PHÂN lập, TUYỂN CHỌN một số CHỦNG VI KHUẨN cố ĐỊNH đạm nội SINH TRONG rễ cây NGÔ tại một số địa điểm của đăk lăk

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆLÊ XUÂN CƯỜNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM NỘI SINH TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ

LÊ XUÂN CƯỜNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM NỘI SINH TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM CỦA ĐĂK LĂK

(Báo cáo tóm tắt luận văn tốt nghiệp thạc sỹ) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2013

Trang 2

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của

• Phân bón vi sinh ra đời 1896 tại Đức

• Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học

• Ở Việt Nam phân vi sinh đã được nghiên cứu từ những năm 1960

• Tình hình sản xuất phân vi sinh trong nước chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nhiệp

• Do đó việc nghiên cứu hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh

là việc làm hết sức cần thiết… Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo

ra chế phẩm [7]

• Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên cứu nào về thành phần loài của

vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk

Lăk

“Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong

rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Lăk”

Trang 3

MỞ ĐẦU

- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn cố định đạm trong rễ cây ngô ở Đăk Lăk

- Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủnng vi khuẩn có

hoạt tính cố định đạm cao làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô

1 Tính cấp thiết của

Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng vi khuẩn sống nội sinh trong rễ cây ngô có hoạt tính cố định đạm cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây ngô và góp phần phát triển

2 Mục tiêu của đề tài

3 Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa khoa học

- Xác định được một số chủng vi khuẩn có khả năng cố định

đạm, sống nội sinh trong rễ cây ngô

Trang 4

PHẦN II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

1 Phân lập, mô tả đặc điểm sinh học và định danh bằng sinh

học phân tử một số chủng vi khuẩn cố định đạm cộng sinh trong rễ cây

ngô

2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô

3 Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng

vi khuẩn nội sinh được tuyển chọn

Trang 5

2.2.2.Phương pháp phân lập. • Mẫu được thu thập một cách ngâu nhiên trên các nền

đất khác nhau

• Toàn bộ bộ mẫu rễ được đựng trong túi nilon đã khử

trùng và ghi nhãn:

+ Nơi lấy + Ngày lấy + Người thu mẫu

2.2.1.Phương pháp thu mẫu.

Vòng pellicle

Dòng thuần trên môi trường Nfb+cao nấm men+ amoniClorua

Sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh

vi hiếu khí Khuẩn lạc trên Nfb vô đạm

2.2.Phương pháp nghiên cứu.

Quá trình phân lập và làm thuần giống được thực hiện trên Nfb vô đạm.

Trang 6

2.2.3 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh.

Mô tả các đặc điểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, xác định đặc điểm sinh học và định danh theo khoá phân loại của

Trang 7

2.2.5 Phương pháp xác định khả năng cố định N của các chủng VK

Lưu ý: Mỗi chủng vi khuẩn 1 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có

10 bầu đất, thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Các chỉ tiêu theo dõi cây ngô sau khi gieo 45 ngày: Chiều cao cây, số lá trên cây, chiều dài lá, đường kính gốc, chiều dài rễ, khối lượng tươi, sinh khối khô.

2.2.5.1 Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục

+ Hàm lượng diệp lục và carotenoid được xác định bằng phương pháp so màu [36].

+ Xác định hàm lượng đạm tổng số trong lá bằng phương pháp Kjeldah

+ Xác định hàm lượng phosphat tổng số trong lá bằng phương pháp quang phổ.

2.2.6.Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh bằng phương pháp PCR xác định

gen nifH.

• Mồi đặc hiệu cho gen nifH cũng như quy trình cho phản ứng PCR

được cung cấp và thực hiện tại VCNSH &MT, trường Đại học Tây

Nếu xuất hiện vạch có kích thước 360bp thì kết luận vi

khuẩn phân lập có mang gen nifH, ngược lại.

2.2.7 Phương pháp định danh 16s các chủng vi khuẩn được tuyển chọn.

Gửi mẫu định danh tại Công ty TNHH Nam Khoa – TP HCM

để giải trình tự gen 16S xác định tên loài

Trang 8

2.2.8 Phương pháp nghiên cứu nhân nuôi sinh khối của các

chủng vi khuẩn được tuyển chọn

•Tối ưu môi trường nuôi cấy.

Trang 9

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập một số chủng VK cố định N trong

rễ cây ngô ở Đăk Lăk.

Sự hiện diện của VK nội sinh

vi hiếu khí Cấy truyền tạo dòng thuần

Các dòng thuần

• Phân lập được 31 dòng vi khuẩn kí hiệu từ C1 đến C31).

• Trong đó có 9 dòng ở Krông Năng C1 đến C9.

• 10 dòng ở dòng ở thành phố Buôn Ma Thuột C10 đến C19.

• 12 dòng ở huyện Ea Súp C20 đến C31

Vòng

pellice

Trang 10

3.2 Kết quả mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn cố định đạm

Hinh 1: Hình thái một số chủng vi khuẩn trên môi trường vô đạm Nfb

C11 C23

C14 - Trắng sữa C23 - Trắng sáng C31 - Vàng nhạt

C23 – Gram (-)

Trang 11

3.3.Kết quả nghiên cứu xác định khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn cố định đạm

•31 chủng phân lập được đều có khả năng sinh IAA.

• Cao nhất C14 13,51mg/l.

• Thấp nhất C28: 1,77mg/l

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Trang 12

3.4 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng của cây ngô trong bầu đất.(BẢNG 3.5)

• Số lượng lá tăng từ 26,7 - 33,3%.

• Chiều dài lá tăng từ 9 – 38,5%.

• Chiều cao cây tăng từ 7,4 - 44%.

• Đường kính gốc thân tăng 10,9 – 33%.

ĐC

C23

Đo các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô trong bầu đất

Trang 13

Chiều dài rễ tăng 4,5 – 26%; Khối lượng rễ 7,0 – 29,2%; Sinh khối tươi 12,5 -53,5%; Sinh khối khô 9,8 – 58,8% so với ĐC

Tác động của vi khuẩn cố định đạm đến hàm lượng chất khô của cây ngô trong vườn thí nghiệm

a

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Tác động của vi khuẩn cố định đạm lên khối lượng sinh khối tươi của cây ngô

trong vườn thí nghiệm

Biểu đồ A: Tác động của VK cố định

N đến sinh khối tươi của cây ngô.

Biểu đồ B: Tác động của VK cố định

N đến sinh khối khô của cây ngô.

Trang 14

• Kết quả khi xử lý số liệu và biểu đồ cho thấy có 29/31 NT khi nhiễm các

chủng VK cố định đạm làm cho tích lũy diệp lục tổng số có trong mẫu lá tăng 1,2 - 2,6 lần (tức tăng 11-84%) so với ĐC

• Tuy nhiên C7, C30 có tích lũy diệp lục tổng số cao hơn nhưng khác biết

không có ý nghĩa thông kê ở mức ý nghĩa 0,01.

3.5 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm đến hàm lượng diệp lục trong lá

Tác động của vi khuẩn cố định đạm đến hàm lượng

diệp lục tổng số trong lá cây ngô

p

a

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

Trang 15

3.6 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm đến hàm lượng N và phosphat tổng số của cây ngô.

• Tích luỹ N tổng số trong lá tăng 1,2 - 2,4 lần (tức tăng từ 5 - 45%) và tăng tích lũy P tổng số 1,1 -1,8 lần (22-38,9%) so với ĐC

• C1 tích lũy N thấp hơn so với ĐC

Tác động của vi khuẩn cố định đạm đến hàm lượng đạm tổng số trong lá cây ngô

Tác động của vi khuẩn cố định đạm đến hàm lượng phosphat tổng số trong lá cây

ngô trong vườn thí nghiệm

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35

• Sau khi phân tích các chi tiêu theo dõi chúng tôi tuyển chọn được 13 chủng có

phản ứng tốt khi cộng sinh với hệ rễ cây ngô, đó là các chủng: C31, C14, C23,

C30, C11, C29, C10, C16, , C13, C8, C21, C6, C18

Trang 16

3.7 Kết quả tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm bằng

phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn nội sinh mang gen nifH.

C n Giếng chứa DNA VK

Kết quả điện di các chủng vi khuẩn cố định N nội sinh với cặp mồi chuyên biệt cho gen nifH

• Như vậy qua quá trình sàng lọc chúng tôi tuyển chọn 3 chủng

xác định tên loài và nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nuôi của 3 chủng này.

Trang 17

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Pseudomonas nitroreducens

• Theo nghiên cứu của Ngô Thanh Phong và cộng

sự trường đại học Cần thơ khi phối hợp giữa 2 chủng Pseudomonas sp KG1 và Pseudomonas sp KG2 thay thế (50-75% N)

• Khi giải trình tự 16s thì chủng Pseudomonas

sp.BT2 này có mức tương đồng 99% với chủng P.nitroreducens [22] Đây cũng là cơ sơ khoa học

quan trọng để để chúng tôi khẳng định sự cố định

đạm của P nitoreducens khi sống nội sinh trong hệ

rễ của cây ngô Và trên thực tế khảo nghiệm các cây

ngô trong bầu đất có nhiễm chủng P nitroreducens

tích lũy N tổng số trong lá luôn cao hơn so với đối

3.9 Kết quả định danh 16s các chủng vi khuẩn được tuyển chọn.

Pseudomonas nitroreducens C14

• C14: Pseudomonas nitroreducens

Trang 18

Burkholderia sp KG2/Bur vô đạm

(Nguyển Thị Minh Thư, 2010, ĐH Cần Thơ)

B.Cenocepacia C23/ Nfb vô đạm

3.9 Kết quả định danh 16s các chủng vi khuẩn được

tuyển chọn.

• Chủng C23: Burkholderia cenocepacia ( bắp và mía của Reis, 2004)

Trang 19

3.9 Kết quả định danh 16s các chủng vi khuẩn được tuyển chọn.

C31: Pseudomonas entomophila

• Theo nghiên cứu (Dobereiner, 1992) thì Pseudomonas trong hệ rễ cây lúa làm

tăng N tổng 20 – 25% So với kết quả của chúng tôi khi nhiễm P entomophila

trong hệ rễ cây ngô làm cho tích lũy N tổng trong lá luôn cao hơn gấp 2 lần so

với ĐC, tăng 39% so với ĐC và cao hơn so với kết quả nghiên cứu

(Dobereiner) từ 14 - 19%

P.entomophila/ Nfb vô đạm

Trang 20

3.10 Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của chủng

f

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

• BMS là môi trường thuận lợi nhất cho sự tăng sinh của cả 3 chủng.

Trang 21

3.8.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối

của các chủng vi khuẩn.

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến các

chủng vi khuẩn cố định đạm

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

P nitroreducens B cenocepacia P.entomophila

•Thời gian tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Pseudomonas nitroreducens

và Burkholderia là sau 48h nuôi cấy

• Thời gian tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Pseudomonas entomophila

là sau 48h- 72h nuôi cấy.

Trang 22

3.8.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các chủng vi khuẩn

Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các

chủng vi khuẩn cố định đạm

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

• Tốc độ lắc tối ưu cho chủng Pseudomonas entomophila và Burkholderia là

150rpm/phút.

• Tốc độ lắc tối ưu cho chủng Pseudomonas nitroreducens là 150 -200rpm/phút.

Trang 23

3.8.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến

sinh khối của các chủng vi khuẩn.

Ảnh hưởng của pH đến sinh khối tế bà o của các chủng vi

khuẩn cố định đạm.

d

b c

g

i

f

c e

i

c d

h

j

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

• pH tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Burkholderia là

Trang 24

3.8.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối của các chủng vi

khuẩn cố định đạm

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

27oC 32oC 37oC 42oC

• Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Pseudomonas

nitroreducens và Pseudomonas entomophila là 320C, Burkholderia

cenocepacia là 370C

Trang 25

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1 Đã phân lập và mô tả đặc điểm hình thái của 31 chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên môi trường vô đạm Nfb Cả 31 chủng đều có khả năng sinh IAA.

2 Tuyển chọn được 9 chủng có phản ứng tốt với sự sinh trưởng, tích

luỹ chlorophyll, N, P…và dương tính với gen nifH (C6, C10, C13, C14, C18,

Khi nhiễm các chủng này vào hệ rễ cây làm tăng số lá 23 – 33%;

chiều dài lá; 18,8 – 38,5%, chiều cao cây 29,5 – 44,2%; đường kính gốc thân

24,3 – 31,5%; chiều dài rễ 24,2 – 25,9%; khối lượng rễ 21,9– 27%; sinh khối tươi 41,8 - 53,5%, sinh khối khô 48,8 – 58,8% ; tích luỹ diệp lục tổng số

tăng 69,4 -84,9%; tích lũy N trong lá tăng 35,4 – 54,2%; tích luỹ P tăng

Trang 26

3 Đã xây dựng được quy trình nuôi cấy của 3 chủng với các thông số sau:

Pseudomonas nitroreducens C14: Sinh trưởng tốt nhất trên BMS

sau 48h nuôi cấy với tốc độ lắc 150 -200 vòng/ phút ở pH 6,8 và nhiệt độ 32 0 C.

Pseudomonas entomophila C31: Sinh trưởng tốt nhất trên BMS sau

48h -72h nuôi cấy với tốc độ lắc 150 vòng/ phút ở pH 7,8 và nhiệt độ 32 0 C

Burkholderia cenocepacia C23: Sinh trưởng tốt nhất trên BMS sau

48h nuôi cấy với tốc độ lắc 150 vòng/phút ở pH 6,3và nhiệt độ 37 0 C.

KẾT LUẬN

Trang 27

1 Tiếp tục nghiên cứu định danh các vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk lăk có hoạt tính cố định đạm cao, có phản ứng tốt đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây ngô

2 Nghiên cứu về những đặc tính có lợi khác của chủng

Pseudomonas entomophila, Pseudomonas nitroreducens B

cenocepacia tác động lên sự sinh trưởng và phát triển của cây ngô

trên địa bàn tỉnh Đăk Lăk nói nói riêng và khu vực Tây Nguyên nói

chung làm cơ sở sản xuất các loại phân bón chuyên dụng cho cây ngô

KIẾN NGHỊ

Định dạng
Số trang	28
Dung lượng	7,56 MB