TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN Sinh viên thực ĐẶNG THỊ THU THẢO MSSV: 0753040084 LỚP: ĐH NTTS K2 Cần Thơ, 2011 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN Cán hướng dẫn Sinh viên thực PGs.Ts NGUYỄN VĂN BÁ ThS NGUYỄN THÀNH TÂM ĐẶNG THỊ THU THẢO 2011 XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Luận văn kèm theo với tựa đề: “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả kháng khuẩn từ sản phẩm thủy sản lên men” Do sinh viên Đặng Thị Thu Thảo thực báo cáo Hội đồng chấm luận văn thông qua Ủy viên Phản biện Cần Thơ, ngày 13 tháng 07 năm 2011 Chủ tịch hội đồng LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Tây Đô tạo điều kiện tốt cho học tập sinh hoạt Cảm ơn quý Thầy Cô Khoa Sinh Học Ứng Dụng nhiệt tình giảng dạy truyền đạt cho kiến thức quý báu sở ngành chuyên ngành từ ngày đầu bước chân vào trường đến Đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả kháng khuẩn từ sản phẩm thủy sản lên men” kết thúc thành công Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ Thầy Nguyễn Văn Bá hỗ trợ môi trường nuôi cấy dụng cụ đặc trưng cho thí nghiệm, Thầy Nguyễn Thành Tâm theo sát hướng dẫn đề tài cung cấp số tài liệu liên quan Cảm ơn Cô Trần Ngọc Huyền – cán phòng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi để đề tài kết thúc thời hạn xin cảm ơn anh Lê Văn Toàn (lớp ĐH NTTS K2) hai em Nguyễn Thị Thùy Trang Dương Thị Bé Ba (lớp ĐH NTTS K3) đồng hành giúp đỡ suốt trình thực Cảm ơn Thầy cố vấn học tập Tạ Văn Phương , Thầy Nguyễn Lê Hoài Phương (Khoa bản) thành viên lớp ĐH NTTS K2 sát cánh suốt trình học tập trường Chân thành cảm ơn! Đặng Thị Thu Thảo TÓM TẮT Vi khuẩn lactic có ý nghĩa quan trọng trình lên men thực phẩm Chúng sinh nhiều chất để bảo vệ thực phẩm như: axít lactic, H2O2 chất kháng khuẩn Do đó, việc tìm chất kháng khuẩn sinh từ vi khuẩn lactic nhằm bổ sung cho nghiên cứu chất kháng khuẩn ứng dụng chất kháng khuẩn vào nuôi trồng thủy sản Nghiên cứu sử dụng môi trường MRS để phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic, sử dụng phương pháp trực tiếp để kiểm tra kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus Kết cho thấy có tổng số 83 dòng vi khuẩn lactic phân lập từ 37 mẫu mắm nước mắm (thu ngẫu nhiên chợ thuộc vùng nước nước lợ mặn) có 19 dòng cho vòng kháng khuẩn dòng thị Độ dày vòng kháng khuẩn từ 0,1 – 0,85 cm, có dòng vi khuẩn lactic cho bề dày vòng kháng khuẩn lớn (hơn 0,6 cm), dòng cho bề dày vòng kháng khuẩn 0,1 cm nhỏ Như vậy, sử dụng vi khuẩn lactic từ sản phẩm lên men thủy sản để kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Chất kháng khuẩn, Phương pháp trực tiếp, Pediococcus pentosakeus MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC .iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Một số quy trình lên men thủy sản 2.2 Vi khuẩn lactic 2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn lên men axit lactic 2.2.2 Cơ chế trinh lên men axit lactic 2.3 Mối quan hệ giữ axit lactic với cá sản phẩm từ cá 2.4 Chất kháng khuẩn 2.5 Dòng thị Pediococcus pentosakeus 12 2.6 Những nghiên cứu nước 13 2.6.1 Những nghiên cứu nước 13 2.6.2 Những nghiên cứu nước 14 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Địa điểm thời gian thực 15 3.1.1 Địa điểm 15 3.1.2 Thời gian thực 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Phương pháp thu bảo quản mẫu 17 3.3.2 Phương pháp phân lập VKL từ mẫu mắm 18 3.4 Phân tích xử lý số liệu 20 3.4.1 Phân tích VKL 20 3.4.2 Phân tích khả kháng khuẩn 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 21 4.1 Phân lập số dòng VKL từ sản phẩm thủy sản lên men 21 4.1.1 Thu mẫu 21 4.1.2 Tăng sinh mẫu lần 21 4.1.3 Cấy ria đĩa pêtri 23 4.1.4 Thử catalase nhuộm Gram 25 4.1.5 Tăng sinh mẫu lần 26 4.1.6 Lưu trữ mẫu 26 4.2 Kiểm tra khả sinh CKK từ dòng VKL thu 26 4.2.1 Tối ưu hóa quy trình 26 4.2.2 Thử khả sinh CKK từ dòng VKL thu 27 CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ ĐỀ XUẤT 31 5.1 Kết 31 5.2 Đề xuất 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC A A PHỤ LỤC B .B PHỤ LỤC C C PHỤ LỤC D D1 PHỤ LỤC E .E PHỤ LỤC F F1 PHỤ LỤC G G DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Các đặc tính CKK VKL 10 Bảng 3.1: Tên địa điểm thu mẫu 17 Bảng 4.1: Địa điểm số lượng mẫu thu 21 Bảng 4.2: Kết tăng sinh lần 22 Bảng 4.3: Kết cấy ria VKL đĩa thạch 23 Bảng 4.4: Kết thử khả sinh chất kháng khuẩn 28 Bảng 4.5: Kết thử với Pediococcus pentosakeus 30 Bảng A1: Thành phần môi trường MRS_broth A Bảng A2: Thành phần môi trường MRS_agar A Bảng D1: Bảng mã mẫu D1 Bảng D2: Kết thử khả sinh CKK VKL phân lập D3 Bảng F1: Quan sát khuẩn lạc F1 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Quy trình sản xuất mắm cá Hình 2.2: Quy trình sản xuất mắm tép Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tôm Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm Hình 2.6: Pediococcus 12 Hình 3.1: Quy trình phân lập mẫu mắm 19 Hình 3.2: Tối ưu hóa quy trình 19 Hình 3.3: Phương pháp trực tiếp 20 Hình 4.1: Cách xác định phát triển VKL 21 Hình 4.2: Khuẩn lạc có khả phân giải CaCO3 25 Hình 4.3: Vi khuẩn Gram dương (vật kính 100X) mẫu thử catalase âm tính 25 Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn mẫu 27 Hình 4.5: Vòng kháng khuẩn sinh từ VKL 30 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VKL: Vi khuẩn lactic CKK: Chất kháng khuẩn CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Ở nước ta, nuôi trồng thủy sản ngày chiếm vị trí quan trọng kinh tế Trong năm gần đây, nhằm nâng cao suất thủy sản phục vụ nhu cầu xuất nên mức độ nuôi thâm canh hóa ngày cao Bệnh tôm, cá loài thủy đặc sản khác xuất ngày nhiều Bệnh gây nhiều tổn thất cho nghề nuôi thủy sản Sản phẩm làm không tiêu thụ chất lượng sản phẩm giảm, không đảm bảo cho tiêu dùng xuất Do đó, công tác phòng trị bệnh nuôi trồng thủy sản đòi hỏi cấp bách (Bùi Quang Tề, 2008) Tuy nhiên, nhiều sản phẩm thuốc thủy sản dần tác dụng với loại mầm bệnh quen thuộc việc sử dụng thuốc mức không đảm bảo liều lượng theo yêu cầu dẫn đến tình trạng kháng thuốc loại mầm bệnh ngày gia tăng Việc sử dụng dòng vi khuẩn có lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh trọng, đặc biệt nhóm vi khuẩn lactic (VKL) VKL tên gọi nhóm vi khuẩn sinh axit lactic sản phẩm trình chuyển hoá chất bột đường chúng xếp vào họ Lactobacteriaceae (Lê Văn Nhương csv., 2009) VKL có ứng dụng rộng rãi thực tiễn với axit lactic nguyên liệu cần thiết nhiều ngành công nghiệp Đặc biệt, công nghiệp chế biến bảo quản thực phẩm sữa chua, loại dưa từ rau củ, loại sản phẩm thủy sản lên men (Lương Đức Phẩm, 2004) Trong trình lên men, VKL sinh axit hữu cơ, chúng tạo môi trường không thích hợp cho phát triển vi sinh vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức bảo vệ chức dinh dưỡng màng tế bào, ức chế trình vận chuyển chủ động màng tế bào Axit lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào tự oxi hoá, làm dừng trình trao đổi chất, gây chết tế bào nhạy cảm với (Lê Văn Nhương csv., 2009) Nhằm làm tiền đề cho việc nghiên cứu dòng VKL có khả sinh chất kháng khuẩn tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản nay, đề tài “Phân lập tuyển chọn số dòng vi khuẩn lactic từ sản phẩm thủy sản lên men có khả kháng khuẩn ” thực 10