Nghiên cứu này tập trung phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp cellulase từ ruột cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella). Sử dụng môi trường tuyển chọn có chứa Carbomethyl cellulose (CMC), đã phân lập và cấy tách được 35 chủng vi khuẩn.
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2020.000106 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN TỪ RUỘT CÁ TRẮM CỎ (Ctenopharyngodon idella) CĨ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE Đồn Văn Thược*, Nguyễn Thị Ngọc Huyền Tóm tắt: Nghiên cứu tập trung phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả sinh tổng hợp cellulase từ ruột cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) Sử dụng mơi trường tuyển chọn có chứa Carbomethyl cellulose (CMC), phân lập cấy tách 35 chủng vi khuẩn Hai chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp cellulase cao tuyển chọn để nghiên cứu tiếp Hai chủng tuyển chọn vi khuẩn Gram dương, hình trực khuẩn có khả sinh tổng hợp cellulase cao sau 24-30 nuôi cấy điều kiện môi trường có chứa 2-2,5% CMC, pH trung tính, nhiệt độ 35 oC Ở điều kiện tối ưu này, hai chủng C1 C4 có hoạt tính endoglucanase (EG) cao 4,32 IU/mL 4,36 IU/mL, hoạt tính exoglucanase (CBH) cao 1,37 IU/mL 1,39 IU/mL Từ khóa: Ctenopharyngodon idella, Cá trắm cỏ, cellulase, vi khuẩn MỞ ĐẦU Cellulose hợp chất cao phân tử cấu tạo từ đơn phân D-glucose qua liên kết β - 1,4 - glucoside, có cơng thức cấu tạo (C6H10O5)n với n nằm khoảng 1.000 - 15.000 Hằng năm lượng lớn sinh khối cellulose (trên 7,5 x 1010 tấn) tạo thành chủ yếu từ trình quang hợp thục vật Cellulose thành phần tạo nên lớp thành tế bào thực vật, giúp mô thực vật có độ bền học tính đàn hồi (Jayasekara & Ratnayyaka, 2019) Cellulase nhóm gồm nhiều enzyme hoạt động để phân giải cellulose thành sản phẩm cuối phân tử glucose Phức hệ cellulase gồm loại enzyme endoglucanase (EG), exoglucanase (cellobiohydrolase CBH) β-glucosidases Cellulase ứng dụng nhiều lĩnh vực sống: nông nghiệp, công nghiệp sản xuất giấy, công nghiệp dệt, nhiên liệu sinh học, công nghiệp chế biến thực phẩm thức ăn cho động vật, công nghiệp rượu bia (Kuhat et al., 2018; Jayasekara & Ratnayyaka, 2019) Các chế phẩm cellulase thị trường chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật Cellulase sinh tổng hợp chủng nấm thuộc chi Aspergillus, Rhizopus, Tricoderma, Fusarium, Neutospora, Penicillium (Sajith et al., 2016), vi khuẩn thuộc chi Cellulomonas, Cellvibrio, Bacillus, Pseudomonas,… (Kuhat et al., 2018; Jayasekara & Ratnayyaka, 2019) Những động vật ăn cỏ ví dụ trâu bị, cá chép khơng có khả sinh tổng hợp cellulase nên chúng phải dựa vào hệ vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, nguyên sinh vật) đường tiêu hóa để tiêu thụ cellulose (Li et al., 2016) Nhiều vi khuẩn có khả sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội *Email: thuocdv@hnue.edu.vn PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 857 tổng hợp cellulase phân lập từ ruột cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) Saha et al., (2006) phân lập chủng vi khuẩn Bacillus megaterium (CI3) có khả sinh tổng hợp cellulase mạnh (35,8 IU/mL) Gần đây, Li et al., (2016) phân lập 499 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp cellulase từ ruột cá trắm cỏ Trong nghiên cứu này, phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn từ ruột cá trắm cỏ có khả sinh tổng hợp cellulase mạnh nhằm định hướng ứng dụng sản xuất thức ăn cho động vật Kết phân lập nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, nồng độ Carbomethyl cellulose (CMC) trình bày chi tiết báo VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu: Cá trắm cỏ thu mua chợ Thành phần môi trường sử dụng nghiên cứu Môi trường phân lập vi khuẩn (g/L): NaCl, 0,5; K2HPO4.3 H2O, 1; MgSO4.7H2O, 0,4 KH2PO4, 1; FeSO4.7H2O, 0,001; CaCl2.2H2O, 0,02; NH4Cl, 2; CMC, 10; thạch, 20; pH = 7,0 Môi trường giữ giống nghiên cứu (g/L): peptone: 5; cao thịt: 5; NaCl: 5; CMC:10; bổ sung thêm 20 g thạch môi trường đặc, pH = 7,0 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp phân lập mẫu Thu mẫu phân ruột cá trắm cỏ, cân g mẫu hòa mL dung dịch có chứa 0,9% NaCl dung dịch có độ pha lỗng 10-1, tiếp tục pha loãng dung dịch 0,9% NaCl để dung dịch có nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Dùng pipet hút 50 µl dịch nồng độ khác dàn lên đĩa thạch có chứa mơi trường phân lập ủ nhiệt độ 30 oC 48 Chọn khuẩn lạc to mọc riêng rẽ, cấy tách giữ giống môi trường giữ giống Các chủng vi khuẩn sau cấy chấm điểm mơi trường có chứa 1% CMC để đánh giá sơ lựa chọn chủng có khả sinh tổng hợp cellulase mạnh Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH) nguồn carbon đến khả sinh tổng hợp cellulase Nuôi chủng giống vi khuẩn tuyển chọn bình tam giác 100 mL có chứa 25 mL môi trường lỏng Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy (25, 30, 35, 40 oC), giá trị pH ban đầu khác (4,5 - 8,5, bước nhảy 0,5) nồng độ CMC nghiên cứu Sau 30 nuôi cấy tủ lắc có tốc độ 180 vịng/phút, li tâm thu dịch để xác định hoạt tính cellulase ngoại bào Dựa vào hoạt tính enzyme thu để xác định điều kiện nuôi cấy nguồn carbon phù hợp Phương pháp xác định hoạt tính enzyme BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 858 Xác định sơ hoạt tính cellulase phương pháp cấy chấm điểm Cấy chấm điểm chủng vi khuẩn đĩa thạch mơi trường có chứa 1% CMC, ủ nhiệt độ 30 oC 48 Sử dụng 1% congo đỏ để nhuộm giữ 30 phút, rửa lại nước muối M Hoạt tính enzyme xác định hiệu số D - d (D đường kính vịng phân giải, d đường kính khuẩn lạc) Xác định hoạt tính enzyme phương pháp định lượng đường khử Cơ chất CMC sử dụng để xác định hoạt tính endoglucanase bột giấy lọc sử dụng để đánh giá hoạt tính exoglucanase Hàm lượng đường khử tạo trình thủy phân cellulose định lượng phương pháp DNS (Miller, 1959), glucose sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn Dịch ni cấy (50 µL) trộn với 450 µL dung dịch chất 0,5% pha đệm acetate (pH = 5,5), ủ hỗn hợp phản ứng 50 oC Sau đó, 750 µL dung dịch có chứa % DNS thêm vào hỗn hợp phản ứng, tiếp tục ủ hỗn hợp 100 oC phút, để nguội đo mật độ quang (OD) bước sóng 540 nm Mẫu đối chứng chuẩn bị tương tự mẫu thí nghiệm bỏ qua bước ủ 50 oC xử lý với DNS để xác định lượng đường ban đầu khơng có hoạt động enzyme Đơn vị hoạt tính enzyme (IU/mL) tính lượng enzyme cần thiết để tạo 0,18 mg (ứng với µmol) đường khử glucose phút điều kiện thí nghiệm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase Từ mẫu phân lấy từ ruột cá trắm cỏ, tiến hành phân lập tuyển chọn 35 khuẩn lạc vi khuẩn to, mọc riêng rẽ cấy tách mơi trường giữ giống (kí hiệu từ C1 đến C35) Khả sinh tổng hợp cellulase 35 chủng vi khuẩn phân lập được kiểm tra phương pháp cấy chấm điểm mơi trường có chứa 1% CMC Bảng Hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn phân lập Chủng vi khuẩn C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 Đường kính vịng phân giải (D-d, cm) 1,5 0 1,3 0 0 0 1,0 0,8 Chủng vi khuẩn C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 Đường kính vịng phân giải (D-d, cm) 1,0 0,7 1,3 0,4 0,6 0,9 0,7 0,7 0,9 0 Chủng vi khuẩn C25 C26 C27 C28 C29 C30 C31 C32 C33 C34 C35 Đường kính vịng phân giải (D-d, cm) 0 0 0,5 0,5 0,6 0,8 1,0 Kết Bảng cho thấy có 18 chủng vi khuẩn tổng số 35 chủng tuyển chọn (chiếm 51,4%) có khả sinh tổng hợp cellulase Kết nghiên cứu PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 859 tương tự kết nghiên cứu Li et al., (2016), tác giả tuyển chọn 499 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp cellulase từ ruột cá trắm cỏ thấy nửa số chủng vi khuẩn phân lập có khả sinh tổng hợp cellulase Trong số 18 chủng có khả sinh cellulase, chúng tơi chọn chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng mạnh có đường kính vịng phân giải chất lớn cm: chủng C1 (1,5 cm) chủng C4 (1,3 cm) để thực nghiên cứu Khuẩn lạc chủng C1 khơng trịn, có màu trắng vàng, tế bào dạng trực khuẩn, Gram dương Khuẩn lạc chủng C4 có màu trắng sữa, nhày ướt, phồng giữa, tế bào hình trực khuẩn ngắn, Gram dương Ngoài khả sinh tổng hợp cellulase, chủng vi khuẩn cịn có khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào khác amylase (C1-1,6; C4-1,8) protease (C1-1,4; C4-1,3) Hai chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp số enzyme ngoại bào có ý nghĩa vơ quan trọng việc định hướng nghiên cứu chủng vào thực tiễn ví dụ sản xuất enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, sản xuất chế phẩm sinh học làm môi trường, xử lý rác thải hữu cơ, làm phân bón vi sinh,… 3.2 Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn Chúng tơi tiến hành thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn Mẫu lấy theo mốc thời gian bắt đầu 12 đến 33 với bước nhảy Kết trình bày Hình Hình Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến khả sinh tổng hợp endoglucanase (EG) exoglucanase (CBH) chủng vi khuẩn tuyển chọn Hoạt tính sinh tổng hợp cellulase chủng C1, C4 đạt giá trị cao thời điểm từ 24-30 ni cấy Trong đó, chủng C1 có hoạt tính enzyme cao thời điểm 30 nuôi cấy với endoglucanase 2,52 IU/mL exoglucanase 1,13 IU/mL; chủng C4 có hoạt tính endoglucanase cao IU/mL thời điểm 27 exoglucanase cao 1,05 IU/mL thời điểm 24 nuôi cấy Khi nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá trắm cỏ, Li et al (2009) thấy cần khoảng 5-7 ngày để chủng đạt nồng độ cellulase cực đại Tuy nhiên, chủng tuyển chọn nghiên cứu cần ngày, việc rút ngắn thời gian nghiên cứu giảm nhiều chi phí sản xuất 860 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 3.3 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp cellulase Kết nghiên cứu ảnh hưởng pH ban đầu khác đến khả sinh tổng hợp cellulase trình bày Hình Hoạt tính enzyme chủng vi khuẩn tuyển chọn tăng dần giá trị pH ban đầu môi trường nuôi cấy tăng lên Khi pH ban đầu môi trường nuôi cấy trung tính (6,5-7,5) hoạt tính enzyme cao Hoạt tính cellulase chủng C1 đạt giá trị cực đại pH ban đầu 7,5: endoglucanase 3,22 IU/mL exoglucanase 0,94 IU/mL Trong chủng C4 có hoạt tính enzyme cực đại (endoglucanase 3,14 IU/mL exoglucanase 1,13 IU/mL) pH ban đầu mơi trường ni cấy Hình Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase Bên cạnh giá trị pH, nhiệt độ yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến phát triển vi sinh vật Hai chủng vi khuẩn tuyển chọn nuôi môi trường có pH tối ưu (chủng C1 pH chủng C4 pH 7,5) nhiệt độ nuôi cấy khác (30 oC, 35 oC, 40 oC, 45 oC) Khả sinh tổng hợp cellulase chủng vi khuẩn nhiệt độ khác trình bày Hình Hai chủng vi khuẩn C1, C4 có khả sinh tổng hợp cellulase cao nuôi cấy nhiệt độ 30-35 oC, tốt nhiệt độ 35 oC Khi nhiệt độ môi trường ni cấy khoảng 40 oC hoạt tính cellulase giảm mạnh Sự thay đổi nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính endoglucanase mạnh so với hoạt tính exoglucanase Trong nghiên cứu gần Islam & Roy (2018), tác giả phân lập chủng vi khuẩn từ rỉ đường có khả sinh tổng hợp cellulase Trong số chủng vi khuẩn phân lập có chủng vi khuẩn Gram dương Paenibacillus sp C1 Bacillus sp C2 Islam & Roy nghiên cứu ảnh hưởng thời gian, nhiệt độ pH môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng phân lập Các PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 861 kết thu Islam Roy tương tự nghiên cứu này: pH thích hợp 7,0; nhiệt độ khoảng 35-40 oC thời gian ni cấy 24-30 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.5 Ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả sinh tổng hợp cellulase Trong nghiên cứu gần Islam & Roy (2018), tác giả nhận thấy CMC nguồn carbon có ảnh hưởng tốt đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn Trong nghiên cứu sử dụng 1% CMC môi trường phân lập nuôi cấy Tuy nhiên, hàm lượng CMC môi trường ni cấy ảnh hưởng nhiều đến khả sinh tổng hợp cellulase Do vậy, ảnh hưởng nồng độ CMC khác môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng C1 C4 nghiên cứu Hình Ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn Kết nghiên cứu Hình cho thấy nồng độ C tăng hoạt tính enzyme thu từ dịch ni cấy tăng Hoạt tính endoglucanase chủng nuôi cấy đạt giá trị cực đại nồng độ 2% CMC, chủng C1 4,32 IU/mL chủng C4 4,36 IU/mL Nồng độ 2,5% CMC thuận lợi cho khả sinh tổng hợp 862 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM exoglucanase: chủng C1 1,37 IU/mL cịn C4 1,39 IU/mL Hoạt tính cellulase có xu hướng giảm nồng độ CMC tăng cao Kết nghiên cứu cho thấy, CMC vừa nguồn dinh dưỡng, vừa chất cảm ứng trình sinh tổng hợp enzyme cellulase, nhiên nồng độ chất cảm ứng (CMC) tăng cao lại có xu hướng ức chế sinh tổng hợp cellulase KẾT LUẬN Chúng tiến hành phân lập cấy tách 35 chủng vi khuẩn từ mẫu phân ruột cá trắm cỏ Hai chủng vi khuẩn kí hiệu C1 C4 có khả sinh trưởng tổng hợp cellulase mạnh tuyển chọn nghiên cứu Hai chủng tuyển chọn có khả sinh tổng hợp enzyme cao sau 24 đến 30 nuôi cấy nhiệt độ 30-35 oC, pH từ 6,5-7,5 nồng độ CMC từ 2,0-2,5% TÀI LIỆU THAM KHẢO Islam R., Roy N., 2018 Screening, purification and characterization of cellulase from cellulase producing bacteria in molasses BMC Res Note., 11: 445 https://doi.org/10.1186/s13104018-3558-4 Jayasekara S., Ratnayake R., 2019 Microbial cellulases: an overview and applications In Pascual A R., (ed) Cellulose Intechopen DOI: http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.84531 Kuhad R C., Gupta R., Singh A., 2018 Microbial cellulases and their industrial applications Enzyme Res 2011:280696 doi: 10.4061/2011/280696 Li H., Wu S., Wirth S., Hao Y., Wang W., Zou H., Li W., Wang G., 2016 Diversity and activity of cellulolytic bacteria, isolated from the gut contents of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) (Valenciennes) fed on Sudan grass (Sorghum sudanense) or artificial feedstuffs Aquac Res., 47: 153-164 Li H., Zheng Z., Cong-xin X., Bo H., Chao-yuan W., Gang H., 2009 Isolation of celluloseproducing microbes from the intestine of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) Environ Biol Fish., 86: 131-135 Miller G L., 1959 Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars Anal Chem., 31: 426-428 Sajith S., Priji P., Sreedevi S., Benjamin S., 2016 An overview on fungal cellulases with an industrial perspective J Nutr Food Sci., 6: 461 doi:10.4172/2155-9600.1000461 Saha S., Roy R N., Sen S K., Ray A K., 2006 Characterization of cullulase-producing bacteria from the digestive tract of tilapia, Oreochromis mossambica (Peters) and grass carp, Ctenopharyngodon idella (valenciennes) Aquac Res., 37: 380-388 PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 863 ISOLATION AND SCREENING OF CELLULASE PRODUCING BACTERIA FROM THE INTESTINE OF GRASS CARP (Ctenopharyngodon idella) *Doan Van Thuoc*, Nguyen Thi Ngoc Huyen Abstract: Isolation and screening of cellulase producing bacteria in intestine of grass carp (Ctenopharyngodon idella) have been carried out using selective carboxymethylcellulose - agar (CMC-agar) medium Thirty five bacteria strains were collected from isolation medium Among the isolated strains, two strains C1 and C4 which exhibited high cellulolytic activity were selected for further studies The two strains are Gram positive, rod-shaped bacteria They showed high potentiality for maximum cellulase production at 35 oC, pH neutral, and after 24-30 h of cultivation in a medium containing 2-2.5% CMC The maximum endoglucanase activity of 4.32 and 4.36 IU/mL, and exoglucanase activity of 1.37 and 1.39 IU/mL were respectively obtained by strains C1 and C4 at the optimum culture conditions Keywords: Ctenopharyngodon idella, Bacteria, cellulase, grass carp Hanoi National University of Education *Email: thuocdv@hnue.edu.vn ... (CI3) có khả sinh tổng hợp cellulase mạnh (35,8 IU/mL) Gần đây, Li et al., (2016) phân lập 499 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp cellulase từ ruột cá trắm cỏ Trong nghiên cứu này, phân lập tuyển. .. lập tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase Từ mẫu phân lấy từ ruột cá trắm cỏ, tiến hành phân lập tuyển chọn 35 khuẩn lạc vi khuẩn to, mọc riêng rẽ cấy tách môi trường giữ giống (kí hiệu từ. .. thấy nửa số chủng vi khuẩn phân lập có khả sinh tổng hợp cellulase Trong số 18 chủng có khả sinh cellulase, chúng tơi chọn chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng mạnh có đường kính vịng phân giải chất