Bài viết Phân lập và thiết lập chất đối chiếu isoquercitrin nghiên cứu với mục tiêu nhằm phân lập và xây dựng chất chuẩn isoquercitrin từ lá trinh nữ hoàng cung (TNHC) để làm chất đối chiếu. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 PHÂN LẬP VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ISOQUERCITRIN Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Võ Ngọc Trái*, Hoàng Anh Việt*, Nguyễn Thị Phương Trang*, Võ Thị Bạch Huệ* TÓM TẮT Mục tiêu: Phân lập xây dựng chất chuẩn isoquercitrin từ Trinh nữ hoàng cung (TNHC) để làm chất đối chiếu Phương pháp: Isoquercitrin chiết xuất phân lập từ TNHC phương pháp chiết ngấm kiệt với dung môi cồn 70% Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel tẩm đệm pH 3-4 Độ tinh khiết, điểm chảy chất phân lập xác định sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) quét nhiệt vi sai Cấu trúc hợp chất tinh khiết xác định kỹ thuật phổ UV, IR, MS NMR Kết bàn luận: Qui trình phân lập isoquercitrin từ TNHC báo cáo độ tinh khiết isoquercitrin 98,14% (tính nguyên trạng) xác định HPLC Qui trình thiết lập chất đối chiếu thực theo hướng dẫn WHOvà ASEAN(3,5) Giá trị ấn định, độ lệch chuẩn, độ không đảm bảo đo chuẩn tính tốn theo hướng dẫn ISO 13528(2).Isoquercitrin đạt u cầu chất chuẩn sử dụng công tác kiểm tra đánh giá chất lượng nguyên liệu TNHC sản phẩm có nguồn gốc từ nguyên liệu Từ khóa: trinh nữ hồng cung, flavonoid, isoquercitrin, chất đối chiếu, thiết lập, phân lập ABSTRACT ISOLATION AND ESTABLISHMENT OF THE REFERENCE STANDARD FOR ISOQUERCITRINE FROM THE LEAVES OF CRINUM LATIFOLIUM L Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Ngoc Trac, Hoang Anh Viet, Nguyen Thi Phương Trang, Vo Thi Bach Hue * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No - 2013: 150 - 156 Objectives: Isolation and establishment of the reference standard (RS) for isoquercitrine from the leaves of Crinum latifolium L (Amaryllidaceae) Methods: The total flavonoid from the leaves of Crinum latifolium L was extracted by percolation extraction with 70% ethanol The total extracts were separated by CC on buffer-coated sillica gel at pH 3-4 The structure of pure compound was identified by UV, IR, MS and NMR spectrometry Thepurity,meltingpointof isolated compound were determined by HPLC and DSC, respectively Results and Conclusions: A procedure for isolation of isoquercitrine from the leave of Crinum latifolium was reported The content of isolated compound was 98.14% by HPLC Establishment of the reference standard for isoquercitrine was carried out by general guidelines of WHO and ASEAN(3,5).The standard uncertainty, assigned value, standard deviation were calculated by ISO 13528(2) Isoquercitrine can be accepted as a RS for quality control of materials and products containing Crinum latifolium L Keywords:crinum latifolium L., flavonoid, isoquercitrin, reference standard, estabishment, isolation thuốc trung ương Viện kiểm nghiệm thuốc ĐẶT VẤN ĐỀ TpHCM chưa cung cấp isoequercitrin Isoquercitrin flavonoid phổ biến chất đối chiếu Trong thuốc có dược liệu hệ thống kiểm nguồn gốc từ dược liệu ngày nghiệm thuốc quốc gia Viện kiểm nghiệm ∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên hệ: DS Nguyễn Hữu Lạc Thủy ĐT: 0903838274 150 Email: nguyenhuulacthuy@yahoo.com Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 công ty dược người tiêu dùng quan tâm tính đặc biệt Các phương pháp phân tích phương pháp quang phổ, sắc ký, điện di cần có chất chuẩn để so sánh đánh giá mẫu thử Vì vậy, việc chiết xuất - thiết lập chất chuẩn từ dược liệu đạt yêu cầu chuẩn quốc gia cần thiết để đẩy mạnh việc tiêu chuẩn hóa, nâng cao chất lượng dược liệu chế phẩm từ dược liệu NGUYÊNLIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nguyên liệu – Trang thiết bị Lá TNHC (Crinum latifolium L.,) họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) thu hái tỉnh Bình Định vào tháng 4/2012năm 2012, định danh PGS Võ Thị Bạch Huệ - Khoa Dược, Đại học Y Dược TpHCM Lá rửa sạch, phơi khô, xay đạt yêu cầu chiết xuất bảo quản túi nhựa chống ẩm trước thử nghiệm, độ ẩm khoảng 12% Các chất phân lập bằng sắc ký cột dùng chất hấp phụ sillicagel pha thường cỡ hạt 0,040,063 mm (Merck) có tẩm đệm pH 3-4 Độ tinh khiết xác định hệ thống HPLC Alliance 2695-2996 thiết bị DSC Q20.Các phổ khối thực máy LCMS hiệu Micro Quattro API ESCi Multi-mode Ionization (Micromass) Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM500 FTNMR Spectrometer (Viện hóa học Cơng nghệ Việt nam).Tủ đóng ống Labconco Protector Glove Box (Viện KN thuốc TPHCM) Phương pháp nghiên cứu Chiếtxuất,phânlập,tinhchế Isoquercitrin phân lập từ cao polyphenol toàn phần chiết từ TNHC.Các kỹ thuật sử dụng sắc ký cột, thay đổi dung môi, kết tinh lại để đạt độ tinh khiết cao Xác định độ tinh khiết, xây dựng liệu chuẩn Chất phân lập kiểm tra độ tinh khiết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, Chuyên Đề Dược Học Nghiên cứu Y học quét nhiệt vi sai Bộ liệu chuẩn xây dựng gồm: điểm chảy, phổ UV, IR, MS, 13C-NMR 1H-NMR Thiết lập phân tích đánh giá chất chuẩn Đóng gói, đánh giá độ đồng lơ đánh giá liên phòng thí nghiệm.Các phòng thí nghiệm chọn đánh giá phải đạt GLP ISO Đánh giáđồng lô: lọ lấy ngẫu nhiên, số lọ cần N + lọ, N tổng số lọ đóng Mẫu xác định hàm lượng phương pháp HPLC, lọ kiểm tra lần Đánh giáđộ đồng liên phòng thí nghiệm: thành phẩm sau đạt yêu cầu đánh giá đồng lơ tiếp tục đánh giá đồng liên phòng thí nghiệm độc lập Mẫu đánh giá phòng thí nghiệm độc lập đạt ISO/IEC 17025 GLP Mỗi phòng thí nghiệm nhận lọ ngẫu nhiên qui trình đánh giá Kết đánh giá đồng tính phương pháp thống kê phân tích phương sai yếu tố ANOVA Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo giá trị công bố phiếu kiểm nghiệm Xác định giá trị tái lập phương pháp phân tích PTN phương pháp thống kê phân tích phương sai yếu tố ANOVA Khi giá trị tái lập đạt yêu cầu, tiến hành xác định giá trị ấn định x*(n), độ lệch chuẩn thực s*(n), độ không đảm bảo đo giá trị công bố chứng theo hướng dẫn ISO 13528(2) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chiết xuất cao toàn phần phương pháp ngấm kiệt Dược liệu sau chiết SFE làm ẩm chiết ngấm kiệt với dung môi cồn 70% Dịch chiết cồn loại tạp thu hồi dung môi đến 1/3 thể tích Dịch chiết sau acid hóa 151 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 acid hydrocloric 1% đến pH khoảng - Dịch acid chiết với ethylacetat đến dịch chiết khơng phản ứng polyphenol Dịch ethyl acetat thu hồi dung môi đến cao (cao polyphenol) Phân lập, tinh chế xác định cấu trúc: Tách phân đoạn từ cao polyphenol toàn phần sắc ký cột với điều kiện: cột thủy tinh kích thước x 30 (cm), silicagel có tẩm đệm pH 3-4, mẫu phân tích: 50 g cao polyphenol tồn phần, dung môi khai triển: n-hexan, ether dầu hỏa, cloroform, ethyl acetat, aceton với độ phân cực tăng dần Thể tích phân đoạn: 500 ml Thu 10 phân đoạn đặt tên P1 đến P10 Phân đoạn PL-10 (1200 mg) có thành phần giàu isoquercitrin thể sắc ký lớp mỏng Do phân đoạn sử dụng để phân lập, tinh chế isoquercitrin Kết tinh từ phân đoạn PL-10 hoà tan cloroform, để kết tinh lại nhiệt độ khoảng 25 0C 24 Lọc kết tinh qua phễu thủy tinh xốp Sau rửa ether ethylic kết tinh lại ethyl acetat, thu 900 mg chất kết tinh có màu vàng, đặt tên PL-10 Dữ liệu phổ NMR cho kết luận PL-10 isoquercitrin Kiểm tra độ tinh khiết nhiệt độ nóng chảy PL-10 Phương pháp quét nhiệt vi sai Độ tinh khiết nhiệt độ nóng chảy chất phân lập kiểm tra thiết bị DSC Q20 Isoquercitrincó nhiệt độ nóng chảy 2260C sơ đánh giá độ tinh khiết 98,51% Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Qui trình thẩm định theo hướng dẫn ICH (2005), kết nằm giới hạn cho phép Điều kiện triển khai HPLC: cột C8; (250 x 4,6) mm; đầu dò PDA, bước sóng phát 256 nm; nhiệt độ cột: 40 0C; pha động: acetonitril-acid phosphoric pH (25: 75) Mẫu thử: pha kết tinh pha động có nồng độ 100 µg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm Tính phù hợp hệ thống: với điều kiện sắc ký lựa chọn Kết tính qua lần tiêm liên tiếp Hệ thống sắc ký đạt yêu cầu với độ lệch chuẩn không 2%, hệ số đối xứng không 1,5 Độ phân giải so với pic tạp lân cận lớn 1,5 Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 2: Sắc ký đồ isoquercitrin 152 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Hình 3:Sắc ký đồ xác định tạp chất isoquecitrin Hình 4: Phổ UV isoquercitrin Kết quả: độ tinh khiết sắc ký isoquercitrin 98,14% tính tổng diện tích pic chế phẩm nguyên trạng Xây dựng liệu chuẩn Tính chất Quan sát cảm quan, isoquercitrin chất kết tinh màu vàng Điểm chảy Xác định phương pháp quét nhiệt vi sai 227,94 ± 0C Phổ UV Pha dung dịch isoquercitrin nồng độ 100 µg/ml methanol Quét phổ UV vùng bước sóng từ 200 đến 800 nm, mẫu thử có cực đại hấp thụ 255 355 (nm) Phổ IR Các dao động isoquercitrin gồm 3219, 1662,5 1060,8 (cm-1) Phổ MS Chất kết tinh isoquercitrin có đỉnh(M+Na)+ = (M+23)+ = 487,33 => M= 464,33 Chuyên Đề Dược Học Phổ NMR Kết phân tích cộng hưởng từ hạt nhân cho liệu phổ trình bày Bảng khẳng định cấu trúc PL-10 isoquercitrin, công thức phân tử C21H20O12 (M = 464) so sánh với liệu phổ tài liệu(1) Bảng 1: Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) 13CNMR (125 MHz)/DMSO PL-10 isoquercitrin1H-NMR 13C NMR (DMSO-d6, 300 MHz) (1) Isoquercitrin PL-10 C DEPT >C= >C= >C= >C= -CH= >C= -CH= 93,5 6,38; d 93,5 6,40; d 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ >C= >C= >C= -CH= >C= >C= -CH= 156,1 103,9 121,0 116,1 144,6 148,3 115,1 7,56; br 6,83; d 156,2 103,9 121,1 116,2 144,8 148,4 115,2 7,58; d 6,84; d δC (ppm) 156,0 133,2 177,2 161,0 98,6 164,0 δH (ppm; δC (ppm) δH (ppm;m) m) 156,3 133,3 177,4 161,2 6,18; d 98,6 6,20; d 164,1 - 153 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học (1) Isoquercitrin C DEPT 6’ 1” 2” 3” 4” 5” -CH= >CH>CH>CH>CH>CH- 121,5 100,8 74,1 76,5 70,0 77,5 6” -CH2- 61,0 δC (ppm) PL-10 δH (ppm; δC (ppm) δH (ppm;m) m) 7,58; d 121,5 7,57; dd 5,45; d 100,9 5,46; d 74,1 3,16; m 76,5 3,24; m 69,9 3,08; m 77,5 3,08; m 3,56; d - 3,32; 62,0 m Đánh giáđồng liên phòng thí nghiệm Các ống chuẩn gởi đánh giá Khoa thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu, Khoa Vật lý đo lường thuộc Viện kiểm nghiệm thuốc TpHCM Phòng vật lý đo lường, Trung tâm kiểm nghiệm thuốc Vĩnh Long Mỗi phòng thí nghiệm nhận lọ chất đối chiếu qui trình đánh giá Kết đánh giá từ phòng thí nghiệm đánh giá phân tích ANOVA yếu tố: Hình 5: Cấu trúc hóa học isoquercitrin Đóng gói vàđánh giáđộ đồng Đóng gói: việc đóng gói thực Glove-box (mơi trường khí trơ N2 99,99%, độ ẩm tương đối 10%) Chất phân lập đóng lọ thuỷ tinh nâu, nút có lớp đệm teflon bảo quản điều kiện nhiệt độ ổn định 2-8 0C Khối lượng isoquercitrin đóng lọ mg Số lọ đóng 100 lọ Đánh giáđồng lô:số lọ đánh giá N = 100 + = 11 lọ Bảng 2: Kết đánh giá đồng lô Số thứtự Độ tinh khiết sắc Mẫu thử Độ tinh khiết sắc mẫu ký isoquercitrin ký isoquercitrin (%) (%) Lần Lần Lần Lần 98,01 98,03 98,13 98,17 98,06 98,08 98,14 98,08 98,07 98,15 98,17 98,12 98,09 98,16 10 98,13 98,15 98,10 98,07 11 98,13 98,15 98,11 98,08 Loại giá trị bất thường trắc nghiệm Dixon: khơng có giá trị bất thường.Phân tích phương sai yếu tố ANOVA: Ftn = 1,659< Ftc = 3,020.Như vậy, điều kiện đóng gói ổn định, lọ đồng trình đóng gói 154 Ftn=2,445≤ Flt=3,682 độ tinh khiết sắc ký khơng phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá Bảng 3: Kết đánh giá độ đồng liên phòng thí nghiệm Độ tinh khiết sắc ký (%) PTN1 PTN2 PTN3 98,16 98,15 98,15 98,15 98,15 98,18 98,14 98,09 98,09 98,16 98,07 98,08 98,16 98,11 98,18 98,15 98,11 98,16 Số thứ tự mẫu Bảng 4:Kết xác định giá trị ấn định độ tinh khiết sắc ký isoquercitrin Chu kỳ δ - 0,022 0,012 0,012 x*-δ - 98,13 98,12 98,12 x*+δ - 98,17 98,17 98,17 Trung bình 98,14 98,15 98,15 98,15 SD 0,034 0,016 0,016 0,016 x* 98,15 98,15 98,15 98,15 s* 0,015 0,018 0,018 0,018 Theo hướng dẫn ISO 13528, từ 18 kết trên, chất đối chiếu isoquercitrin xác định giá trị ấn định 98,16% với độ lệch chuẩn 0,018, độ không đảm bảo đo 0,005 giá trị công bố chất đối chiếu isoquercitrin có độ tinh khiết sắc ký 98,16% tính chế phẩm nguyên trạng Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Hình 6: Nhiệt đồ mẫu isoquercitrin Hình 7: Phổ MS isoquercitrin Hình 8:Phổ1H-NMR (500 MHz) Chuyên Đề Dược Học 155 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Hình 9: Phổ 13C-NMR (125 MHz)/DMSO isoquercitrin KẾT LUẬN Chúng xây dựng liệu chuẩn isoquercitrin thiết lập 100 lọ chất đối chiếu Mỗi lọ chứa mg isoquercitrin có độ tinh khiết sắc ký 98,16% theo chế phẩm nguyên trạng Chất đối chiếu bảo quản theo dõi độ ổn định theo chu kỳ 6, 9, 12, 24, 36 tháng TÀI LIỆU THAM KHẢO 156 Deepralard K et al (2009), “Flavonoidglycosidesfromtheleavesof Uvaria rufawithadvancedglycationend-productsinhibitoryactivity”, Thai J.Pharm Sci.,33, pp.84-90 International Organisation for Standardization 13528 (2005)Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons Committee on Asean reference substances (2005), Guidelines for the establishment, handling, storage and use of Asean reference substances, Thailand, pp.2-12 Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Phuong Trang (2011),“Isolation and identification of isoquercitrine from the leaves of Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”, Proceedingof the 7th Indochina conference on pharmaceutical sciences, pp 604-606 WHO (2006), General guidelines for the establishment, maintenance and distribution of chemical reference substances, the WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations met in Geneva from 16 to 20 October 2006, fortyfirst report, (WHO Technical Report Series, No 934, Annex 3), pp.59-82 Ngày nhận báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 21.12.2013 Ngày báo đăng: 10.03.2014 Chuyên Đề Dược Học ... MHz)/DMSO isoquercitrin KẾT LUẬN Chúng xây dựng liệu chuẩn isoquercitrin thiết lập 100 lọ chất đối chiếu Mỗi lọ chứa mg isoquercitrin có độ tinh khiết sắc ký 98,16% theo chế phẩm nguyên trạng Chất đối. .. Khoa thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu, Khoa Vật lý đo lường thuộc Viện kiểm nghiệm thuốc TpHCM Phòng vật lý đo lường, Trung tâm kiểm nghiệm thuốc Vĩnh Long Mỗi phòng thí nghiệm nhận lọ chất đối. .. ISO 13528, từ 18 kết trên, chất đối chiếu isoquercitrin xác định giá trị ấn định 98,16% với độ lệch chuẩn 0,018, độ không đảm bảo đo 0,005 giá trị công bố chất đối chiếu isoquercitrin có độ tinh