Tuyển chọn và nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic từ nem chua

Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A LỜI CAM ĐOAN Tôi xi cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc khóa luận cám ơn thơng tin trích dẫn chun đề ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 30 tháng 05 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Thủy Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội i Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực khóa luận phòng thí nghiệm Bộ mơn Hóa sinh – Cơng nghệ sinh học thực phẩm, Khoa Cơng nghệ thực phẩm ngồi cố gắng nỗ lực thân, nhận hướng dẫn nhiệt tình, chu đáo thày cô giáo Trước hết , xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Lâm Đồn – Bộ mơn Hóa sinh – Cơng nghệ sinh học thực phẩm Khoa Công nghệ thực phẩm người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình tạo điều kiện mặt tốt cho suốt trình thực đề tài hồn thiện khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ, bảo ân cần thày giáo, giáo Bộ mơn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội suốt thời gian hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè giúp đỡ động viên, khích lệ cho tơi thời gian Với quỹ thời gian có hạn hiểu biết nhiều hạn chế nên q trình thực khóa luận tơi khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót Kính mong có đóng góp ý kiến thầy bạn để khóa luận hồn thiện Hà Nội, ngày 30 tháng 05 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Thủy Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội ii Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A MỤC LỤC Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội iii Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình, dị hình Error: Reference source not found Bảng 3.1 Ký hiệu chủng vi khuẩn lactic hoạt hóa Error: Reference source not found Bảng 4.1 Ký hiệu chủng vi khuẩn lactic sống sót sau hoạt hóa Error: Reference source not found Bảng 4.2 Khả chịu acid chủng vi khuẩn lactic Error: Reference source not found Bảng 4.3 Khả chịu muối mật chủng vi khuẩn lactic Error: Reference source not found Bảng 4.4 Khả sinh acid chủng vi khuẩn lactic Error: Reference source not found Bảng 4.5 Tốc độ phát triển chủng vi khuẩn lactic Error: Reference source not found Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội iv Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Hình ảnh chủng vi khuẩn sau hoạt hóa Error: Reference source not found Hình 4.2 Hình ảnh nhuộm Gram chủng tuyển chọn Error: Reference source not found Hình 4.3 Hình ảnh thí nghiệm kiểu lên men chủng vi khuẩn lactic Error: Reference source not found Hình 4.4 Khả sinh trưởng nhiệt độ khác .Error: Reference source not found Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội v Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU FAO : Tổ chức nông nghiệp lương thực giới WHO : Tổ chức Y tế giới MRS : Deman Rogosa Sharpe Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội vi Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A PHẦN THỨ NHẤT – MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ thủa khai sinh, khoa học kỹ thuật chưa phát triển người tự biết cách bảo quản thực phẩm để sử dụng lâu dài, phương pháp làm khơ, ướp muối, lên men Trong lên men coi phương pháp sử dụng phổ biến Sau này, người ta tìm vi khuẩn lactic yếu tố định đến trình lên men, điều có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu Vi khuẩn lactic phổ biến, có mặt hầu hết sản phẩm lên men truyền thống dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua số sản phẩm men tiêu hóa đơng khơ Trong q trình lên men ngồi khả sinh lactic acid, sinh tổng hợp chất khác, chẳng hạn diacetyl, chất kháng khuẩn bacteriocin làm cho sản phẩm không thơm ngon mà bảo quản lâu Bên cạnh vi khuẩn lactic sử dụng để phòng điều trị bệnh ngày phổ biến Các chế phẩm hỗ trợ tiêu hóa chế tạo từ vi khuẩn lactic sinh lactic acid sử dụng trường hợp tiêu hóa Trong nông nghiệp, ứng dụng nhiều ngành chăn nuôi, sử dụng vi khuẩn lactic để ủ chua thức ăn cho gia súc, với mục đích tăng giá trị dinh dưỡng kéo dài thời gian sử dụng [11] Vi khuẩn lactic đa dạng gồm nhiều chủng loại với chức khác Chính việc tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic với đặc tính mong muốn vô cần thiết công nghệ chế biến bảo quản thực phẩm Để nâng cao chất lượng tính an tồn cho thực phẩm người ta phải lựa chọn chủng giống có đặc tính sinh học tốt sinh tổng hợp chất kháng khuẩn (bacteriocin), enzyme, có đặc tính probiotic… Ngày vi khuẩn lactic sử dụng phổ biến lĩnh vực probiotic [8,13] Probiotic nhóm vi khuẩn có lợi Probiotic an tồn sử dụng thân thiện với mơi trường Lợi ích probiotic mang lại nhiều có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh, tăng cường hệ miễn dịch, tăng cường tiêu hóa lactose hoạt động enzyme khác [8] Trên giới việc nghiên cứu probiotic bổ sung vào thực phẩm hay ứng dụng chúng Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A lĩnh vực khác phổ biến Ở Việt Nam, chế phẩm probiotic dần trở nên thông dụng, đa phần sử dụng chăn nuôi gia cầm bắt đầu sử dụng cho loài thủy hải sản Bên cạnh chế phẩm giúp hỗ trợ rối loạn tiêu hóa hệ đường ruột phù hợp cho đối tượng khác Những năm gần đây, loại thực phẩm có vi sinh vật probiotic ưa chuộng Việt Nam Chính việc tuyển chọn chủng đạt tiêu chuẩn probiotic vô quan trọng lĩnh vực đời sống Vậy nên tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic có tiềm probiotic từ nem chua” 1.2 Mục đích – Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Tuyển chọn số chủng vi khuẩn lactic có tiềm probiotic từ chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua nghiên cứu trước 1.2.2 Yêu cầu - Hoạt hóa giữ giống chủng vi khuẩn lactic - Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có tiềm probiotic - Nghiên cứu số đặc điểm số chủng tuyển chọn Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nem chua 2.1.1 Giới thiệu nem chua Nem chua sản phẩm thịt lên men cổ truyền tiếng Việt Nam xuất hầu hết vùng miền, sản phẩm đặc trưng số vùng Hà Nội, Thanh Hóa , Huế, Đà Nẵng… Thành phần chủ yếu thịt lợn lạc với bì lợn số gia vị, phụ gia nên sản phẩm giàu dinh dưỡng, hương vị hài hòa, màu sắc đặc trưng nhiều người ưa thích Nem thường gói chuối, vơng, gói kèm với ổi, đinh lăng, tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm cho sản phẩm Các gia vị thường sử dụng tỏi, ớt, tiêu… với bì lợn (được trần chín thái sợi) sử dụng công thức phối trộn nem chua nhằm giảm độ nhớt, tạo cấu trúc hương thơm cho sản phẩm [15] Quá trình lên men nhiệt độ 25-30 oC 2-3 ngày Ở nhiệt độ 30oC xảy trình lên men lactic hình thành lactic acid Lactic acid tạo thành làm giảm pH thịt làm thay đổi cấu trúc thịt, ức chế ngăn chặn phát triển vi sinh vật gây thối tạo vị chua cho sản phẩm Nem chua đánh giá đạt chất lượng ăn thấy độ dai thịt (khơng bị nhão), có vị chua lactic acid , có vị cay tiêu ớt, có vị đường, bột Trên bề mặt nem khơ khơng nhày nhớt, khơng có nấm mốc phát triển [12] 2.1.2 Nguyên liệu sản xuất nem chua - Thịt nạc Một yếu tố quan trọng định chất lượng nem chua nguyên liệu thịt ban đầu Trong sản xuất nem chua ta sử dụng thịt heo nạc phải nhận từ lò giết mổ (thịt nóng), khơng sử dụng loại thịt có màu sẫm [13] u cầu thịt nạc để sản xuất nem chua khắt khe Không phải phần nạc thể heo dùng làm nem Phần sử dụng phải thịt nạc đùi sau nạc mơng, thịt nạc phận vừa mềm, gân, mỡ ảnh hưởng đến biến đổi hóa sinh nem q trình chín tạo nên chất lượng nem Nếu thịt lẫn mỡ ảnh hưởng đến khả Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A tạo gel sau Đồng thời giảm thời gian xử lý nguyên liệu lọc, quết ngắn [13,29] Một khâu quan trọng trình xử lý thịt ban đầu tuyệt đối khơng rửa qua nước Khi thịt rửa nước tạo điều kiện cho vi sinh vật xâm nhập từ nguồn nước nguồn vơ khuẩn sau rửa ta làm táng hàm lượng nước thịt Mục đích để hạn chế tối đa độ ẩm [12,29] - Bì lợn Bì lợn có giá trị dinh dưỡng thấp thịt nạc Nó cấu tạo từ protein khung mạng Đó protein: colagen elastin Colagen protein có cấu trúc dạng sợi, khơng tan nước, dung dịch muối loãng, dung dịch kiềm loãng, khơng đàn hồi bảo vệ cho thể chống lại kéo căng Từ nguyên liệu da lợn sau giết mổ, đem rửa sau đem luộc chín, vớt rửa lại nước lạnh, cạo lơng, hong gió, tách mỡ, cắt tạo hình Da có màu vàng tự nhiên, khơng sử dụng thuốc tẩy Nó có vai trò chất độn, chất kết dính phần tử mơ giúp định hình sản phẩm làm tăng giá trị cảm quan nem chua, tăng độ giòn, dai [12,29] - Đường Đường sử dụng sản xuất nem chua tác dụng tạo hương vị, chất cho q trình lên men tạo acid Do có tính chất háo nước nên đường giúp trạng thái liên kết gel thịt thêm chặt chẽ Có thể sử dụng nhiều loại đường khác như: lactose, galactose, maltose, saccharose thông thường sử dụng đường saccharose trình sản xuất [12,29] - Muối ăn Trong sản xuất nem chua, muối ăn nguyên liệu cần quan tâm Muối ăn tạo vị mặn cần thiết cho nem Ngoài muối ăn có tác dụng ức chế phát triển vi sinh vật gây hư hỏng sản phẩm Muối ăn sử dụng với nồng độ phù hợp để tránh ức chế vi sinh vật mong muốn làm giảm giá trị cảm quan nem chua [15] - Bột Bột bổ sung vào nhằm tạo vị cho nem chua Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A Từ kết kết bảng 4.2 ta thấy thời điểm mức pH khác số OD không khác nhiều điều chứng tỏ thời điểm chủng đưa vào chưa chịu ảnh hưởng pH Các chủng vi khuẩn lactic có khả sinh acid nên thời điểm ni cấy, mơi trường có pH thấp chúng khơng bị ảnh hưởng Trong điều kiện mơi trường có điều chỉnh pH=3 chúng tơi tìm chủng DCB 4.21, DCB 5.22, DH 7.19, DP 4.39, DP 4.48, DP 5.3, DCM 5.18 có khả sinh trưởng phát triển tốt môi trường pH=3 nuôi cấy, thể qua số đo OD tăng lên (ví dụ chủng DCB 4.21 OD tăng từ 0,8486 đến 1,8947) Kết đạt tương kết đạt cơng trình nghiên cứu trước Một số kết Mish Prasad (2005), họ tìm chủng vi khuẩn lactic có khả chịu pH=3 ni cấy [19] Với mơi trường có pH=2, chúng tơi tìm chủng DCB 4.21, DCB 5.22, DH 7.19, DP 4.39, DP 4.48, DP 5.3 tồn có khả phát triển tốt điều kiện nuôi cấy pH=2 (ví dụ chủng DCB 4.21 số đo OD tăng từ 0,9635 đến 1,6945) Từ kết bảng 4.2 thấy chủng DCB 4.21, DCB 5.22, DH 7.19, DP 4.39, DP 4.48, DP 5.3 có khả phát triển tốt điều kiện pH=2, pH=3 Kết phù hợp với kết nghiên cứu Matisic Rogelj (2000) họ tìm chủng Lactobacillus sp K7 chịu pH=2, pH=3 [19] Tại mức pH thấp pH=1,5 chúng tơi tìm chủng DCB 4.21, DCB 5.22, DP 4.39, DP 4.48 có khả sống phát triển tốt giờ, thể qua số đo OD tăng lên (ví dụ chủng DCB 4.21 số đo OD tăng từ 0,8355 đến 1,4882) Điều chứng tỏ chủng có khả thích nghi cao mơi trường pH=1,5 Đây giới hạn pH thấp dày Từ kết đạt từ bảng 4.2, với chủng có khả chịu ngưỡng pH khác nhau, chúng tơi tìm chủng DCB 4.21, DCB 5.22, DH 7.19, DP 4.39, DP 4.48 có khả sinh trưởng phát triển tốt mơi trường có pH=1,5, pH=2, pH=3 Các chủng phù hợp sống môi trường pH dịch vị dày 30 Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A Cùng với phù hợp với cơng trình nghiên cứu trước chúng tơi nhận thấy chủng DCB 4.21, DCB 5.22, DH 7.19, DP 4.39, DP 4.48 có thích nghi tốt mơi trường pH dày Chính chủng đạt tiêu chuẩn probiotic 4.3 Khả chịu muối mật Một thách thức tồn vi sinh vật dày ruột người diện mật ruột non Mật có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật nhờ vào hoạt động phá hủy màng tế bào vi sinh vật [6] Do chủng probiotic cho người cần có khả tồn mơi trường có muối mật Theo Gilliland cộng (1984) cho môi trường bổ sung 0,3% muối mật xem nồng độ định để sàng lọc chủng vi sinh vật có khả chịu muối mật Vì nồng độ xem nồng độ trung bình ruột người [13,19] Ngoài thời gian chịu đựng muối mật yếu tố quan trọng định khả trì sống sót thời gian Chúng ta biết hệ tiêu hóa người ống dài gồm thực quản - dày - ruột non Trong ruột non tiết enzyme pancretine muối mật ức chế phát triển vi sinh vật, thức ăn lưu ruột non giờ, vi sinh vật cần sinh trưởng phát triển khoảng thời gian đạt tiêu chuẩn probiotic [15] Với nghiên cứu trước đó, người ta khảo sát khả tồn chủng vi sinh vật sống mơi trường muối mật vòng Chính chúng tơi theo dõi sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn lactic mơi trường MRS có bổ sung 0,3% muối mật cách tiến hành phần 3.3.2.2 Kết khả chịu muối mật chủng vi khuẩn lactic qua bảng 4.3 Qua bảng 4.2 chúng tơi tìm thấy chủng DCB 4.21, DH 6.18, DP 4.27, DP 4.29, DP 5.5, DCM 5.18 có khả sinh trưởng phát triển tốt mơi trường có bổ sung 0,3% muối mật sau theo dõi thể qua số đo OD tăng lên (ví dụ DCB 4.21 số OD tăng từ 0,7021 đến 1,2974) Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 31 Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A Bảng 4.3 Khả chịu muối mật chủng vi khuẩn lactic STT Tên chủng OD620 (nm) giờ DCB 4.11 0,8392 0,7372 DCB 4.21 0,7012 1,2974 DCB 4.35 0,9582 0,7894 DCB 5.22 0,8269 0,8016 DH 5.1 0,7841 0,6415 DH 6.14 0,7016 0,6745 DH 6.16 0,7981 0,7854 DH 6.18 0,8153 0,9956 DH 7.19 0,8167 0,7013 10 DP 4.27 0,8308 1,3895 11 DP 4.29 0,792 1,2173 12 DP 4.35 0,7046 0,6582 13 DP 4.39 0,7049 0,6024 14 DP 4.42 0,7395 0,6058 15 DP 4.48 0,859 0,7538 16 DP 5.3 0,958 0,8753 17 DP 5.5 0,9067 1,4865 18 DP 5.6 0,8564 0,7843 19 DP 5.7 0,8672 0,1274 20 DP 6.4 0,8956 0,7894 21 DCM 5.18 0,7861 0,9712 22 DCM 5.35 0,7432 0,6543 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 32 Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A Còn chủng lại chúng khơng thể phát triển muối mật độc chất tiết từ gan, có hệ tiêu hóa Nó có tác động mạnh đến hệ vi sinh vật, tiêu diệt vi sinh vật gây hại có số vi sinh vật tiêu biểu có đặc điểm bật kháng phát triển Chúng tiến hành nghiên cứu 22 chủng đo số sinh trưởng phát triển mốc Chỉ số OD tăng lên đánh giá chủng sống mơi trường muối mật Một tiêu chí đánh giá khả chịu muối mật thông qua thời gian tăng lên 0,3 đơn vị Từ bảng 4.3 tìm chủng DCB 4.21, DP 4.27, DP 4.29, DP 5.5 có mức tăng OD cao Với mức tăng ∆OD = 0,5962 (OD tăng 0,7012 đến 1,2974 với chủng DCB 4.21), ∆OD = 0,5587 (OD tăng từ 0,8308 đến 1,3895 với chủng DP 4.27), ∆OD = 0,4258 (OD tăng từ 0,7915 đến 1,2173 với chủng DP 4.29), ∆OD = 0,5798 (OD tăng từ 0,9067 đến 1,4865 với chủng DP 5.5) Sau theo dõi chủng có số đo OD tăng 0,3 đơn vị Điều chứng tỏ chủng có khả sinh trưởng phát triển tốt mơi trường có bổ sung 0,3% muối mật Còn chủng DH 6.18 DCM 5.18 khả chịu đựng mức thấp So sánh với kết nghiên cứu trước Kết chúng tơi đưa tương tự kết đạt Jacobsen cộng (1999), họ tìm 46 47 chủng Lactobacillus thí nghiệm có khả chịu 0,3% muối mật Mota cộng (2006) tiến hành nghiên cứu khả kháng muối mật chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus phân lập từ gà, kết có chủng bị ức chế hồn tồn có dịch mật bò nồng độ 0,3% Lactobacillus acidophilus 2M14E, hai chủng lại có tốc độ tăng trưởng tương đối Lactobacillus acidophilus 5C14E Lactobacillus acidophilus 2G14E với thời gian tăng OD 0,3 đơn vị vào khoảng 2,1 đến [20] Các nghiên cứu Lin cộng (2007) [23] nghiên cứu khả chịu muối mật bò (0,3%) chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum phân lập từ lợn cho thấy sau thời gian tăng OD 0,3 sau khảo sát vào khoảng từ 1,3 đến 4,1 [20] Từ nghiên cứu trên, nhận thấy khả kháng muối mật vi khuẩn lactic thông qua số OD lên 0,3 đơn vị 33 Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A So sánh với số nghiên cứu nhiều công trình nghiên cứu cơng bố chúng tơi nhận thấy chủng DCB 4.21, DP 4.27, DP 4.29, DP 5.5, chủng có khả sống tốt mơi trường có bổ sung 0,3% muối mật, chủng khơng tồn mà chúng phát triển mạnh mẽ, nên chúng đạt tiêu chuẩn probiotic 4.4 Khả kháng khuẩn Có nhiều nghiên cứu phương pháp kiểm tra khả kháng vi sinh vật vi sinh vật lựa chọn làm probiotic Tuy nhiên, tất dựa khả sinh chất kháng sinh chất cạnh tranh để ngăn cản phát triển vi sinh vật gây hại Các chủng vi khuẩn lactic có khả sinh chất kháng khuẩn như: lactic acid, acetic acid, hydrogen peroxyl, diacetyl, bacteriocin, Vi khuẩn lactic nhóm sinh aicd, đặc biệt chủng lên men đồng hình Chúng tạo lượng lớn lactic aicd (>90%) [1] Lượng lactic acid sinh lớn làm giảm pH môi trường, ức chế sinh trưởng phát triển vi sinh vật có hại Trong điều kiện phòng thí nghiệm hạn chế mặt nên tiển hành xác định khả kháng khuẩn chủng thơng qua thí nghiệm khả sinh acid xác định tốc độ phát triển chúng 4.4.1 Khả sinh acid Là vi khuẩn lactic tất chủng có khả sinh lactic acid, lượng lactic sinh nhiều hay phụ thuộc vào khả lên men chúng, nhóm lên đồng hình hay dị hình Chúng tơi bố trí thí nghiệm xác định khả sinh acid 22 chủng phần 3.3.2.3.1 Kết khả chịu acid 22 chủng thể bảng 4.4 Từ bảng 4.4 nhận thấy tất 22 chủng nghiên cứu có khả sinh lactic acid Đây điểm bật vi khuẩn lactic để ứng dụng chúng trình bảo quản thực phẩm, hay dùng cho thực phẩm lên men Vì lượng lacid acid sinh tạo môi trường thuận lợi cho thân chúng bên cạnh chúng cạnh tranh dinh dưỡng làm cho chúng phát triển mặt khác kìm hãm gây bất lợi cho phát triển vi sinh vật gây bệnh Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội 34 Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A Bảng 4.4 Khả sinh acid chủng vi khuẩn lactic STT Tên chủng Số ml NaOH chuẩn độ T Nồng độ lactic acid (%) DCB 4.11 7,4 74 0,666 DCB 4.21 9,2 92 0,828 DCB 4.35 6,4 64 0,576 DCB 5.22 8,6 86 0,774 DH 5.1 8,4 84 0,756 DH 6.14 6,2 62 0,558 DH 6.16 6,4 64 0,576 DH 6.18 8,6 86 0,774 DH 7.19 8,2 82 0,738 10 DP 4.27 6,4 64 0,576 11 DP 4.29 6,8 68 0,612 12 DP 4.35 6,6 66 0,594 13 DP 4.39 9,4 94 0,846 14 DP 4.42 8,6 86 0,774 15 DP 4.48 9,2 92 0,828 16 DP 5.3 9,6 66 0,864 17 DP 5.5 6,8 68 0,612 18 DP 5.6 8,6 86 0,774 19 DP 5.7 6,4 64 0,576 20 DP 6.4 6,8 68 0,612 21 DCM 5.18 6,4 64 0,576 22 DCM 5.35 6,2 62 0,558 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội O 35 Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A Điều chứng tỏ chúng có khả kháng khuẩn lớn điểm tiêu biểu sở cho lựa chọn chủng làm probiotic Trong số 22 chủng lựa chọn 10 chủng DCB 4.21, DCB 5.22, DH 5.1, DH 6.18, DH 7.19, DP 4.42, DP 4.48, DP 5.3, DP 5.6 có lượng lactic acid sinh cao nên có khả kháng khuẩn mạnh Chúng phù hợp đạt tiêu chuẩn probiotic 4.4.2 Tốc độ phát triển Một phương pháp kiểm tra khả kháng khuẩn vi khuẩn lactic tốc độ phát triển, chủng có khả phát triển tốt lấn át vi sinh vật gây bệnh, chúng cạnh tranh dinh dưỡng với để tồn phát triển Tốc độ phát triển chủng thể thể qua bảng 4.5 Qua kết bảng 4.5, nhận thấy tốc độ phát triển đa số chủng vi khuẩn lactic mạnh khoảng thời gian từ đến 48 Kết phù hợp với đường cong sinh trưởng vi khuẩn lactic Cụ thể với chủng DCB 4.27 chúng phát triển khoảng đến 24 giờ, sau 24 chúng bị chết dần Chỉ có DP 4.29 chúng phát triển đến 72 giờ, chủng phát triển chậm Pha sinh trưởng chúng kéo dài tới 72 Các chủng lại phát triển đến 48 giờ, sau 48 chủng bắt đầu suy yếu chết dần Sau khoảng thời gian từ đến 48 giờ, chúng lấy dinh dưỡng từ môi trường để sinh trưởng phát triển đạt đến pha cân Sau qua ngưỡng cân chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt chúng khơng khả phát triển tế bào chết dần Trong 22 chủng tiến hành làm thí nghiệm có chủng DCB 4.21, DCB 5.22, DH 6.18, DP 5.5 có tốc độ phát triển mạnh mẽ, thời gian từ đến 48 Các chủng phát triển nhanh chúng nhanh chóng lấy dinh dưỡng từ mơi trường, khả cạnh dinh dưỡng gây áp lực cho vi sinh vật khác, khiến cho vi sinh vật khơng thể phát triển chết dần Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 36 Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A Bảng 4.5 Tốc độ phát triển chủng vi khuẩn lactic STT Chủng OD 620 nm 24 48 72 DCB 4.11 0,9748 1,3985 1,6893 0,6783 DCB 4.21 0,8355 1,7025 2,7892 0,6164 DCB 4.35 0,8186 1,2875 1,5195 0,7241 DCB 5.22 0,7762 1,8319 2,6491 0,6351 DH 5.1 0,7429 0,9628 1,3903 0,5982 DH 6.14 0,8562 1,2045 1,5702 0,7843 DH 6.16 0,9035 1,6753 0,8946 0,5614 DH 6.18 0,8561 1,9286 2,6792 0,6824 DH 7.19 0,9661 1,6319 1,8016 0,7531 10 DP 4.27 0,8972 1,9925 0,8741 0,5824 11 DP 4.29 0,7729 1,2519 1,8084 2,1759 12 DP 4.35 0,9796 1,8357 2,4923 0,6913 13 DP 4.39 0,8589 1,9483 2,3081 0,7529 14 DP 4.42 0,8561 1,7402 2,0276 0,7318 15 DP 4.48 0,9071 1,8563 2,3951 0,6392 16 DP 5.3 0,9705 1,593 1,9365 0,7643 17 DP 5.5 0,8214 1,6539 2,8531 0,7419 18 DP 5.6 0,9762 1,5296 1,7953 0,6941 19 DP 5.7 0,9518 1,0683 1,4073 0,8316 20 DP 6.4 1,1986 1,532 1,7028 0,8527 DCM 5.18 0,9755 DCM 0,8609 5.35 1,0539 1,8083 0,6305 1,6429 2,0821 0,7528 21 22 Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội 37 Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A 4.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng tuyển chọn Với tất nghiên cứu khả probiotic khả chịu acid, chịu muối mật, kháng khuẩn Trong 22 chủng nghiên cứu, chọn chủng DCB 4.21 phù hợp chúng đạt tất tiêu chí Chúng tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng thơng qua thí nghiệm vê nhuộm Gram, thí nghiệm hoạt tính catalase, xác định kiểu lên men, khả sinh trưởng ngưỡng nhiệt độ khác 4.5.1 Phản ứng nhuộm Gram Để nghiên cứu đặc điểm sinh lý chủng DCB 4.21 Chúng làm tiêu tươi để quan sát hình thái, cách xếp tế bào Chúng tơi tiến hành nhuộm Gram Hình ảnh đặc điểm chúng thể hình 4.3 Hình 4.2 Hình ảnh nhuộm Gram chủng tuyển chọn Từ kết cho thấy DCB 4.21 bắt màu tím chứng tỏ vi khuẩn Gram (+) Quan sát đặc điểm hình thái chúng tơi thấy chúng cầu khuẩn đơn riêng lẽ hay xếp thành chuỗi dài, hay xếp thành đám 4.5.2 Xác định hoạt tính catalase Để xác định hoạt tính catalase chủng DCB 4.21, chúng tơi tiến hành thí nghiệm phần 3.3.3.2 Trên lam kính khơng có tượng sủi Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội 38 Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A bọt Điều cho ta thấy vi khuẩn lactic khơng có khả sinh catalase, hay catalase âm tính 4.5.3 Xác định kiểu lên men Xác định kiểu lên men cách phân loại vi khuẩn lactic Và chúng thường chia làm hai kiểu lên men điển hình lên men đồng hình lên men dị hình Lên men đồng hình tạo lượng lớn lactic acid (>90%) [1] Trong thí nghiệm tiến hành phần 4.5.2 chủng lên men đồng hình ống Durham úp ngược khơng thấy xuất bọt khí Còn lên men dị hình tạo 50-70% lactic acid lại CO 2, etanol, Khi tiến hành thí nghiệm phần 4.5.2 ống Durham úp ngược làm xuất bọt khí, hay bọt khí ống Durham lên Chúng tơi làm thí nghiệm với chủng DCB 4.21 kết thể hình 4.7 Hình 4.3 Hình ảnh thí nghiệm kiểu lên men chủng vi khuẩn lactic Từ hình 4.3 thấy ống Durham không thấy xuất bọt khí Điều chứng tỏ chủng DCB 4.21 thuộc nhóm phân loại lên men đồng hình 39 Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A 4.5.4 Khả sinh trưởng nhiệt độ khác Với mục đích tìm nhiệt độ thích hợp cho phát triển chủng DCB 4.21 để ứng dụng vào lĩnh vực sản xuất Chính chúng tơi ni chủng DCB 4.21 48 ngưỡng nhiệt độ 30 oC, 37oC, 46oC Kết thể hình 4.4 Hình 4.4 Khả sinh trưởng nhiệt độ khác Từ đồ thị ta thấy chủng DCB 4.21 chịu nhiệt độ cao, số OD tăng mức nhiệt độ 30oC, 37oC giảm ngưỡng 46oC, điều chứng tỏ 37oC ngưỡng thích hợp cho phát triển vi khuẩn lactic Điều phù hợp để bổ sung DCB 4.21 vào thực phẩm Nhiệt độ thể 37oC, vào dày, ruột non nhiệt độ ngưỡng 37oC, điều phù hợp cho phát triển Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội 40 Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A PHẦN THỨ NĂM KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu rút số kết luận sau: - Hoạt hóa 22 chủng sống sót - Tìm chủng DCB 4.21, DCB 5.22, DH 7.19, DP 4.39, DP 4.48 có khả chịu pH=1,5, pH=2, pH=3 - Tìm chủng DCB 4.21, DP 4.27, DP 4.29, DP 5.5 có khả chịu 0,3% muối mật - Tìm 10 chủng có khả sinh acid mạnh DCB 4.21, DCB 5.22, DH 5.1, DH 6.18, DH 7.19, DP 4.39, DP 4.42, DP 4.48, DP 5.3, DP 5.6 - Tìm chủng DCB 4.21, DCB 5.22, DH 6.18, DP 5.5 có tốc độ phát triển mạnh - Từ chủng nghiên cứu chọn chủng DCB 4.21 đạt tiêu chuẩn có khả chịu acid, muối mật, kháng khuẩn tốt Chúng tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh lý, hóa sinh chúng + Là vi khuẩn Gram (+) + Catalase âm tính + Lên men đồng hình + Phát triển mạnh 37oC 5.2 ĐỀ NGHỊ Do thời gian, kinh phí, thiết bị thực tập eo hẹp nên chúng tơi thu kết định xin có số đề nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu chủng tuyển chọn khả bám dính, khả chịu enzyme ruột để tạo làm chế phẩm probiotic - Ứng dụng chủng tuyển chọn công nghiệp sản xuất thực phẩm, chăn nuôi… Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội 41 Khố luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Kiều Hữu Ảnh (1999) Giáo trình vi sinh vật học cơng nghiệp, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Nguyễn Xuân Bách (2011) Bài báo cáo probiotic - ứng dụng chăn nuôi, Trường Đại học Quy Nhơn Nguyễn Lân Dũng (1983), thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất Đại học THCN Hà Nội Nguyễn Lân Dũng cộng (1978) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giaó dục 6.Trịnh Bỉnh Dy (2006) Sinh lý học thực vật (tập 1), Nhà Xuất Y học Hà Nội, Trường Đại học Y Hà Nội Nguyễn Thị Lâm Đoàn (2012) Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống Việt Nam, Luận văn tiến sỹ, Trường Đại học Ghent, Bỉ Nguyễn Đường cộng (1990) Vi sinh vật đại cương, NXB Nông nghiệp Nguyễn Thị Hạnh (2012) Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn probiotic trình sản xuất nước ép cà rốt, Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 10 Võ Nhân Hậu (2002) Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic khiết vào chế biến rau cải bẹ muối chua, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 11 Nguyễn Thị Diễm Hương, Đỗ Bích Thủy (2012) Khảo sát số tính chất có lợi chủng Lactobacillus DC1 phân lập từ sản phẩm dưa cải Huế, tạp chí khoa học Đại học Huế, tập 71, số 12 Nguyễn Thị Ngọc Lan (2008) Phân lập xác định đặc tính sinh lý, hóa sinh vi khuẩn lactic từ nem chua, Luận văn tốt nghiệp trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 42 Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A 13 Phan Thanh Tân (2008) Nghiên cứu số giải pháp sinh học công nghệ sản xuất nem chua, Luận án tiến sỹ kỹ thuật, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 14 Hoàng Quốc Thanh, Phạm Thị Lan Anh Phân lập, định danh xác định chủng Lactobacillus có tiềm probioitc từ người, Viện Sinh học nhiệt đới -Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Trường đại học Lạc Hồng 15 Vũ Hồng Thắng (1998) Vai trò nhóm vi khuẩn lactic trình chế biến nem chua, Luận văn tốt nghiệp cao học trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 16 Hồ Trung Thông, Hồ Lê Quỳnh Châu (2009) Nghiên cứu khả sống môi trường đường tiêu hóa động vật số chủng vi sinh vât nhằm bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probotic, tạp chí khoa học Đại học Huế, số 55 17 Nguyễn Mạnh Tuấn Đại học Nông Lâm, Phân lập tuyển chọn chủng Lactobacillus có khả sinh acid cao từ sản phẩm lên men địa bàn tỉnh Thái Nguyên để chế tạo chế phẩm sinh học (probiotic) sử dụng cho chăn nuôi 18 Đặng Thị Hồng Vân (2010) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả thủy phân tinh bột từ nguồn chất khác nhau, Luận văn tốt nghiệp trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 19 Analie Lourens-Hattingh, Bennie C Viljoen (2011) Yogurt as probiotic carrier food, International Dairy Journal, 1–17, November 20 Matijasis B.B Rogerlj I (2000) Latobacillus K7 – a New Candidate for Probiotic Strain Food Techonol Biotechnol, 38, pp 113-119 21 Mota R M, Moreira J L, Souza M R, Horta M F, Teixeira S, Neumann E, Nicoli J and Nunes A C (2006) Genetic transformation of novel isolates of chicken Lactobacillus bearing probiotic features for expression of heterologous proteins: a tool to develop live oral vaccines, BMC Biotechnology 2006, 6:2 doi:10.1186/1472-6750-6-2 22 Gilliland, S E, and D K Walker (1990) Factors to consider when selecting a culture of L acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypercholesterolemic effect in humans J Dairy Sci.73:905–909 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 43 Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Thuỷ - BQCB 54A 23 Lars Axelsson (2004) Lactic Axit Bacteria: Classification and Physiology, in: Lactic Axit Bacteria, Microbiological and Functional Aspects, 3rd edition, Seppo Salminen, Atte von Wright, Arthur Ouwehand, Marcel Dekker, Inc, New York, USA, 1-67 24 Lin W.H (2007) Different probiotic properties for Lactobacillus fermentum strains, isolated from swine and poultry; Anaerobe 13, 107–113 25 Khalil R, Mahrous H, Kamaly K, Frank J, El-Halafawy K and El Soda M (2007) Evaluation of the probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from faeces of breast-fed infants in Egypt, African Journal of Biotechnology Vol (7), pp 935-945, April 26 Suskovic J, Kos B, Matosic S and Besendorfer V (2000) The efect of bile salts on survival and morphology of a potential probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92, World Journal of Microbiology & Biotechnology 16: 673678 Tài liệu internet 27 Lê Thanh Huấn (2011) Phân lập, tuyển chọn đánh giá số đặc tính của số chủng Lactobacillus cá chim vây vàng Đồ án tốt nghiệp, trường đại học Nha Trang, http://luanvan.co/luan-van/phan-lap-tuyen-chon-va-danh-gia-tiem-nangprobiotic-cua-cac-chung-lactobacillus-phan-lap-tren-ca-chim-vay-vang17242/ Ngày truy cập 20/4/2013 28 Võ Thành Hưng Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm probiotic chăn nuôi Sachdientu.edu.vn http://sachdientu.edu.vn/home/Sach/Luan-van-tot-nghiep_Cong-nghe-sinhhoc/Tim-hieu-tinh-hinh-nghien-cuu san-xuat-va-ung-dung-probiotic-trongchan-nuoi/vn Ngày truy cập 21/04/2013 29 Nguyễn Trường Thạch Đồ án công nghệ-Vi khuẩn lactic .Ngày truy cập 10/05/2013 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 44 ... chủng vi khuẩn lactic có tiềm probiotic từ nem chua 1.2 Mục đích – Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Tuyển chọn số chủng vi khuẩn lactic có tiềm probiotic từ chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua nghiên. .. nem chua nghiên cứu trước 1.2.2 Yêu cầu - Hoạt hóa giữ giống chủng vi khuẩn lactic - Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có tiềm probiotic - Nghiên cứu số đặc điểm số chủng tuyển chọn Trường Đại... phẩm có vi sinh vật probiotic ưa chuộng Vi t Nam Chính vi c tuyển chọn chủng đạt tiêu chuẩn probiotic vô quan trọng lĩnh vực đời sống Vậy nên tiến hành nghiên cứu đề tài: Tuyển chọn nghiên cứu chủng