Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic co có tính kháng khuẩn từ nem chua và rau muống chua

TÓM LƯỢC Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn từ nem chua và rau muối chua là tìm ra trên hai nguyên liệu này những chủng vi khuẩn thuần khiết sinh axit lactic có t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGUYỄN HỮU CHÍ MSSV: 2071797

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CO TÍNH KHÁNG

KHUẨN TỪ NEM CHUA VÀ RAU MUỐI CHUA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã ngành: 08

Người hướng dẫn Tiến sĩ LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY

Cần Thơ, năm 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ thực phẩm của tôi đã được hội

đồng chấm luận văn thông qua

CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY đã tận tình hướng dẫn, cung cấp cho tôi những tài liệu cần thiết và hữu ích giúp quá trình nghiên cứu được tiến hành thuận lợi và nhanh chóng Thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi giúp tôi hoàn thành tốt đề tài này trong thời gian quy định

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy, Cô trong bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm trường ĐẠI HỌC CẦN THƠ đã cung cấp cho tôi nhiều kiến thức quý báo trong suốt những năm học vừa qua Những kiến thức mà Thầy, Cô truyền dạy đã giúp tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp đã luôn luôn động viên, tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Do kiến thức còn hạn chế nên sẽ còn nhiều khuyết điểm, thiếu sót trong quyển luận văn này, rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến chân thành của quý Thầy, Cô và các bạn Tôi xin chân thành cảm ơn

Cần Thơ, ngày 12 tháng 5 năm 2011

TÓM LƯỢC

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn từ nem chua và rau muối chua là tìm ra trên hai nguyên liệu này những chủng vi khuẩn thuần khiết sinh axit lactic có thể sinh tổng hợp những hợp chất có khả năng kìm hãm sự hoạt động hay tiêu diệt một số vi khuẩn khác Để thực hiện điều này, chúng tôi tiến hành phân lập từ nem chua và rau muối chua trên thị trường Môi trường dinh dưỡng dùng để phân lập

là MRS chứa 1,5% Agar, 0,5% CaCO3, pH môi trường là 6,3 Môi trường phân lập

được tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút

Từ 180 khuẩn lạc vi khuẩn lactic thu được trên nem chua khi tiến hành phân lập, sau quá trình cấy chuyền chúng tôi thu được 120 chủng vi khuẩn lactic thuần nhất (gọi tắt

là LAB) Tăng sinh 120 chủng LAB này (thời gian 16÷18 giờ, ở 370C) trong môi trường MRS có pH 6,3, sau đó ly tâm Phần dịch trong thu được sau ly tâm có pH trung bình 3,4 được chỉnh đến pH 7 rồi đun sôi ở 1000C trong 6 phút Phần dịch sau

đun sôi được thử nghiệm đặc tính kháng khuẩn theo hai cách thử nghiệm: cấy mẫu lên

môi trường chứa vi khuẩn chuẩn ngay sau khi đun (thử nghiệm 1) và cấy mẫu khi đã

để mẫu ổn định 16÷18 giờ sau khi đun (thử nghiệm 2) rồi ủ qua đêm ở từng nhiệt độ

tối thích của từng chủng vi khuẩn chuẩn Vi khuẩn chuẩn được dùng là Lactobacillus

sakei TISTR 890 và Bacillus Coagulans JCM 2257, chúng được dùng như là những vi

khuẩn chỉ thị đối với đặc tính kháng khuẩn của chủng LAB cần tìm

Kết quả: không có chủng nào có đặc tính kháng khuẩn trên 120 chủng LAB được tuyển chọn từ nem

Thực hiện việc phân lập, cấy chuyền, tăng sinh rồi thử dặc tính kháng khuẩn các chủng LAB thu được từ rau muối chua với cách tiến hành hoàn toàn tương tự như trên nem Kết quả thu được như sau:

Từ 175 khuẩn lạc vi khuẩn lactic phân lập được trên rau muối chua Trong tổng số 122 chủng LAB được tuyển chọn qua quá trình cấy chuyền, có 7 chủng thể hiện đặc tính kháng khuẩn trên cả bốn loại vi khuẩn chỉ thị ở cách thử nghiệm thứ hai Các chủng

đó là: R1, R3, R5, R8,R 9, R15, R17

MỤC LỤC

CẢM TẠ iii

TÓM LƯỢC iv

MỤC LỤC v

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu nguyên liệu 2

2.1.1 Nem chua 2

2.1.2 Rau muối chua 4

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn lactic 6

2.3 Phân loại vi khuẩn lactic 6

2.4 Sinh lý của vi khuẩn lactic 6

2.5 Cơ chế lên men của vi khuẩn lactic 7

2.5.1 Vi khuẩn lactic đồng hình 7

2.5.2 Vi khuẩn lactic dị hình 10

2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic 11

2.7 Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic 12

2.7.1 Ứng dụng sự lên men lactic trong công nghệ thực phẩm 12

2.7.1.1 Sản xuất acid lactic 12

2.7.1.2 Muối chua rau quả - ủ chua thức ăn gia súc 12

2.7.1.3 Ứng dụng lên men lactic trong ngành sữa 13

2.7.1.4 Ứng dụng lên men lactic trong ngành thịt, cá 13

2.7.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic trong y học 13

2.7.3 Ứng dụng của vi khuẩn lactic trong công nghệ lên men chất kháng sinh 13

2.8 Khái quát về chất kháng sinh sinh học 13

2.9 Khái quát về Bacteriocin 14

2.9.1 Phân loại bacteriocin 15

2.9.2 Cơ chế hoạt động của Bacteriocin 15

2.9.3 Kiểu hoạt động của bacteriocin từ vi khuẩn lactic 16

2.9.4 Ứng dụng của bacteriocin từ vi khuẩn lactic 16

2.10 Một số vấn đề liên quan đến việc phân lập và tuyển chọn vi sinh vật 17

2.10.1 Vấn đề khử trùng môi trường dinh dưỡng 17

2.10.2 Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh 18

2.10.3 Nguyên tắc phân lập các giống thuần khiết 18

2.11 Môi trường dinh dưỡng 19

2.11.1 Nguyên tắc thành lập môi trường 19

2.11.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn lactic 19

2.12 Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 20

2.12.1 Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng 20

2.12.2 Phương pháp giữ giống trên môi trường đất, cát 20

2.12.3 Phương pháp lạnh đông và đông khô 20

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 22

3.1 Phương tiện thí nghiệm 22

3.2 Phương pháp thí nghiệm 23

3.2.1 Phương pháp chung 23

3.2.2 Tiến hành thí nghiệm 23

3.2.2.1 Thí nghiệm 1 : Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua 23

3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Thử đặc tính kháng khuẩn của các chủng LAB thu được từ nem chua 26

3.2.2.3 Thí nghiệm 3: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic thuần nhất trên rau muối chua 31

3.2.2.4 Thí nghiệm 4: Thử nghiệm đặc tính kháng khuẩn trên những chủng LAB thu được từ rau muối chua 33

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 35

4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic thuần nhất từ nem chua 35

4.2 Thí nghiệm 2: Thử nghiệm đặc tính kháng khuẩn của các chủng LAB 35

4.3 Thí nghiệm 3: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic thuần nhất từ rau muối chua 43

4.4 Thí nghiệm 4: Thử nghiệm đặc tính kháng khuẩn của các chủng LAB 43

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, việc nghiên cứu để tìm ra những phương thức bảo quản thực phẩm sao cho

đạt hiệu quả cao mà vẫn an toàn tuyệt đối cho người tiêu dùng đang là vấn đề cấp

thiết Nó không chỉ là nhiệm vụ của ngành khoa học thực phẩm mà còn liên quan đến nhiều ngành khoa học khác Vai trò của các chất phụ gia, chất hoá học dùng trong bảo quản thực phẩm từ trước đến nay là không thể phủ nhận Thế nhưng việc sử dụng chúng đã và đang gây ra một số ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ của người tiêu dùng nếu liều lượng sử dụng vượt quy định hay việc tích trữ dần trong cơ thể theo thời gian Nên vấn đề cần được suy nghĩ lại

Thêm vào đó, ngành công nghiệp chế biến đồ hộp với chế độ thanh trùng nghiêm ngặt

để tiêu diệt bào tử của một số loại vi khuẩn gây ngộ độc đã gián tiếp làm giảm đi phần

nào chất lượng của sản phẩm nhưng nguy cơ còn sót lại các bào tử này sau thanh trùng

là vẫn có, dù rất ít Một chế độ thanh trùng ôn hoà hơn mà vẫn mang lại hiệu quả cao

đồng thời kìm hãm và ngăn ngừa quá trình thối rữa trong trường hợp bào tử còn sót

nếu chúng ta sử dụng những hợp chất đặc biệt được tổng hợp từ những vi sinh vật có lợi

Khoa học về vi sinh vật cho phép chúng ta tìm được những chủng vi khuẩn sản sinh những chất kháng khuẩn đặc biệt có thể đảm nhận những vai trò như vừa nêu mà không hề gây hại đến sức khoẻ con người

Bacteriocin, tên chung của các peptit do vi khuẩn lactic tổng hợp nên có được những tính chất quý báu này Với những ích lợi đó, chúng tôi tiến hành việc nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn từ nem chua và rau muối chua nhằm phục vụ cho ngành khoa học thực phẩm

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm được những chủng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn trên nem chua và rau muối chua

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu nguyên liệu

2.1.1 Nem chua

Nem chua là sản phẩm lên men lactic từ thịt heo tươi có trộn thêm đường và gia vị cần thiết

Bản chất của quá trình là sự tạo thành acid lactic trong thịt nhờ chủ yếu vào vi khuẩn

lactobacillus và micrococus Sản phẩm càng chua nếu lượng axit lactic tích tụ nhiều

khi quá trình lên men kéo dài Vì thế chất lượng sản phẩm sẽ khác nhau tuỳ theo kỷ thuật và thời gian lên men khác nhau

Mô tả công nghệ

Thịt heo dùng để sản xuất phải là heo tươi vừa mới giết mỗ, thịt có màu hồng, không dùng thịt cũ, qua đêm, màu sẫm, có mùi lạ Quá trình làm nhuyễn thịt có thể dùng máy xay hoặc giã nhuyễn

Quy trình công nghệ sản xuất nem chua theo phương pháp truyền thống:

Sản phẩm

Bổ sung gia vị

Bì heo sau khi luộc chín, cần loại mỡ thật kỹ và thái nhỏ thành sợi và hong khô trước khi trộn với thịt heo xay nhuyễn đã ướp gia vị Trong quá trình trộn có thể bổ sung thêm gia vị

Toàn bộ nguyên liệu được tạo hình, vuông hay tròn dài như khúc giò rồi được gói chặt bằng lá vông (có tác dụng giữ nhiệt thích hợp cho lên men) Sau đó gói bằng 2 ÷ 3 lớp

lá chuối, buộc chặt để tạo điều kiện yếm khí hoàn toàn Vi khuẩn lactic hoạt động mạnh dần, axit lactic tích tụ ngày càng nhiều làm cho thịt có mùi thơm và vị chua Khi thấy mặt nem khô, mịn và có mùi thơm đặc trưng là có thể dùng được Thời gian lên men từ 8 ÷ 10 ngày Tuỳ theo khẩu vị ăn chua mà có thể cho lên men thêm 1 ÷ 2 ngày nữa

2.1.2 Rau muối chua

Rau muối chua là sản phẩm chế biến từ rau, bằng cách cho đường có sẵn trong nguyên liệu lên men lactic Axit lactic và các sản phẩm của quá trình lên men tạo thành , làm cho sản phẩm có hương vị đặc biệt, có tính sát trùng, ức chế hoạt động của các vi sinh vật lạ và giữ cho sản phẩm khỏi bị hư hỏng

Quy trình sản xuất rau muối chua:

Cải bẹ

Làm sạch sơ bộ

Chần

Bổ sung đường, muối, nước

Lên men yếm khí

Sản phẩm

Bảo quản nhiệt độ thấp

- Cải: Cải dùng làm dưa có độ già thích hợp để cấu trúc dưa giòn, thơm ngon

- Làm sạch sơ bộ: rữa sạch tro, bùn, các loại côn trùng bám trên nguyên liệu, không rữa quá lâu sẽ làm mất vi khuẩn lactic bàm trên bề mặt nguyên liệu

- Chần: Chần trong nước có nhiệt độ khỏang 850C trong 1 ÷ 2 phút Chần để ổn định cấu trúc của sản phẩm đồng thời tiêu diệt một số vi sinh vật có trên nguyên liệu nhưng thời gian và nhiệt độ được kiểm soát để đảm bảo vi khuẩn lactic không bị tiêu diệt

- Bổ sung muối, đường, nước: Muối để tạo áp suất thẩm thấu, làm cho các chất khô

được thoát nhanh ra ngoài, làm cho các mô của nguyên liệu được nén chặt lại và trở

nên giòn Muối còn có tác dụng làm tăng hương vị cho sản phẩm, hạn chế sự hoạt

động của vi sinh vật gây thối, tăng cường hoạt động của vi khuẩn lactic Nồng độ

muối sử dụng khoảng 3 ÷ 5% Đường cung cấp thêm dinh dưỡng cho sự hoạt động của vi khuẩn lactic, giúp sản phẩm có vị dịu ngọt Nước giúp tạo môi trường yếm khí cho vi khuẩn lactic hoạt động, hoà tan các thành phần đường, muối và các chất khô thoát ra từ nguyên liệu cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic

- Lên men: Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men là 26 ÷ 350C, thời gian lên men

từ 6 ÷ 7 ngày Khi lượng axit đạt đến mức thích hợp cần trữ sản phẩm ở nhiệt độ thấp

để tránh pH hạ quá thấp ảnh hưởng đến vi khuẩn lactic và tạo điều kiện cho các vi

sinh vật gây hại phát triển

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic thuộc họ lactobacilliaceae, chúng có nhiều trong thiên nhiên, tồn tại

nhiều ở cỏ nhất là cỏ khô Chúng tồn tại ở người và đông vật, thường ở trong đường ruột, trong miệng

Tế bào vi khuẩn lactic có dạng hình que hay hình cầu Dạng hình que có thể ngắn gần như hình cầu, chúng đứng riêng lẽ, kết đôi hoặc kết thành chuỗi, chiều dài khoảng 0,5

÷ 0,7 µm Dạng hình cầu còn có dạng ovan, đứng riêng lẽ hoặc kết đôi hay chuỗi,

đường kính từ 0,5 ÷ 0,6 µm, có khi đến 1 µm

Kích thước của chúng phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy Trong môi trường có hàm lượng rượu cao tế bào vi khuẩn thường dài ra, rượu etylic còn có tác dụng kìm hãm sự phân chia tế bào của vi khuẩn lactic

Các tế bào vi khuẩn lactic không chuyển động, không tạo thành bào tử (tuy nhiên hiện nay người ta tìm thấy một số giống có khả năng tạo bào tử), không tạo thành sắc tố, vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn gam dương

Vi khuẩn lactic là thể kỵ khí, vi hiếu khí Chúng sinh trưởng và hoạt động mạnh trong

điều kiện kỵ khí nhưng vẫn sống được trong điều kiện hiếu khí

Phân cắt tế bào là hình thức sinh sản của vi khuẩn lactic Với điều kiện thuận lợi thời gian thế hệ của chúng là 15 phút, nếu điều kiện không thuận lợi có thể kéo dài đến 24 giờ

2.3 Phân loại vi khuẩn lactic

Theo khoá phân loại của Bengay, họ Lactobacteriaceae chia làm hai họ:

Họ: Streptococcae

Họ: Lactobacilaceae

Họ streptococcae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc Họ Lactobacilaceae chỉ có

một loài là lactobacillus

Có một số loài trong họ vi khuẩn lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh

2.4 Sinh lý của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic hoạt động sống ở điều kiện kỵ khí nên đặc điểm cơ bản của vi khuẩn này là không có enzyme catalaza Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme này đã được tìm thấy ở một số chủng vi khuẩn lactic ở dạng Pseudocatalaza trong những năm gần đây Pseudocatalaza có ở một số loài thuộc các giống leuconostoc và lactobicillus

Hoạt tính proteaza tìm thấy ở cầu khuẩn, trực khuẩn và liên trực khuẩn, nhóm trực khuẩn thường có hoạt lực này cao hơn, nhất là các chủng được phân lập từ ruột non

Hoạt tính lipaza của vi khuẩn lactic có ở cả cầu khuẩn và trực khuẩn Chế phẩm lipaza thu được từ dịch chiết không có tế bào vi khuẩn dễ dàng phân huỷ những triglycerit

đơn giản

Hoạt tính hoá sinh của vi khuẩn lactic phụ thuộc vào đặc điểm lên men các loại

đường Vi khuẩn lactic lên men được mono và disacarit Nhưng không phải tất cả vi

khuẩn lactic nào cũng đều sử dụng được bất kỳ loại disacarit nào Một số không lên men được sacaroza, số khác lại không sử dụng maltoza Các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột và các polysacarit khác (chỉ có loài Lactobacillus delbrueckii là

đồng hoá được tinh bột)

Khi nghiên cứu khả năng lên men lactic từ các nguyên liệu chứa đường, dựa vào các sản phẩm lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm hoàn toàn khác nhau:

- Vi khuẩn lactic đồng hình

- Vi khuẩn lactic dị hình

Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo axit lactic trong môi trường,

và do đó sức chịu axit (độ bền với axit) của chúng cũng khác nhau Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình hình thành axit cao hơn (khoảng 2%÷3%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn có thể phát triển ở pH = 4÷3,8 Cầu khuẩn không phát triển được ở môi trường này Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn là ở vùng pH = 5,5÷6

Vi khuẩn lactic chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10÷15% cồn, một số trực khuẩn bền với NaCl (tới 7÷10%)

Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25÷350C, loại ưa nhiệt

có nhiệt độ tối thích là 40÷450C, ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (khoảng

50C hay thấp hơn) Hầu hết chúng đều chết khi gia nhiệt tới 60÷800C sau 10÷30 phút

2.5 Cơ chế lên men của vi khuẩn lactic

2.5.1 Vi khuẩn lactic đồng hình

Nhóm vi khuẩn này có chứa enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase Sản phẩm chính của quá trình lên men các loại đường là axit lactic Axit lactic được tạo thành theo sơ đồ Embden-Meyerhosf, hydro bị tách ra và chuyển tới pyruvat

Lượng axit lactic tạo thành chiếm hơn 90% Chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị khử cacbon

để chuyển thành axit acetic, etanol, CO2 và axetion, lượng sản phẩm phụ được tạo ra này phụ thuộc vào sự có mặt của oxy

Một số giống vi khuẩn lactic đồng hình phổ biến: Lactobacillus acidophilus,

Lactobacillu bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Streptococus cremoris, Streptococcus lactic, Streptococus thermophilus

• Phương trình tổng quát biểu hiện lên men lactic:

• Quá trình lên men lactic của tất cả các vi khuẩn lactic đồng hình được tiến hành theo

cơ chế chung như sau:

C6H12O6 2C3H6O3 + Q (đường glucoza) (axit lactic)

2.5.2 Vi khuẩn lactic dị hình

Trong lên men lactic dị hình, ngoài sản phẩm chính là axit lactic còn có các sản phẩm khác như axit acetic, sucxinic, etanol, CO2 và H2 Nhóm này không có hai enzym cơ bản là enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase nên lên men lactic dạng này khác với lên men đồng hình là ở chổ quá trình diễn ra theo con đường pentosephotphat

Trong lên men dị hình axit lactic có thể tạo thành từ 40% đường dùng cho lên men, axit sucxinic khoảng 20%, etanol 20%, axit acetic 10%, CO2 20%

Một số giống vi khuẩn lactic dị hình phổ biến: Lactobacillus brevis, Lactobacillus

lycopersici, Lactobacillus pasteurianus, Streptococcus cumoris, Streptococcus falcalis, Streptolacticus lactic

• Phương trình tổng quát biểu hiện lên men lactic dị hình:

• Cơ chế chung của quá trình lên men:

2C6H12 C3H6O3 + C4H6O4 + C2H4O2 + C2H5OH + CO2 + H2 + Q

(a.lactic) (a sucxinic) (a.acetic) (etanol)

2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic

- Dinh dưỡng cacbon: Vi khuẩn lactic sử dụng nguồn năng lượng chính từ các đường mono và disacarit như glucoza, lactoza, maltoza, sacaroza, các axit hữu cơ như axit citrit, malic, furamic, pyruvic…làm nguồn năng lượng và trao đổi cấu trúc, đối với vi khuẩn lactic thì nguồn cacbon chính là glucoza Khi không có nguồn cacbon, vi khuẩn lactic sử dụng nguồn năng lượng là các axit amin (axit glutamic, arginin, tirozin…) Khi axit amin được sử dụng, CO2 sẽ tách ra ngoài

Acetaldehyde Piruvat

Etanol Axit lactic

- Dinh dưỡng nitơ: Phần lớn vi khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp được các dạng nitơ hữu cơ phức tạp, do đó chúng cần hỗn hợp các axit amin, dịch thuỷ phân protein từ casein, bột đậu tương…làm nguồn pepton, peptit

- Vitamin: Vitamin là nguồn chất dinh dưỡng quan trọng của vi khuẩn lactic, đặc biệt

là trực khuẩn Hầu hết vi khuẩn lactic yêu cầu một số vitamin cho sự sinh trưởng và phát triển như vitamin B1, B2, B6, PP, axit folic, biotin…

Các chất vô cơ: Các hợp chất vô cơ như đồng, sắt, natri, photpho, iod, lưu huỳnh, mangan, đặc biệt là mangan rất cần cho việc phòng ngừa sự tự phân của tế bào

- Oxy: Quan hệ giữa các loài vi khuẩn lactic với oxy ở mức độ hiếu khí khác nhau là rất khác nhau Trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt chỉ làm cho trực khuẩn lên men dị hình chậm phát triển ở giai đoạn đầu, đối với trực khuẩn lên men đồng hình sinh trưởng bị giảm 10%, lên men giảm 23% Các loài lên men dị hình sinh trưởng tốt ở

điều kiện kỵ khí, những loài không sử dụng petoza thì phát triển rất kém ở điều kiện

này

- Nhiệt độ: Chỉ có loài Lactobacillus delbrueckii là loài chịu được nhiệt độ 500C mà vẫn phát triển và hoạt động mạnh mẽ, hầu hết các vi khuẩn lactic còn lại thích hợp với nhiệt độ thấp hơn

pH môi trường: Các chủng lactic chịu được pH thấp khác nhau, đối với vi khuẩn tách

từ rượu vang có thể chịu được pH 3,5 ÷ 3 hoặc thấp hơn, các chủng tách từ dưa muối chua, mắm chua chịu được pH 3,7 trở lên Các cầu khuẩn lên men dị hình chịu được axit cao, ít hơn là các trực khuẩn lên men dị hình, các trực khuẩn lên men đồng hình chiếm vị trí trung gian

2.7 Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic

2.7.1 Ứng dụng sự lên men lactic trong công nghệ thực phẩm

2.7.1.1 Sản xuất acid lactic

Trong công nghiệp thực phẩm, axit lactic được sử dụng để thay thế một phần axit acetic trong sản xuất bánh kẹo, nước giải khát, đồ hộp… Ngoài ra, trong công nghiệp

đã xây dựng các dây chuyền công nghệ lên men để sản xuất axit lactic Sản phẩm này được ứng dụng trong nha khoa, phẩu thuật chỉnh hình, sản xuất vật liệu sinh học, mỹ

phẩm, chế tạo chất dẻo trong tương lai

2.7.1.2 Muối chua rau quả - ủ chua thức ăn gia súc

Các quá trình muối chua rau quả và ủ chua thức ăn gia súc là quá trình lên men lactic

có trên rau, quả hoặc trên thức ăn tươi ban đầu của gia súc và được lên men tự nhiên

trong điều kiện yếm khí Đây là quá trình mang tính chất vừa chế biến vừa bảo quản nhờ hoạt động của vi khuẩn lactic

2.7.1.3 Ứng dụng lên men lactic trong ngành sữa

Sữa động vật là loại thực phẩm quý chứa nhiều chất dinh dưỡng Sự tồn tại và hoạt

động của vi khuẩn lactic trong sữa sẽ tích tụ axit lactic làm cho pH sữa càng thấp và sẽ

hạn chế, tiêu diệt các loại vi khuẩn gây thối rữa có trong sữa Lợi dụng tính chất này, người ta cho lên men lactic dung dịch sữa để bảo quản được lâu, đồng thời tạo ra một

số sản phẩm có giá trị khác như sữa chua, bơ, phomat, v.v…

2.7.1.4 Ứng dụng lên men lactic trong ngành thịt, cá

Ứng dụng sự lên men của vi khuẩn lactic để sản xuất sản phẩm truyền thống như nem

chua Những năm gần đây vi khuẩn lactic đã được đưa vào trong việc chế biến một số dạng sản phẩm như giò chả, xúc xích, trong quá trình làm chín cá muối để rút ngắn thời gian của quá trình công nghệ và cải thiện một số tính chất của sản phẩm (vị, hương thơm, độ rắn chắc…)

2.7.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic trong y học

Việc ứng dụng này đã được Việt Nam sử dụng từ lâu Khi người ta bị tiêu chảy, thầy thuốc khuyên hàng ngày uống 1 ÷ 2 chén (bát) nước dưa chua Phương pháp này tỏ ra rất hiệu nghiệm trong điều kiện ngành dược chưa phát triển

Dựa vào hiệu quả sử dụng vi khuẩn lactic trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản xuất và đưa ra thị trường từ hàng chục năm nay một sản phẩm mang tên Biolactyl Sản phẩm này trị tiêu chảy bằng nhiều vi khuẩn lactic

2.7.3 Ứng dụng của vi khuẩn lactic trong công nghệ lên men chất kháng sinh

Một số vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp những chất kháng khuẩn Các chế phẩm này đang được triển khai thử nghiệm ứng dụng rất có hiệu quả trong việc bảo quản sản phẩm thực phẩm ở nhiều quốc gia trên thế giới

2.8 Khái quát về chất kháng sinh sinh học

Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng để

mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên

động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại vi khuẩn hiếu khí lành

tính khác Năm 1885, Babes đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng vi sinh vật là đặc tính tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối kháng

Chất kháng sinh được hiểu là các chất hoá học xác định, không có bản chất enzym, có nguồn gốc sinh học (phổ biến nhất là từ vi sinh vật), với đặc tính là ngay cả ở nồng độ thất hay rất thấp đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo an toàn cho người sử dụng

Tuỳ thuộc vào bản chất của mỗi chất kháng sinh mà cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây hại (gọi tắt là mầm bệnh) của mỗi chất thường mang đặc điểm riêng Những kiểu tác động thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào, làm rối loạn hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein, rối loạn quá trình tái bản AND, hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển hoá trao đổi chất

Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường được biểu thị bằng một trong các đơn vị sau: mg/mL, µg/mL, hay đơn vị kháng sinh UI/mL hoặc UI/g International Unit – đơn vị của mỗi kháng sinh được định nghĩa là lượng kháng sinh tối thiểu pha trong một thể tích quy ước dung dịch có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của chủng vi sinh vật kiểm định đã chọn

Hiệu quả ứng dụng của mỗi chất kháng sinh được xác định qua việc xem xét hàng loạt các chỉ tiêu khác nhau, một số chỉ tiêu chính là: phổ kháng sinh, hoạt tính kháng sinh

đặc hiệu, đáp ứng phản hồi của mầm bệnh đối với kháng sinh đó, đường hướng đào

thải và tương tác qua lại giữa các loại khi sử dụng

Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu là đặc tính cho thấy năng lực kìm hãm hay tiêu diệt có chọn lọc các chủng vi sinh gây hại mà không gây ra các hiệu ứng phụ quá ngưỡng cho phép trên người sử dụng Phổ kháng khuẩn của chất kháng sinh biểu thị số lượng các chủng gây bệnh bị tiêu diệt bởi kháng sinh này Theo đó, chất kháng sinh phổ rộng là chất có thể tiêu diệt được nhiều loại mầm bệnh khác nhau, chất tiêu diệt ít mầm bệnh hơn là chất kháng sinh phổ hẹp Việc phân loại chất kháng sinh có thể dựa theo một trong các nguyên tắc sau: phân loại theo nguồn gốc sinh học của chủng sinh ra chất kháng sinh, phân loại theo phổ kháng sinh, phân loại theo cơ chế tác dụng hay phân loại theo cơ chế sinh tổng hợp ra chất kháng sinh đó

2.9 Khái quát về Bacteriocin

Bacteriocin được A Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong quá trình nghiên cứu cách thức tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúc đẩy sự phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh, chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn

Bacteriocin là tên chung của các peptit do vi khuẩn sinh tổng hợp nên, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của một số vi

bacteriocin đó Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và các vấn đề

về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase

Thời gian qua, những nghiên cứu về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn gram

âm, trong đó điển hình là colicins Tuy nhiên những nghiên cứu về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram dương cũng đã tiến hành, có nhiều báo cáo đã cung cấp những thông tin về vấn đề này, đặc biệt là những nghiên cứu về chúng trên vi khuẩn lactic

Các chế phẩm bacteriocin điển hình từ vi khuẩn lactic là: nisin, diplococin, subtilin,

lactotrepcin, bacteriocin S50, monocin (từ Lactococus); lactocidin, acidolin, acidophilin, reuterin, lactacin F, lactocin 27, helveticin J (từ Lactobacillus); leuconocin S, carnocin UI49, micrograd (từ Leuconostoc), pediocin A, pediocin PA-1, pediocin AcH (từ Pediococus)…

Có nhiều tiêu chí để định nghĩa về bacteriocin, những tiêu chí này được dùng trong nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác nhau cho những bacteriocin khác nhau, những tiêu chí đó là:

- Phạm vi ức chế đối với những loại khác

- Sự có mặt của loại protein hoạt động

- Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn

- Loại tế bào mà nó tác dụng

- Các yếu tố di truyền

- Do quá trình tổng hợp sinh học có tính ức chế

2.9.1 Phân loại bacteriocin

Một lượng lớn bacteriocin được tổng hợp từ vi khuẩn lactic và được phân loại theo những đặc tính hoá sinh và di truyền học của chúng

a/ Loại Lantibiotic:

Khối lượng phân tử nhỏ, hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào, tạo những lỗ trong tế bào chất của loài nhạy cảm Chất điển hình thuộc nhóm này là nisin

b/ Loại Non-Lantibiotic:

Khối lượng phân tử biến thiên, ổn định nhiệt, chứa những amino axit thông thường

Đại diện tiêu biểu là Leucocin A, pediocin P1-A, những peptit này thường kháng Listeria

2.9.2 Cơ chế hoạt động của Bacteriocin

Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành tính chất làm thay

đổi tính thấm của màng tế bào, một số loại bacteriocin còn có khả năng phân giải

ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Lacticin 3147

có tác dụng diệt khuẩn trên những tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành

tế bào Đó là nguyên nhân làm cho màng tế bào tạo ra những đường hướng cho photphat vô cơ đi ra khỏi tế bào Để tái tích luỹ lại những ion này, những hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới sự thuỷ phân của ATP bên trong, làm chức năng tế bào bị phá vỡ, tế bào dần mất năng lượng và chết

2.9.3 Kiểu hoạt động của bacteriocin từ vi khuẩn lactic

Một số bacteriocin thuộc loại Lantibiotic như nisin có kiểu hoạt động điển hình là chúng có thể kết hợp với lipid của tế bào như phương tiện vận chuyển peptidoglycan subunits từ tế bào chất đến thành tế bào, do đó ngăn cản sự tổng hợp thành tế bào, làm

tế bào chết

2.9.4 Ứng dụng của bacteriocin từ vi khuẩn lactic

Nisin, đại diện tiêu biểu cho các bacteriocin được sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic là một polypeptit có khả năng kìm hãm đặc hiệu nhiều loại vi khuẩn khác nhau, đặc biệt

là các vi khuẩn Clostridium, nisin hầu như hoàn toàn vô hại với người do chúng dễ

dàng bị phân huỷ bởi các enzym đường tiêu hoá Nhờ có đặc tính này mà các chế phẩm nisin hiện được ứng dụng rộng rãi để làm chất bảo quản thực phẩm

Một ưu điểm lớn của nisin là do hầu như không tác dụng lên các loài vi khuẩn gram

âm nên chúng không làm ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột có lợi của người Trong công nghệ chế biến sữa, để khắc phục hiện tượng lên men sinh hơi khó chịu và

kiểm soát quá trình lên men butyric do vi khuẩn Clostridium gây ra (trong công nghệ

sản xuất phomat) người ta sử dụng nisin thay cho nitrit trước đây, vì việc dùng nitrit

đã tạo ra một số dẫn xuất rất độc và có hoạt tính gây ung thư Việc sử dụng nisin theo

hướng này đã mang lại hiệu quả tích cực

Trong công nghệ chế biến đồ hộp, việc sử dụng nisin nhằm làm giảm khả năng chịu

nhiệt của những vi khuẩn bền nhiệt sinh bào tử như Clostridum perfrigens,

Clostridium thermocacharolyticum hay Bacillus stearothermophilus nhằm hạ thấp

nhiệt độ và thời gian thanh trùng nhưng vẫn đảm bảo tính hiệu quả của quá trình Bên cạnh đó nisin còn kìm hãm và ngăn ngừa quá trình thối rữa nếu bào tử còn sót lại sau thanh trùng Nhóm sản phẩm thường áp dụng là cà chua nghiền, cà rốt nghiền, các sản phẩm nấm mũ, đậu quả đông hộp…

Trong công nghệ chế biến các sản phẩm thịt, người ta đang nổ lực tìm kiếm một giải pháp công nghệ để thay thế cho việc sử dụng nitrit và nisin đang thu hút được sự quan tâm của các nhà sản xuất, trong đo hướng phối hợp nisin – nitrit cho hiệu quả rất khả quan và đang tiếp tục được thử nghiệm

2.10 Một số vấn đề liên quan đến việc phân lập và tuyển chọn vi sinh vật

Vô trùng là một vấn đề tối quan trọng trong việc phân tích vi sinh nói chung cũng như việc phân lập và tuyển chọn vi sinh vật Nếu khâu vô trùng không được thực hiện một cách triệt để thì quá trình nghiên cứu sẽ không thu được kết quả như mong muốn

2.10.1 Vấn đề khử trùng môi trường dinh dưỡng

Môi trường dinh dường dùng cho phân lập rất dễ bị vi sinh vật bên ngoài nhiễm vào trong quá trình pha chế hay tiếp xúc với không khí, dụng cụ chứa, nên vi sinh vật cần phân lập sẽ bị cạnh tranh bởi những vi sinh vật tạp nhiễm này do dinh dưỡng trong môi trường là có giới hạn Ngoài ra vi sinh vật tạp nhiễm có thể sinh ra những những sản phẩm có hại làm hạn chế sự phát triển của vi sinh vật cần phân lập Do đó môi trường không được phép có bất kỳ một vi sinh vật sống nào, hay nói cách khác là hoàn toàn vô trùng trước khi đưa vào phân lập

• Các phương pháp tiệt trùng:

- Nhiệt là phương pháp tiệt trùng phổ biến Nó được dùng đối với môi trường lỏng hoặc rắn mà có thể gia nhiệt được Gia nhiệt có thể là khô hay ướt (hơi nước) Gia nhiệt ướt có hiệu quả cao hơn gia nhiệt khô vì sự chịu nhiệt của bản thân các tế bào vi khuẩn sinh dưỡng thường tăng rất nhiều khi ở trạng thái khô hoàn toàn, do đó tốc độ chết nhiệt của tế bào khô thấp hơn tế bào ướt Vì vậy, tiệt trùng nhiệt khô chỉ dùng cho thuỷ tinh hoặc nguyên liệu rắn có thể chịu nhiệt Với các nồi hấp áp lực, nhiệt độ của hơi nước có thể tăng cao hơn nhiệt độ sôi của nước rất nhiều Các nồi hấp tiệt trùng trong phòng thí nghiệm thường hoạt động ở áp suất 30 psia hoặc tương ứng với

1210C Ở nhiệt độ này bào tử của vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt

- Các tác nhân hoá học có thể được dùng để tiêu diệt vi sinh vật bởi tính oxy hoá mạnh của chúng Tuy nhiên, chúng không được dùng để tiệt trùng môi trường vì hoá chất dư thừa có thể ức chế vi sinh vật cần nghiên cứu

- Tia cực tím có thể tiêu diệt tế bào do sự phá huỷ cấu trúc AND, làm chết tế bào khi

tế bào hấp phụ Tuy nhiên, khả năng xuyên qua vật liệu của tia cực tím là rất hạn chế Nên nó chỉ được dùng giới hạn trong việc làm giảm số lượng vi sinh vật trong phòng nơi mà cần phải duy trì điều kiện vô trùng như phòng mổ của bệnh viện, phòng vô trùng trong phòng thí nghiệm

- Tia X tiêu diệt được vi sinh vật và có khả năng xuyên thấu cao Tuy nhiên việc sử dụng chúng cho vô trùng là không thực tế vì giá rất đắt và không an toàn cho người sử dụng

- Sóng âm thanh và sóng siêu âm với cường độ cao có thể phá vỡ hoặc tiêu diệt tế bào Kỹ thuật này thường được dùng để phá vỡ tế bào trong trường hợp trích ly nội bào hơn là cho mục đích vô trùng

Trong các phương pháp trên, tiệt trùng nhiệt ướt là hiệu quả nhất để tiệt trùng môi trường dinh dưỡng dùng để phân lập vi sinh vật

Môi trường đem khử trùng trong nồi áp lực được rót ở mức không quá 1/2 chiều cao của bình đựng chúng Các bình dụng cụ chứa môi trường được đậy bằng nút bông khá chặt và các sợi bông phải sắp xếp đều Không nên đậy các bình chứa môi trường trong nồi hấp áp lực bằng cellophan hay các vật kính khác không cho hơi đi qua vì khi đó nhiệt độ của môi trường không đạt được nhiệt độ khử trùng Môi trường sau khi tiệt trùng được giữ trong tủ ấm ổn nhiệt ở 300C trong một đến 2 ngày để kiểm tra tình trạng vô trùng

2.10.2 Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh

Phương pháp khử trùng các dụng cụ thuỷ tinh là phương pháp khử trùng bằng không khí nóng Nhiệt độ khử trùng từ 165 ÷ 1800C trong 2 giờ, khi đó các bào tử lẫn tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật sẽ bị tiêu diệt

Dụng cụ thuỷ tinh trước khử trùng phải được rữa kỹ, sau đó làm khô và gói giấy kỹ để

đảm bảo tính vô trùng khi sử dụng Miệng của các ống pipet phải được bịt bằng nút

bông và được quấn giấy từ đầu nhỏ giọt theo hình xoắn ốc đến hết chiều dài pipet Các

ống nghiệm thuỷ tinh được đậy bằng nút bông và được gói thành từng bó 5 ÷10 ống

Đĩa petri được gói thành từng chồng 4 ÷ 5 cái

Các dụng cụ được xếp vào tủ sấy không quá khít để đảm bảo không khí được lưu thông Nhiệt độ tủ không nên quá 1800C vì sẽ làm cháy giấy Sau khi khử trùng phải

hạ nhiệt độ 800C mới được mở tủ sấy để tránh nứt vỡ dụng cụ

2.10.3 Nguyên tắc phân lập các giống thuần khiết

Các chủng vi sinh vật cần phân lập được tích luỹ trong những nguyên liệu được nghiên cứu, trong đó có thể có nhiều chủng vi sinh vật khác cùng tồn tại và sinh trưởng Để phân lập được các chủng cần nghiên cứu, cần phải hiểu rõ những đặc tính

cơ bản của chủng cũng như các phản ứng đặc trưng để nhận diện Do đó, môi trường phân lập ngoài những thành phần dinh dưỡng cần thiết cho chủng sinh trưởng cần phải

có những thành phần đặc trưng có thể tương tác với các quá trình sinh lý của chủng qua những phản ứng hoá học để từ đó có thể nhận diện chính xác chủng từ những khuẩn lạc tách rời

Để thu được các chủng thuần khiết từ những khuẩn lạc thu được phải tiến hành cấy

chuyền lặp lại từ 1 ÷ 2 lần rồi chọn từ đó những khuẩn lạc đặc trưng nhất Giống thuần khiết thu được cần giữ lại để phục vụ quá trình nghiên cứu

2.11 Môi trường dinh dưỡng

2.11.1 Nguyên tắc thành lập môi trường

Do khả năng tổng hợp và cách thức thu nhận năng lượng của các vi sinh vật khác nhau nên nhu cầu vế các chất dinh dưỡng cacbon, nitơ, khoáng… cũng khác nhau Vì vậy, khi thành lập môi trường phục vụ cho việc nuối cấy, phân lập, bảo quản giống vi sinh vật thì môi trường đó cần phải chứa đựng tất cả các thành phần cho các quá trình cấu trúc và năng lượng của tế bào bao gồm cacbon, nitơ, khoáng, các nguyên tố vi lượng…Chúng được đưa vào môi trường dưới dạng các chất khác nhau

2.11.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn lactic

- Môi trường LBS Medium:

Pancreatic digest of casein 10g

Sulfate Mg 0,1g

Hoà tan các thành phần, gia nhiệt rồi thanh trùng ở 1210C trong 15 phút

2.12 Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

Công tác bảo quản giống vi sinh vật có một ý nghĩa rất lớn trong mọi phòng nghiên cứu và trong công nghiệp vi sinh vật Nó không chỉ đơn thuần là giữ những chủng giống trên một vài môi trường dinh dưỡng thông thường và định kỳ cấy chuyền mà phải làm thế nào để giống sống sót và giữ được những đặc tính ban đầu, nếu không giữ được những đặc điểm ban đầu của chủng thì mọi thành quả thu được sẽ trở thành

vô ích

2.12.1 Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng

Giống trên môi trường thạch nghiêng thường được bảo quản ở 4 ÷ 50C Ở điều khiện này vẫn xảy ra hiện tượng mất nước của môi trường, làm khô dần môi trường và giống

có thể bị chết Để khắc phục điều này người ta ngăn cách mặt thạch chứa giống với không khí bằng một lớp dầu khoáng (parafin, vazơlin hoặc các lớp keo y học) rồi trữ ở

50C

Phương pháp giữ giống với dầu khoáng tương đối thuận tiện và cho kết quả tốt Giống sau 12 tháng vẫn giữ được hình dáng bề ngoài bình thường Phương pháp này được áp dụng rộng rãi để giữ nhiều loại vi sinh vật: 100% xạ khuẩn, 80% chủng nấm men, 74% chủng vi khuẩn, 73% chủng nấm mốc

2.12.2 Phương pháp giữ giống trên môi trường đất, cát

Bào tử của hầu hết nấm mốc, xạ khuẩn ít chịu tác dụng của điều kiện bên ngoài, chúng

có khả năng sống ở những điều kiện khó khăn trong thời gian dài Vì vậy người ta có thể ứng dụng đất khô, cát … để bảo quản bào tử vi sinh vật có hiệu quả rất tốt Nhiều nghiên cứu cho thấy chúng có thể sống tới 10 ÷ 20 năm

2.12.3 Phương pháp lạnh đông và đông khô

Phương pháp này dựa trên cơ sở ức chế vi sinh vật để giữ các chủng giống trong một thời gian dài Sự phân chia tế bào của vi sinh vật sẽ ngừng lại ở trường hợp lạnh đông hoặc lạnh đông kết hợp với sấy khô

Phương pháp lạnh đông tiến hành làm lạnh các môi trường có giống phát triển và giữ

ở nhiệt độ lạnh sâu: -15 ÷ -200C; -20 ÷ -300C; -30 ÷ -400C… Trong quá trình làm lạnh

sâu, tế bào vi sinh vật có thể bị chết Để khắc phục, người ta tiến hành nhũ hoá môi trường và chú ý tốc độ làm lạnh Chất nhũ hoá là dung dịch glyxerin 15% trong nước, huyết thanh ngựa không có chất bảo quản, dung dịch sacaroza 10% với gelatin 1% có

pH 6,8 ÷ 7,0 hoặc các dung dịch chứa glucoza, lactoza, có 10 ÷ 30% sữa…

Khi làm lạnh tới -20, -250C hoặc thấp hơn phải giữ tốc độ làm lạnh không lớn hơn 1 ÷

20C/phút

Các chủng giống lạnh đông cần phải quy định thời gian cấy chuyền :

- Ở nhiệt độ -15 ÷ -200C trong 6 tháng

- Ở nhiệt độ -30 trong 6 ÷ 9 tháng

- Ở nhiệt độ -400C trong 1 năm

- Ở nhiệt độ -50 ÷ -600C trong 3 năm

- Ở nhiệt độ -70 ÷ -800C khoảng 10 năm

Phương pháp đông khô, tức là nhanh chóng hạ tới -200C nhiệt độ của một thể tích hỗn dịch chủng vi sinh vật đựng trong một ống thuỷ tinh có tiết diện nhỏ và làm khô nó trong chân không tới 1/20 mmHg, đồng thời giữ hơi nước lại trong một ‘bẫy” không khí lỏng Ống thuỷ tinh sau khi đã làm khô, được hàn kín trong chân không và bảo quản trong tủ lạnh từ 1 ÷ 20 năm Phương pháp có nhiều thuận lợi là sự phân huỷ các protein và các enzym của vi sinh vật được giảm đến mức tối thiểu nhờ sấy nhanh, và tránh được nồng độ cao của các chất hoà tan trong dung dịch nhờ làm lạnh đột ngột Sau cùng nhờ chân không cao nên trong ống không còn oxy

Tuy nhiên, không có phương pháp nào trong những phương pháp trên là hoàn hảo cả Với mỗi chủng vi sinh vật mới phân lập được, chỉ có thể xác định được kỹ thuật tốt nhất sau một quá trình thực nghiệm có hệ thống

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Phương tiện thí nghiệm

Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh, bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa NÔNG NGHIỆP trường ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Thời gian tiến hành: bắt đầu từ ngày 3/01/2011 đến ngày 22/4/2011

- Dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm: Becher, ống đong, bình tam giác, bình

định mức, ống nghiệm, đĩa petri, pipet, micropipet, máy đo pH và một số dụng cụ

Lactobacillus sakei subsp Sakei JCM 1157 T

Lactobacillus sakei TISTR 890

- Nguyên liệu thí nghiệm :

Nem chua vissan

Rau muối chua (cơ sở sản xuất Hoàng Sơn)

3.2 Phương pháp thí nghiệm

3.2.1 Phương pháp chung

Với mục tiêu là tìm được những chủng vi khuẩn lactic thuần nhất có đặc tính kháng khuẩn, chúng tôi tiến hành phân lập từ nem chua và rau muối chua trên môi trường phân lập gồm các thành phần : môi trường MRS, Agar, CaCO3 Từ những khuẩn lạc nhận diện được (có những đặc tính rõ ràng của vi khuẩn lactic) chúng tôi tiến hành cấy chuyền trên môi trường có thành phần như trên để tuyển chọn những chủng lactic thuần nhất (gọi là chủng LAB) Từ những LAB thu được, tiến hành tăng sinh trong môi trường MRS Khi chủng đã sinh trưởng đến mật độ thích hợp trữ đông một phần của chủng để phục vụ việc nghiên cứu về sau, phần còn lại đem ly tâm để lấy phần dịch trong Phần dịch trong này được điều chỉnh đến pH thích hợp rồi đun sôi Các chủng sau đun sôi được thử đặc tính kháng khuẩn Dựa vào kết quả thử, kết luận về kết quả của quá trình thí nhiệm