 6,0g/kg
- Lô 4: Chuột uống dịch chiết cồn với liều 1,6g/kg
-3h (uống thuốc) 0h 1/2h 1h 2h
Chỉ số glucose huyết ở thời điểm 0; 1/2; 1; 2 so sánh với thời điểm -3h. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.
- Chuột nhắt trắng đợc nuôi ổn định glucose huyết trong điều kiện phòng thí nghiệm 3-5 ngày.
- Tăng glucose huyết bằng cách tiêm màng bụng STZ liều duy nhất 150mg/kg pha trong dung dịch đệm citrat (pH 4,5).
-
Hình 11. Gây mô hình ĐTĐ typ1 bằng STZ
- Định lợng glucose huyết sau 72h, lựa chọn chuột có glucose huyết ≥ 10mmol/L và chia thành các lô nghiên cứu.
- Cho chuột uống thuốc và đánh giá tác dụng hạ glucose huyết tại thời điểm tr- ớc và sau khi uống thuốc. Lô uống dịch chiết đợc tiến hành so sánh cới lô đối chứng âm (uống dung môi pha thuốc) ; và lô chứng dơng (uống glyclazid). Thí nghiệm đợc thiết kế nh sau:
- Lô 1: Chuột uống nớc muối sinh lý (đối chứng âm)
- Lô 2: Chuột uống glyclazid liều 19,2mg/kg (đối chứng dơng) - Lô 3: Chuột uống cao nớc liều 6,0g/kg.
- Lô 4: Chuột uống cao cồn liều 1,6g/kg.
Đo glucose huyết ở thời điểm 0h và 4h (thời điểm thuốc có nồng độ cao nhất) uống thuốc. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.
N0 N3
0 4h
2.3.7. Thử tác dụng hạ glucose huyết trên chuột gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ và chế độ ăn
- Chuột nhắt trắng đợc nuôi chế độ giàu dinh dỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm 4 tuần.
Hàng ngày chuột đợc ăn thức ăn tổng hợp do Viện Kiểm nghiệm Vắc xin & Sinh phẩm cung cấp có bổ xung 20ml sữa đặc có đờng pha loãng và 0,1 ml mỡ động vật đa thẳng vào dạ dày chuột.
- Sau 4 tuần chuột có trọng lợng > 35g/con đợc chọn ra để tiêm STZ với liều 80mg/kg.
Định lợng glucose huyết sau 7 ng y, lựa chọn chuột có glucose huyết à ≥ 10mmol/L và chia thành các lô nghiên cứu. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.
Hình 12. Chuột béo phì đợc tiêm STZ liều thấp.
Chuột đợc chia lô và uống thuốc nghiên cứu trong 7 ng y tiếp theo.à - Lô 1: Chuột uống nớc muối sinh lý (đối chứng âm)
- Lô 2: Chuột uống glyclazid liều 19,2mg/kg (đối chứng dơng) - Lô 3: Chuột uống cao nớc liều 6g/kg.
- Lô 4: Chuột uống cao cồn liều 1,6g/kg.
Tất cả các lô này đợc uống thuốc vào 8h sáng hàng ngày trong 7 ngày tiếp theo. Đến ngày cuối cùng chuột đợc kiểm tra đờng huyết vào thời điểm
0h - 2h - 4h - 6h. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.
N(-7) N0 N7
0 2 4 6h
2.3.8. Phơng pháp định lợng glucose huyết
* Nguyên lý hoạt động
Nguyên tắc hoạt động của phơng pháp dựa trên chuỗi phản ứng tạo màu và đ- ợc đo bằng phơng pháp đo quang học để định lợng glucose huyết.
Phản ứng 1: dới xúc tác đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kít thử, glucose trong máu phản ứng với oxy (O2) không khí trong máu tạo thành axít gluconic và hydro peroxide (H2O2).
Phản ứng 2: Hydro peroxide tiếp tục phản ứng với O-Dianisidin tạo phức màu và đợc thiết bị đo quang học trong máy chuyển hóa định lợng biểu thị bằng số mmol/l hoặc mg/dl.
Hình 13. Định lợng glucose huyết trớc khi gây mô hình
Định lợng glucose huyết của chuột bằng cách cắt bỏ 2mm đuôi, để máu chảy tự nhiên, thấm bỏ giọt đầu tiên, rồi nhỏ 1 giọt vào test thử gắn với máy đo glucose huyết. Sau 20 giây, ghi nhận kết quả nồng độ glucose huyết (mmol/L). Chỉ số glucose huyết đợc đo bằng máy đo glucose huyết tự động và bộ kit thử One touch Ultra Easy của Hãng Johnson-Johnson của Mỹ.
2.3.9. Phơng pháp xử lý số liệu
Chỉ số glucose huyết đợc so sánh giữa thời điểm trớc và sau nghiên cứu; so sánh giữa các lô dùng thuốc và lô đối chứng ở cùng thời điểm.
* Tỷ lệ tăng glucose huyết đợc tính theo công thức
Tỷ lệ % tăng glucose huyết:
X1% = B – A x 100 A
X1 - Tỷ lệ % hạ glucose huyết
A - Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B - Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt đợc kiểm định bằng thuật toán t-test student với với P<0,05 có ý nghĩa thống kê.
* Tỷ lệ hạ glucose huyết đợc tính theo công thức dới đây
Tỷ lệ % hạ glucose huyết:
X2% = B – A x 100 (43) A
X2 - Tỷ lệ % hạ glucose huyết
A - Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B - Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt đợc kiểm định bằng thuật toán t-test student với với P<0,05 có ý nghĩa thống kê.
* Hệ số biến thiên:
Hệ số biến thiên đợc dùng để so sánh hai mẫu có phơng sai khác nhau để đánh giá độ phân tán của dãy số liệu. Hệ số biến thiên thấp thì dãy số liệu phân tán ít (số liệu tập trung hơn) hay kết quả chính xác hơn.
Cv(%) = S x 100
X
S - Độ lệch chuẩn X - Giá trị trung bình
*Một mô hình thực nghiệm dợc lý chỉ nói lên đợc một khía cạnh tác dụng của thuốc. Trong nghiên cứu này chúng tôi thử nghiệm tác dụng hạ đờng huyết của dịch chiết Bông ổi trên 3 mô hình khác nhau (mô hình thử khả năng dung nạp glucose, mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ, mô hình ĐTĐ typ 2 bằng STZ và chế độ ăn).
Chơng 3. Kết quả và thảo luận
3.1. Gây mô hình ĐTĐ typ 1
Xuất phát từ nguyên nhân gây bệnh tiểu đờng là sự thiếu hụt insulin do tế bào β- đảo tụy bị phá vỡ, các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều phơng pháp gây ĐTĐ typ 1 trong đó có phơng pháp sử dụng hóa chất Streptozocin và alloxan. Khi đợc dùng đ- ờng tiêm với liều thích hợp trên động vật thí nghiệm, STZ và alloxan này sẽ phá hủy tế bào β- đảo tụy, làm thiếu hụt insulin gây mô hình tiểu đờng typ 1 trên động vật thí nghiệm.
3.1.1. Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng alloxan
Trên thế giới có nhiều nghiên cứu sử dụng alloxan gây tiểu đờng typ 1, tuy nhiên liều sử dụng, đờng dùng và động vật thí nghiệm công bố có nhiều điểm cha t- ơng đồng. Qua nghiên cứu tài liệu, chúng tôi nhận thấy các nghiên cứu thờng sử dụng alloxan với liều tiêm tĩnh mạch đuôi từ 60 -100 mg/kg trên chuột nhắt trắng, liều tiêm màng bụng thờng gấp 2 lần liều tiêm tĩnh mạch đuôi trên cùng động vật. Trên cơ sở tổng quan tài liệu chúng tôi lựa chọn động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng, đờng dùng là đờng tiêm tĩnh mạch đuôi chuột, liều dùng đợc khảo sát từ 40- 100mg/kg trọng lợng chuột.
Bảng 4. Kết quả gây ĐTĐ typ 1 bằng alloxan tiêm tĩnh mạch đuôi chuột Lô thử nghiệm Chỉ số glucose huyết trung bình (mmol/l)X SE±
Ng y 0à Ng y 3à Ng y 7à Lô 1 (liều 40mg/kg) 4,87 ± 0,89 8,95 1,38•83,77%*± 9,11 1,34•87,06%*± Lô 2 (liều 60mg/kg) 5,86 1,24± 11,85 4,11•102,21%*± 12,22 4,03•108,53%*± Lô 3 (liều 80mg/kg) 5,27 0,49± 27,28 8,30•± 417,64%* 30,7 3,09•482,54%*± Lô 4 (liều 100mg/kg) 5,77 0,66± 30,9 3,72•± 435,52%* **
• Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của chỉ số glucose huyết tại thời điểm nghiên cứu so với ngày 0.
*Tỷ lệ % tăng glucose huyết thời điểm nghiên cứu so với ngày 0 ** Chuột chết 100%
Hình 14. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tỷ lệ tăng glucose huyết vào liều tiêm alloxan
Từ bảng 4 và đồ thị hình 14 cho thấy, ngày thứ 3 sau khi tiêm alloxan chuột ở các lô 2,3,4 có chỉ số glucose huyết trung bình ≥ 10 mmol/l. Chỉ số glucose huyết các lô 1,2,3,4 ở ngày 3 so với ngày 0 khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Chỉ số glucose huyết tăng ở tất cả các lô và cao nhất là ở lô 4 (435,52%). Tỷ lệ % glucose huyết tăng khi tăng nồng độ alloxan, sự thay đổi rõ rệt biểu hiện ở bớc chuyển liều từ lô 2(102,21%) sang lô 3 (417,64%) với tỷ lệ % tăng gấp 3 lần cho thấy ngỡng phá hủy mạnh của alloxan đối với tế bào β đảo tụy.
ở ngày thứ 7 tỷ lệ % tăng glucose huyết so với ngày 3 tăng không đáng kể nhng sự phá hủy mạnh của alloxan đối với tế bào β đảo tụy đã gây chết chuột. Chỉ số
glucose huyết các lô 1,2,3,4 ở ngày 7 so với ngày 0 khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.
Bảng 5. Tỷ lệ % gây mô hình thành công, tỷ lệ tử vong và hệ số biến thiên của alloxan
Lô
Tỷ lệ chuột đợc gây
TĐ thành công (%) Tỷ lệ chuột chết (%)
Hệ số biến thiên Cv(%)
Ngày 3 Ngày 7 Ngày 3 Ngày 7 Ngày 3 Ngày 7
Lô 1 10 30 0 0 15,41 14,71
Lô 2 50 80 0 0 34,68 23,98
Lô 3 80 60 20 40 30,42 10,06
Lô 4 50 0 50 100 12,03 0
Tỷ lệ gây mô hình thành công cao nhất ở lô 3 (80% chuột có chỉ số glucose huyết ≥ 10mmol/l). Tuy nhiên hệ số biến thiên của lô này là khá cao (30,42%) và có chuột chết với tỷ lệ (20%).
ở ngày thứ 7, chuột ở lô 2, 3 có chỉ số glucose huyết trung bình ≥ 10 mmol/l. Tỷ lệ thành công cao nhất ở lô 2 (80%) nhng hệ số biến thiên cao (23,98%). Với sự phá hủy mạnh mẽ tế bào đảo tụy khi tăng dần liều alloxan, tỷ lệ chuột chết ở lô 3 là 40% , chuột ở lô 4 chết 10 con (chiếm 100%). Tăng liều alloxan tỷ lệ thuận với tỷ lệ tử vong và mức độ phá hủy đảo tụy mạnh (biểu hiện glucose huyết tăng cao).
Với liều tiêm tĩnh mạch 60mg/kg vào ngày thứ 7 cho kết quả tốt nhất đáp ứng tiêu chuẩn gây ĐTĐ typ 1 (glucose huyết ≥ 10 mmol/l) và tỷ lệ tử vong thấp (0%) mặc dù hệ số biến thiên cao (23,98%). Cũng nh nhiều kết quả nghiên cứu khác đánh giá dùng alloxan cho nghiên cứu gây ĐTĐ typ 1 có hệ số biến thiên cao do vậy sẽ khó đánh giá chính xác khi tiến hành các thí nghiệm thử tác dụng hạ đờng huyết. Dùng alloxan để gây mô hình ĐTĐ typ 1 sẽ đợc cân nhắc khi không có nhiều sự lựa chọn.
3.1.2. Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng STZ
Tơng tự nh những nghiên cứu alloxan, liều dùng, đờng dùng của STZ trên các động vật thí nghiệm khác nhau đợc công bố có nhiều điểm cha đồng nhất. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn đờng tiêm màng bụng với động vật thí nghiệm là CNT, liều dùng đợc nghiên cứu ở các mức khác nhau (50; 100; 150; 200 mg/kg).
Bảng 6. Kết quả gây mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ tiêm màng bụng Lô thử nghiệm Chỉ số glucose huyết trung bình (mmol/l) X SE±
Ng y 0à Ng y 3à Ng y 7à Lô 1 (liều 50mg/kg) 6,53 0,58± 7,17 0,99± 9,8%* 10,48 2,22•± 60,49%* Lô 2 (liều 100mg/kg) 6,66 0,63± 7,82 0,61•± 17,42%* 11,85 0,96•± 77,93%* Lô 3 (liều 150mg/kg) 8,08 1,51± 18,09 0,82•± 123,88%* 28,58 2,77•± 253,71%* Lô 4 (liều 200mg/kg) 7,54 0,98± 28,61 0,97•± 279,44%* 32,43 1,01•± 330,1%*
• Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của chỉ số glucose huyết tại thời điểm nghiên cứu so với ngày 0.
*Tỷ lệ % tăng glucose huyết thời điểm nghiên cứu so với ngày 0.