TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC có KHẢ NĂNG SINH ENZYME PROTEASE và β GLACTOSIDASE

Đặt vấn đề Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học các chế phẩmenzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vựcnhư: Chế biến thực p

`HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ

KHẢ NĂNG SINH ENZYME PROTEASE

VÀ β- GLACTOSIDASE

CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Hà Nội - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong Khóa luận này làtrung thực

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Khóa luận này đãđược cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong chuyên đề này đã được ghi rõnguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Sinh viên

NGUYỄN THỊ THOA

LỜI CÁM ƠN

Trong qúa trình thực hiện khóa luận tại phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa sinh –Công nghệ sinh học thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm – Học viện Nông nghiệpViệt Nam, được sự quan tâm, giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tạiphòng thí nghiệm của bộ môn, cùng sự cố gắng và nỗ lực của bản thân tôi đã hoànthành khóa luận tốt nghiệp của mình

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS Nguyễn Thị Lâm Đoàn– Bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, Khoa công nghệ thực phẩmngười đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện về mọi mặt tốt nhất chotôi suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như hoàn thiện khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ts Nguyễn Hoàng Anh, Th.s Phạm Thị Dịu, KS.Nguyễn Thị Hồng và các cán bộ phòng Thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Côngnghệ Thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đãgiúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, chỉ bảo ân cần của các thầy giáo, cô giáotrong Bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, Khoa Công Nghệ ThựcPhẩm – Trường Học viện Nông Nghiệp Việt Nam trong suốt thời gian hoàn thành khóaluận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, những người thân, bạn bè đã giúp đỡ vàđộng viên, khích lệ cho tôi trong thời gian trên

Với quỹ thời gian có hạn và sự hiểu biết còn nhiều hạn chế nên trong quá trìnhthực hiện khóa luận của tôi không tránh khỏi nhiều thiếu sót Kính mong có sự góp ýkiến của các thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Thoa

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CÁM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC VIẾT TẮT viii

PHẦN THỨ NHẤT-MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích, yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

PHẦN II -TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về enzyme protease 3

2.1.1 Enzyme protease 3

2.1.2 Nguồn thu nhận protease 3

2.1.3 Ứng dụng của protease 5

2.2 Enzyme β-galactosidase 8

2.2.1 Nguồn thu nhận 8

2.2.2 Ứng dụng enzyme β-galactosidase 9

2.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất protease và β-galactosidase trong và ngoài nước.10 2.4 Vi khuẩn lactic 12

2.4.1 Đặc điểm chung 12

2.4.2 Phân loại 13

2.4.3 Nhu cầu dinh dưỡng 13

2.4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường tới quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic 14

2.4.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn lactic trong việc thu nhận

enzyme 15

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Vật liệu 16

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.1.2 Môi trường nuôi cấy, thí nghiệm 16

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ: 17

3.2 Nội dung nghiên cứu 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 19

3.3.1 Phương pháp hoạt hóa và giữ giống 19

3.3.2 Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme protease, β-galactosidase 20 3.3.3 Xác định hoạt độ protease, enzyme β-galactosidase của chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn 21

3.3.4 Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng lactic có hoạt độ enzyme cao 24

3.3.5 Xây dựng đường cong hoạt độ của chủng lactic 25

3.3.6 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme chịu được nhiệt độ thấp 25

3.3.7 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme chịu pH thấp 25

3.3.8 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme bền pH thấp 25

PHẦN IV :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Tuyển chọn chủng lactic có hoạt tính protease, β-galactosidase 26

4.1.1 Kết quả chủng lactic có hoạt tính protease 26

4.1.2 Khả năng sinh enzyme β – galactosidase 28

4.2 Hoạt độ enzyme protease, β-galactosidase của vi khuẩn lactic 30

4.2.1 Hoạt độ enzyme protease 30

4.2.2 Hoạt độ enzyme β – galactosidase 31

4.3 Đường cong sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic có hoạt độ β-galactosidase cao 32

4.4 Đường cong hoạt độ của enzyme có hoạt độ cao 33

4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme chịu được nhiệt độ thấp 34

4.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme chịu được acid thấp 35

4.7 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme bền với acid thấp.35 PHẦN V - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHỤ LỤC 41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Chủng vi khuẩn lactic dùng trong thí nghiệm này 17

Bảng 3.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MRS 17

Bảng 3.3 Môi trường để xác định khả năng sinh protease 17

Bảng 3.4 Danh sách các thiết bị sử dụng để nghiên cứu đề tài 18

Bảng 3.5 Danh sách các hóa chất 18

Bảng 3.6 Số liệu dựng đường chuẩn oNP 24

Bảng 4.1 Đường kính vòng phân giải casein 11 chủng có vòng phân giải lớn .27 Bảng 4.2 Mức độ màu sắc của các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme β- 29

Bảng 4.3: Hoạt tính enzyme protease của 11 chủng vi khuẩn 31

Bảng 4.4 Hoạt độ β-galactosidase của vi khuẩn lactic 31

Bảng 4.5 Hoạt độ của enzyme ở các nhiệt độ 35

Bảng 4.6 Hoạt độ enzyme tại hai pH 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Phản ứng thủy phân của enzyme protease 4

Hình 2.2 Sơ đồ thủy phân lactose của enzyme β-galactosidase 9

Hình 3.1 Đường chuẩn oNP 24

Hình 4.1: Vòng phân giải casein của enzyme protease một số chủng lactic 28

Hình 4.2 Xác định khả năng sinh enzyme β-galactosidase bằng phương pháp đĩa thạch 29

Hình 4.3 Thể hiện đường cong sinh trưởng vi khuẩn lactic 33

Hình 4.4 Đường cong hoạt độ của enzyme 34

Hình 4.5 Hoạt độ tương đối của enzyme BE 1.9 36

Actinomycetes

FolinTricloacetic acid

PHẦN THỨ NHẤT-MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học các chế phẩmenzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vựcnhư: Chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế Hằng năm, lượng enzymeđược sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USDđược phân phối trong các lĩnh vực khác nhau Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủyphân được sử dụng cho việc thủy phân các chất tự nhiên ứng dụng trong ngành côngnghệ thực phẩm (Genckel và cs,2006)

Enzyme protease và β-galactosidase là hai enzyme thủy phân đều thuộc nhómenzyme công nghiệp quan trọng (Shehri và cs, 2004) chiếm khoảng 60-65% tổnglượng enzyme trên toàn thế giới (Genckel và cs, 2006) Protease là nhóm enzyme cókhả năng thủy phân protein, β-galactosidase còn được gọi là lactase, xúc tác cho quátrình thủy phân và chuyển hóa gốc β-D galactozyl, thủy phân lactose thành glucose vàgalactose (Davail và cs, 1994)

Hai enzyme này đều được ứng dụng quan trọng trong công nghiệp sản xuất cácsản phẩm từ sữa β-galactosidase để làm giảm hàm lượng lactose, tránh sự kết tinhlactose và tăng độ ngọt của sản phẩm, khả năng chịu lạnh và chịu pH acid đóng vai tròquan trọng trong quá trình thủy phân lactose ở các sản phẩm chế biến và sản phẩm sữalên men β-galactosidase có khả năng hoạt động ở pH acid trong sản xuất sữa chua vàphomat sẽ làm tăng quá trình acid hóa, làm giảm khả năng đông đặc của sữa chua vàtăng tốc độ phát triển cấu trúc và hương vị cho phomat (Parmjit S Panesar và cs,2010)

Protease giúp lên men và đông tụ casein trong sản phẩm sữa, phomat, tạo hương

vị đặc trưng cho sản phẩm Protease acid là protease có pH 2-4 như rennin, kết tủa sữarất hiệu quả và rất khác so với kết tủa bằng acid Dưới tác dụng của rennin, caseinchuyển thành paracasein kết hợp với canxi tạo thành quện sữa (gel)

Sản xuất enzyme từ nhiều nguồn khác nhau nhưng chủ yếu từ vi sinh vật do visinh vật sinh sản nhanh, sinh khối lớn Lactic là loại vi khuẩn có những đặc tính rất

cần thiết như là loại vi khuẩn rất an toàn trong thực phẩm, được sử dụng thường xuyêntrong thực phẩm của con người (sữa chua, dưa muối, ), dễ tìm kiếm hơn so với nhiềuloài vi khuẩn khác, có khả năng sinh acid nên nó có khả năng sinh trưởng bình thườngtrên môi trường có pH thấp, đây là hướng nghiên cứu mới nhằm chọn những chủng vikhuẩn lactic sinh enzyme protease, β-galactosidase có những đặc tính sinh học ứngdụng trong sản xuất chế biến sản phẩm từ sữa.

Ở Việt Nam hai enzyme đã được nghiên cứu ứng dụng và tách chiết từ nhiềunguồn khác nhau cũng ứng dụng tốt trong sản xuất như: Nghiên cứu sản xuất protease

từ những chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ứng dụng trong sản xuất nước mắm,

nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá basa, nghiên cứu khả năng

sinh enzyme lactase và tạo GOS của nấm mốc Aspergillus oryzae (Nguyễn Thu

Hương và cs 2013) Tuy nhiên những enzyme này chưa có nhiều nguồn từ lactic và pHrất hạn chế, chưa có nghiên cứu về chịu nhiệt độ thấp vì vậy vẫn chưa là nguồn enzyme lýtưởng cho sản xuất trong ngành chế biến sữa

Xuất phát từ thực tế đó mà đề tài: “Tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme protease và β-galactosidase”

1.2 Mục đích, yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme protease, β-galactosidase

từ một số chủng lưu giữ tại phòng thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ thựcphẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm

1.2.2 Yêu cầu

- Hoạt hóa các chủng vi khuẩn, giữ giống

- Tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme protease, galactosidase

β Xác định hoạt độ protease, ββ galactosidase của vi khuẩn đươc tuyển chọn

- Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic có hoạt độenzyme cao

- Xây dựng đường cong hoạt độ của vi khuẩn có hoạt độ enzyme cao

- Xác định một số đặc tính enzyme (chịu nhiệt độ thấp, chịu pH, và bền pH)

PHẦN II -TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về enzyme protease

2.1.1 Enzyme protease

Enzyme protease là một trong những enzyme được nghiên cứu từ lâu:

Năm 1836, Schwann đã quan sát khả năng phân giải protein của dịch vị Sau 30năm (1857) Covisart mới tách được enzyme này Đây được coi là protease chế phẩmđầu tiên

Năm 1874, Besaner mới công bố kết quả nghiên cứu protease từ đậu Năm

1879, Wurtz nghiên cứu nhựa đu đủ và thấy chúng có khả năng phân giải protein

Từ những năm 1950 sau khi hoàn thiện những phương pháp tinh sạch protein,người ta đã thu được các chế phẩm protease tinh khiết hơn Cũng từ đây các nhà khoahọc bắt đầu nghiên cứu protease của vi sinh vật

Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ phân liên kết peptide (- O– NH -) trong phân tử protein và các polypeptide Sản phẩm của quá trình thuỷ phânnày có thể là các amino acid, các peptide, các polypeptide chuỗi ngắn Nhiều proteasecòn có thể xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết ester, liên kết amid và phản ứng chuyển

vị gốc amino acid (Lê Ngọc Tú và cs, 1982; Nguyễn Hữu Chấn, 1996) Phản ứng theo

sơ đồ sau:

INCLUDEPICTURE

"http://khotailieu.com/content/resources/images/package014/7014512a8d67b6f624af3081814e1d6a/b4c9be6fbbaa3663dd3a99d3356455f3/129391-5/129391-5.001.png" \*

MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE

"http://khotailieu.com/content/resources/images/package014/7014512a8d67b6f624af3081814e1d6a/b4c9be6fbbaa3663dd3a99d3356455f3/129391-5/129391-5.001.png" \*

Hình 2.1: Phản ứng thủy phân của enzyme protease

2.1.2 Nguồn thu nhận protease

Enzyme protease là enzyme có trong mọi tế bào sinh vật Sau khi tổng hợpenzyme có thể được tiết ra ngoài tế bào, tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch môi trườnggọi là enzyme ngoại bào Các enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hoà tan trong tếbào chất hoặc trong các thành phần cấu tạo của tế bào chất, và chỉ có thể nhận đượcenzyme khi phá vỡ tế bào Đa phần enzyme thuỷ phân là enzyme ngoại bào Trongnhững tế bào của các cơ quan khác nhau hay các bộ phận dưới tế bào khác nhau thì cácenzyme có hàm lượng và thể loại khác nhau Do đó enzyme mang tính đặc trưng(Zanin G.M và cs, 1996) Protease có thể được thu từ các nguồn sau:

Ở động vật, protease thường có ở tuyến tiêu hóa: tuyến tụy, niêm mạc dạ dày,niêm mạc ruột non (Wang J và cs, 1999; Trần Ngọc Hùng, 2010) Ví dụ: pepsin từniêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát, cá được sử dụng để hỗtrợ tiêu hóa và dịch vị Rennin chỉ có ở ngăn thứ tư của dạ dày bê non dưới 5 thángtuổi, có khả năng làm đông tụ sữa, được sử dụng trong công nghiệp sản xuất phomat.Catalase có trong gan bò được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm (Trần NgọcHùng, 2010)

Ở thực vật, protease có thể có ở các thành phần thân, lá và đặc biệt trong quả(R Sangeetha và cs, 2008) Ví dụ: papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ,bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Al- Shehri và cs, 2004) Ficin có trong mủcây sung, quả sung, quả vải (Wang J và cs, 1999; Trần Ngọc Hùng, 2010)

Ở vi sinh vật, nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease như vikhuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi Protease có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môitrường nuôi cấy (Dương Thị Diễm Thanh, 2010; Phạm Thành Hổ, 2003) Các vi khuẩn

thông thường dùng trong tổng hợp protease là Bacillus subtilis, B cereus, B brevis, B.

licheniformis…sinh các protease trung tính B thermophilus tổng hợp protease chịu

nhiệt Xạ khuẩn tổng hợp protease gồm có S griseus, S rimosus…Nấm sợi tổng hợp protease gồm có Aspergillus oryzae, A awamori, A niger, một số loài Penicilium và

Rhizopus (Nguyễn Đức Lượng, 2003; Lương Đức Phẩm, 1978).

Trong ba nguồn sinh vật dùng để khai thác và thu nhận enzyme, nguồn vi sinhvật được khai thác và sử dụng nhiều nhất vì có các ưu điểm sau:

- Có thể chủ động quá trình sản xuất enzyme từ vi sinh vật vì quá trình sinhtrưởng, phát triển và tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vàođiều kiện ngoài

- Chu kì sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật ngắn do đó việc sản xuấtenzyme từ vi sinh vật trong thời gian ngắn từ 36 giờ – 60 giờ

- Có thể dễ dàng định hướng việc tổng hợp enzyme từ vi sinh vật theo hướngsản xuất chọn lọc enzyme với số lượng lớn

- Giá thành của enzyme sản xuất từ vi sinh vật thấp Môi trường nuôi cấy visinh vật thường đơn giản và rẻ tiền

- Các enzyme thu được từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao

- Vi sinh vật có thể cùng lúc sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau

2.1.3 Ứng dụng của protease

Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như côngnghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp (VũNgọc Bội, 2004; Nguyễn Hữu Chấn, 1996; Trần Ngọc Hùng, 2010)

* Công nghiệp thực phẩm

- Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạttính làm đông tụ sữa của chúng (Trần Ngọc Hùng, 2010) Tuy nhiên, protease vi sinhvật có nhược điểm là chúng còn có khả năng thủy phân sâu casein làm ảnh hưởng xấuđến chất lượng phomat (James E và cs, 1986) Ở Nhật Bản, từ canh trường bề mặt của

Mucor, người ta thu được chế phẩm protease dùng trong sản xuất phomat Một số

nước cũng thu được chế phẩm tương tự từ nấm mốc A candidus, hoặc từ B.

mensentericus.

- Trong sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian trộn bột,giảm độ nhớt của bột nhào do gluten gây ra, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độxốp và nở tốt hơn

- Trong công nghiệp chế biến thịt, đồ hộp, protease được dùng làm mềmthịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độmềm thích hợp và có vị tốt hơn Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm thủy phân

từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da, … (Đồng Thị Thanh Thu, 2003)

- Trong chế biến thuỷ sản, từ lâu người ta đã nghiên cứu và biết được tácdụng của các enzyme tiêu hóa và các enzyme khác có sẵn trong nguyên liệu có tácđộng tới quá trình thủy phân cá trong sản xuất nước mắm Để tăng hiệu quả quátrình thủy phân, rút ngắn thời gian chế biến nước mắm, làm giảm độ mặn ban đầucủa khối cá cũng như làm tăng diện tích tiếp xúc giữa protease và cá bằng cách xaynhỏ cá Thêm vào đó, người ta còn bổ sung thêm protease từ bên ngoài vào để làmtăng tốc độ, hiệu quả thủy phân protein cá (Vũ Ngọc Bội, 2004; Ling Lin Liu và cs,1988) Còn trong sản xuất bột cá nếu sử dụng protease sẽ dễ dàng tách da thịt ra khỏixương, bột cá mịn hơn, hiệu quả kinh tế cao hơn (Vũ Ngọc Bội, 2004) Bên cạnh đó,trong công nghiệp thực phẩm, protease được sử dụng để làm trong bia và nước hoaquả Ngoài ra, protease được sử dụng trong sản xuất rượu, giúp phân giải các protein

có tác dụng làm kìm hãm amylase, do đó sẽ làm tăng nhanh quá trình đường hóa tinhbột (Alagarsamy sumanth, 2005)

* Công nghiệp nhẹ

Protease được sử dụng để sản xuất chất tẩy rửa, nước lau kính, kem đánh răng

và đặc biệt là trong sản xuất bột giặt, nhằm làm tăng khả năng tẩy rửa các vết bẩn cóbản chất protein Một số protease kiềm thương mại được sử dụng chất tẩy bột giặt nhưAlcalase, Everlase, Esperrase do hãng Novo sản xuất (Vũ Ngọc Bội, 2004; Trần NgọcHùng, 2010)

- Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân

một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng.Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tínhchất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da (Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009) Trướcđây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa củađộng vật

Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B mesentericus, B subtilis), nấm sợi (A oryzae, A flavus) và xạ khuẩn (S fradiae, S griseus, S rimosus ) vào

công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng.Một số sản phẩm protease dùng trong công nghệ thuộc da do công ty Novo sản xuấtnhư Greasex, NovoCor, …(Alagarsamy sumanth, 2005)

- Trong công nghiêp dệt và sản xuất tơ tằm, protease được sử dụng để làmsạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được xử lí bằng các dung dịch casein,gelatin) để sợi được được bóng, dễ nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớpxerisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do

đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng

- Ngoài ra, protease còn được ứng dụng trong sản xuất mĩ phẩm và hươngphẩm Các hương phẩm thường có tác dụng phục hồi da lão hóa và trong chừngmực nhất định cũng có tác dụng sát trùng Còn các enzyme kiểu keratinase có tácdụng làm mềm lông, tóc Vì vậy, hiện nay một số nước đã sản xuất những loại kem

có chứa enzyme để xoa mặt, xoa da và cạo râu…Dưới tác dụng của protease trongkem, các biểu bì của da chết sẽ được tách ra, da non mới sẽ xuất hiện trên bề mặt,đồng thời sự phát triển của lông (tóc) cũng được làm chậm lại

* Nông nghiệp

Protease được sử dụng để xử lý nhằm tận dụng các phế liệu giàu protein làmthức ăn cho động vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa và hệ số tiêu hóa thức ăn(Alagarsamy sumanth, 2005) Có hai cách sử dụng trộn enzyme vào thức ăn trước khidùng hoặc xử lý thức ăn với enzyme để chuyển thành dạng dễ tiêu hóa rồi mới cho vậtnuôi ăn (Trần Ngọc Hùng, 2010) Kết hợp sử dụng protease với amylase, cellulase để

xử lý các phế liệu nông nghiệp, cải tạo đất phục vụ nông nghiệp Ngoài ra, protease

còn được sử dụng để thủy phân giun quế thành dịch acid amin làm thức ăn cho ấutrùng tôm (Trần Đình Toại và cs, 2007).

* Y học

Chế phẩm protease được sử dụng để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗnhợp giàu protein và acid amin dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác.Người ta còn dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh khángđộc để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch) ( Lê Ngọc Tú, 2002)

Một số protease như trypsin, α – chymotrypsin dùng để sản xuất thuốc chữabệnh kém tiêu hóa, bệnh nghẽn mạch, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông đường hô hấp,bệnh thiếu enzyme bẩm sinh, GS TSKH Phan Thị Trân Châu đã kết hợp cùng vớiviện Quân Y 108 nghiên cứu sử dụng protease có tên gọi prozimabo để điều trịphỏng Kết quả cho thấy giả mạc rụng nhanh và vết phỏng nhanh khỏi (Vũ Ngọc Bội,2004; Phan Thị Trân Châu, 1983)

2.2 Enzyme β-galactosidase

β-galactosidase là enzyme có khả năng xúc tác cho hai kiểu phản ứng: phản ứngthủy phân và phản ứng chuyển gốc galactozyl Phản ứng thủy phân chính của β-galactosidase là thủy phân đường đôi lactose thành hai đường đơn glucose vàgalactose, và trong một số trường hợp enzyme tham gia phản ứng transgalactosylationchuyển gốc galactose đến cơ chất lactose tạo galactose - oligosaccharides (GOS)(Davail và cs, 1994) Galactose - oligosaccharides cùng với fructo - oligosaccharidesđược nghiên cứu nhiều nhất tạo ra prebiotic oligosaccharides có lợi cho con ngườibằng cách kích thích sự tăng trưởng và hoạt động của vi khuẩn có lợi trong hệ tiêu hóacủa người

Hình 2.2 Sơ đồ thủy phân lactose của enzyme β-galactosidase

2.2.1 Nguồn thu nhận

β-galactosidase hay còn gọi là lactase trong tự nhiên có thể tìm thấy ở các loàithực vật, động vật và vi sinh vật Tuy nhiên, tính chất của enzyme được thu nhận từcác nguồn khác nhau có sự khác nhau rõ rệt Enzyme được sản xuất từ vi sinh vật ngàycàng nhiều, là nguồn duy nhất được sử dụng như nguồn sản xuất enzyme theo quy môcông nghiệp Nguồn enzyme từ động vật và thực vật rất khó triển khai theo quy môcông nghiệp vì những hạn chế sinh lí và hạn chế kỹ thuật So với động vật và thực vật,

vi sinh vật có rất nhiều ưu điểm (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Những ưu điểm đó là:

Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh

Trong một thời gian ngắn, ta có thể thu được một lượng sinh khối rất lớn Nhiềunghiên cứu cho thấy rằng trong một ngày đêm, tốc độ tạo sinh khối ở vi sinh vật caogấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối của động vật và thực vật Để đạt đượctốc độ tăng sinh khối lớn như vậy, vi sinh vật phải chuyển hóa một khối lượng cơ chất

rất lớn Cũng từ nghiên cứu trên E.coli, nhiều nhà khoa học cho thấy rằng trong vòng

24 giờ, vi khuẩn E.coli có thể chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn hơn một ngàn

lần khối lượng cơ thể chúng Để chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn như vậy,chúng phải tổng hợp ra được lượng enzyme rất lớn Bởi vì, mọi chuyển hóa cơ chấttrong tế bào là do enzyme đảm nhận Chính vì thế, nếu sử dụng vi sinh vật như nguồnsinh học để sản xuất enzyme rất có lợi Trong một khoảng thời gian ngắn, khôngnhững ta thu được lượng sinh khối lớn (để thu enzyme nội bào) mà còn thu đượclượng enzyme ngoại bào vừa nhiều, vừa có hoạt tính riêng rất cao

Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao

Ưu điểm này gắn liền với tốc độ chuyển hóa cơ chất và gắn liền với tốc độ sinhsản và phát triển của vi sinh vật

Vi sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp

Trong sản xuất này, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của

vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài Trong khi đó, sản xuấtenzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được

Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và

dễ kiếm

Đây cũng chính là lợi thế rất quan trọng Nhờ đó, ta có thể làm giảm giá thànhsản phẩm và có thể sản xuất ở mọi nơi trên thế giới

2.2.2 Ứng dụng enzyme β-galactosidase

Enzym β-galactosidase có vai trò vô cùng to lớn trong ngành công nghiệp thực

phẩm và phần lớn trong ngành công nghiệp chế biến sữa, ứng dụng chính là trongthủy phân lactose trong sữa, tách lactose thành glucose và galactose (Davail và cs,1994) Thủy phân lactose trong whey là một trong ứng dụng quan trọng của β-galactosidase trong ngành công nghiệp chế biến sữa, giúp làm tăng độ ngọt của sảnphẩm (Rosenberg M, 2006) Enzyme này được sử dụng trong ngành công nghiệp sữa

để sản xuất sữa và các sản phẩm sữa không có lactose, khắc phục tình trạng khôngdung nạp lactose ở con người (Haju và cs, 2012)

Ngoài ra, sữa được thủy phân lactose được sử dụng cho việc chế biến hương liệusữa, phô mai, và sữa chua Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng sữa chế biến thựcphẩm cũng ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và sản phẩm sữa cô đặc.Hơn nữa việc sử dụng sữa đã thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làmtăng quá trình acid hóa, bởi vì thủy phân lactose thường là bước làm chậm tốc độ củaquá trình, làm giảm thời gian đông đặc của sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc

và hương vị cho pho mat (Parmjit S Panesar và cs, 2010) Chất lượng của sữa đônglạnh và kem làm từ sữa cũng được cải thiện đáng kể khi thêm enzym β-galactosidase

Nó chống lại sự kết tinh đường lactose bằng cách thủy phân thành glucose vàgalactose và làm giảm cấu trúc cát sạn

Từ những ứng dụng thực tiễn trên mà β-galactosidase đã được các nhà khoa họcquan tâm để tách chiết enzyme từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau, để có tiến hànhnghiên cứu sản xuất ở quy mô công nghiệp

2.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất protease và β-galactosidase trong và ngoài nước

Protease

Trên thế giới Năm 1970, Kerry T Yasunobu và James Mc Conn đã nghiên cứu

tách chiết protease trung tính từ môi trường S nuôi B subtilis theo phương pháp nuôi

bán rắn và nhận thấy protease này là một protease kim loại có ion Ca2+ trong trung tâmhoạt động, có pH từ 6.5-7.5, nhiệt đô là 570C Protease này bị ức chế bởi Cu2+, Ni2+,

Hg2+, Pb2+, Cd2+, Fe2+ và khi có mặt của ion Ca2+ enzyme này có thể bền trong khoảng

pH từ 5.5-10 (Kerry T và cs, 1970)

Protease kiềm do Kottwitz, Beatrix và cs nghiên cứu cho

biết protease kiềm này được chiết tách từ thể đột biến B lentus, vị trí các amino

acid đột biến là 61, 199, 211, làm tăng độ phong phú của công nghệ sản xuấtenzyme từ vi sinh vật

Ở Việt Nam, Trần Thị Hồng Nghi, Lê Thanh Hùng, Trương Quang Bình (2009),

nghiên cứu ứng dụng enzyme protease từ vi khuẩn (B subtilis) để thủy phân phụ phẩm

cá tra

Nguyễn Hiền Trang, Đỗ Thị Bích Thủy (2006), tuyển chọn và nghiên cứu một

số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào của

B amyloliquefaciens T9.

Đỗ Thị Bích Thủy (2006), nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn B subtilis để

loại bỏ protein ra khỏi phần vỏ phế liệu

Phan Thị Bích Trâm và các cs thuộc Đại học Cần Thơ đã tiến hành “tinh sạch

và khảo sát đặc điểm của các serine protease từ trùn quế, bước đầu khảo sát hệ enzyme(2007)”.Vào năm 2010, nghiên cứu khả năng sinh enzyme protease của một số chủngnấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ được tiến hành bởi Võ Thị Bích Vân

Như vậy hầu hết các nghiên cứu về protease vẫn chưa tập trung vào vi khuẩnlactic,chưa có ứng dụng quan trọng ứng dụng trong ngành chế biến sữa, đó là hướngmới để phát triển đề tài này

biểu hiện trong E.coli Một số công trình công bố về tạo dòng và biểu hiện galactosidase từ Lactobacillus reuteri 103X và Bacillus megaterium (Li JM, 2005).

β-Lauro et al (2008) đã nhân bản, thể hiện, tinh khiết và đặc trưng một galactosidase (Aaβ-gal) từ vi khuẩn thermoacidophilic Alicyclobacillus acidocaldarius,các tái tổ hợp Aaβ-gal là hoạt động tối ưu và ổn định ở nhiệt độ 65ºC Nhóm củaNguyễn Thu Hà và cs, 2006 nghiên cứu sự biểu hiện của enzyme lactase ở 2 chủng

beta-Lactobacilus reuteri L103 và L461 Đây là nghiên cứu hoàn toàn cơ bản, cho thấy 2

enzyme biểu hiện ở 2 tiểu phần (2 chuỗi peptide có trọng lượng là 35kDa và 85kDa).Các enzyme này có khoảng pH hoạt động khá hẹp, một enzyme từ pH 3.8 – 4.0 (chủngL461) và một pH 4.6 – 4.8 (chủng L103) Kết quả nghiên cứu này sau đó được trìnhbày tại Hội nghị lần thứ V, Trường Đại học Khoa học Hà Nội, 2006, và đã đăng trongtạp chí quốc tế Nhóm tác giả này về sau có một số nghiên cứu tinh sạch enzyme để sửdụng tổng hợp galactoligosaccharides mang hoạt tính sinh học

Ở Việt Nam, Nguyễn Văn Cách (2008) đã tạo dòng β-galactosidase từ

Aspergillus oryzae và xác định một số tính chất lý-hóa của nó Trần Văn Giang,

Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2008) đã tạo dòng và phân tích trình tự gen

mã hóa β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis G1 Ngoài ra còn có công trình

nghiên cứu của Trương Nam Hải và cs với đề tài cấp quốc gia “Nghiên cứu, phân lập

và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzyme galactosidase có hiệu suất cao và ứng dụng trong thực phẩm” đã thành công trong biểu

beta-hiện của và xác đinh hoạt tính β-galactosidase nhưng việc biểu beta-hiện trong E.coli lại

không an toàn trong thực phẩm, protein thu được đa phần nằm trong dạng thể vùi dẫnđến gặp khó khăn trong việc thu hồi enzyme có hoạt tính cao ứng dụng trong quy môcông nghiệp Vì vậy, ở Việt Nam những nghiên cứu về β-galactosidase mới dừng lại ởnghiên cứu cơ bản và chưa đưa vào sản xuất enzyme này Kế thừa những thành quả đạtđược chúng tôi đưa ra mục tiêu sẽ tuyển chọn được các chủng Lactic, một trong những đối

tượng được chú trọng nghiên cứu từ lâu do những ưu điểm nổi bật so với Escherichia coli.

Enzyme thu nhận được sẽ được xác định hoạt tính, kiểm tra khả năng chịu lạnh và khảnăng chịu pH Đây là hướng mới của đề tài so với các nghiên cứu trên

2.4 Vi khuẩn lactic.

2.4.1 Đặc điểm chung

Vi khuẩn lactic có tên gọi chung là những vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợpacid lactic như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa carbon hydrat Vi khuẩnlactic thuộc họ Lactobateriacceae

Về hình thái chủ yếu ở hai dạng: trực khuẩn hoặc cầu khuẩn

Về mặt sinh lý chúng tương đối đồng nhất: là vi khuẩn Gram (+) đa số khôngsinh bào tử và không di động Vi khuẩn lactic có thể sinh cả khi có hoặc không có mặtcủa oxi trong môi trường Chúng là vi khuẩn từ kị khí đến vi hiếu khí (Huỳnh NgọcThạch, 2002)

Chúng không sinh bào tử, catalase âm tính và là vi khuẩn vi hiếu khí(aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hôhấp do không có cytochromes chỉ trừ giống Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc Chúngthường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic, acid lacticđược tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trìnhlên men carbohydrate (Klaenhammer, 1987)

2.4.2 Phân loại

- Phân loại theo Orla- Jesen: Orla- Jesen phân loại theo đặc điểm hình thái học(cầu khuẩn hoặc trực khuẩn) kiểu lên men, khả năng phát triển ở cá nhiệt khác nhau,

mực độ sử dụng đường ông xếp thành năm giống: Lactobacillus, Leuconostoc,

Pediococcus, Steptococcus, Bifidobacterium.

- Phân loại dựa theo quá trình lên men: nhóm vi khuẩn lactic đồng hình vànhóm vi khuẩn lactic dị hình

2.4.3 Nhu cầu dinh dưỡng

*Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Nguồn Cacbon chủ yếu vi khuẩn lactic sử dụng là các hydrat cacbon như: hexose(glucose, fructose, mannose, galatose); đường đôi (sucrose, lactose, maltose), cácpolysaccharide (tinh bột, dextrin) Trong đó monosaccharide, disaccharide được vikhuẩn lactic sử dụng nhiều nhất vì chúng là đường đơn giản giúp chúng dễ đồng hóa.Các nguồn cacbon này cung cấp năng lượng cho cơ thể, xây dựng cấu trúc tế bào vàsinh ra các acid hữu cơ (Nguyễn Lân Dũng, 1983)

* Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Nguồn nitơ chủ yếu: nitơ dưới dạng aminoacid, peptone, dịch protein thủy phân

từ thịt…

Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ phức tạp chứanitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải dùng các nguồn nitơ

có sẵn trong môi trường (Nguyễn Lân Dũng, 2000; Lương Đức Phẩm, 2006)

*Nhu cầu vitamin

Vi sinh vật cần vitamin cho sự phát triển của chúng Tuy với lượng rất nhỏ nhưngchúng lại đóng vai trò quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nócòn đóng còn đóng vai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào(Nguyễn Lân Dũng, 2000)

*Nhu cầu dinh dưỡng muối khoáng

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ của vi khuẩn, vi khuẩnlactic cần rất nhiều hợp chất vô cơ: đồng, sắt, kali, photspha, mangan, magie…Tuy vớilượng rất nhỏ nhưng các chất này đóng vai trò là muối khoáng và chúng không thểthiếu cho sự phát triển của vi sinh vật ( Nguyễn Lân Dũng, 2000)

*Nhu cầu các chất hữu cơ khác

Ngoài các chất cơ bản trên vi khuẩn lactic còn có nhu cầu lớn về các hợp chấthữu cơ giúp cho sự phát triển của chúng

Acetic acid và citric là hai acid hữu cơ ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của vikhuẩn lactic Vì vậy, hiện nay người ta sử dụng rộng rãi citrate làm thành phần môitrường để nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic (Nguyễn ThànhĐạt, 1990)

2.4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường tới quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic

*Ảnh hưởng của nồng độ oxy

Nói chung vi khuẩn lactic chịu được môi trường giàu oxy, nhưng một vài loài làyếm khí nghiêm ngặt Khi có mặt oxy, các loài này không có khả năng phosphorylhóa, tổng hợp cytochrom, tổng hợp enzyme

Các loài vi khuẩn có phản ứng khác nhau với độ hiếu khí của môi trường, thậmchí còn đối nghịch nhau Trong điều kiện yếm khí nghiêm ngặt chỉ có trực khuẩn lênmen dị hình phát triển Các cầu khuẩn lên men dị hình, lên men arabinose đạt tới tối

ưu sinh trưởng trong điều kiện sinh trưởng yếm khí, các loài không sử dụng đượcpentose thì phát triển kém trong điều kiện này

*Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn lactic, ảnhhưởng trực tiếp tới các phản ứng enzyme của tế bào vi sinh vật

Mỗi loai vi khuẩn có mức độ giới hạn nhiệt để phát triển, như loai ấm sẽ pháttriển ở 25 – 35oC (ví dụ như Lactobacillus casei (Lb Casei)); loại ưa nhiệt sẽ phát

triển ở nhiệt độ khoảng 35 – 45oC (ví dụ như Streptococcus thermophilus, Lb.

Acidophilus, ).

* Ảnh hưởng của pH

Hoạt động của vi khuẩn lactic chịu tác động mạnh của pH Nếu pH không thíchhợp, vi khuẩn lactic có thể bị ức chế, kém phát triển hay bị tiêu diệt Chính vì vậy,trong quá trình lên men lactic, khi lactic acid tích lũy đủ lớn thì ức chế cả luôn hoạtđộng của vi khuẩn lactic (pH<3.8)

Quá trình lên men sẽ dừng lại khi pH đạt giá trị 4.0 Các loài vi khuẩn khác nhauyêu cầu pH thích hợp khác nhau, dao động trong khoảng 4.5 – 6.4 Sự liên quan của

pH tới hiệu suất lên men của vi khuẩn lactic còn là vấn đề mà các nhà khoa học đangnghiên cứu

*Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu

Màng của vi khuẩn Gram (+) là màng bán thấm nên nồng độ muối có ảnh hưởngrất lớn đến khả năng phát triển của tế bào Nếu trong môi trường có nồng độ muối quácao, tế bào sẽ bị mất nước, chịu trạng thái khô sinh lý, bị co nguyên sinh chất và sẽ bịchết nếu kéo dài Ngược lại, nếu nồng độ muối trong môi trường thấp, lượng nước sẽxâm nhập vào trong tế bào áp lực tăng lên Vi khuẩn lactic sẽ bị ức chế nếu nồng độmuối ≥5% Tuy nhiên, có thể làm tăng khả năng chịu áp suất thẩm thấu của vi khuẩnlactic nếu bổ sung ion K+ hoặc amino acid

2.4.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn lactic trong việc thu nhận enzyme

Năm 2013, Nghiên cứu bổ sung vi khuẩn lactic và nấm men sinh rượu trongquy trình sản xuất nước tương tạo sản phẩm có hương vị cảm quan tốt của Nguyễn ThịViệt Anh và cs

Năm 2014, Dương Nhật Linh và cs đã sàng lọc được vi khuẩn lactic có hoạttính giảm cholestrol Nghiên cứu đã trình bày được kết quả sàng lọc hoạt tính khử liênhợp muối mật, khả năng sinh enzyme thủy phân muối mật (bile salt hydrolaza-BSH)

và khả năng hấp thu cholesterol qua liên kết với bề mặt tế bào của các chủng vi khuẩn lacticphân lập từ sữa mẹ, phân su em bé, rau quả muối chua và sữa chua lên men tự nhiên

Năm 2015, Bằng Hồng Lam và cs đã đăng trên tạp chí khoa học trường Đại học

An Giang đề tài nghiên cứu: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic chịu nhiệt sinhBacteriocin từ thực phẩm lên men truyền thống