Bài viết đề cập đến các nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng phân giải pectin, với mục đích tìm ra được một số chủng có hoạt tính pectinase mạnh nhằm phát hiện nguồn gen để tạo cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng pectinase về sau.
TIỂU BAN TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PECTIN Phạm Thị Ngọc Lan, Ngô Thị Bảo Châu, Nguyễn Quỳnh Chi Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Pectinase nhóm enzyme thủy phân chất pectin, với sản phẩm tạo thành acid galacturonic, galactose, methanol, Đây nhóm enzyme sử dụng nhiều kỹ thuật sau amylase protease (Nguyễn Đức Lượng (2002)) Enzyme sử dụng nhiều công nghệ chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt sợi, xử lý nước thải, y học, nơng nghiệp Các lồi thuộc chi Aspergillus đặc biệt A niger, A awamori hay chi Penicillium P italicum, P digitatum ứng dụng nhiều sản xuất pectinase (Kashap et al (2001)) Trong khuôn khổ báo này, đề cập đến nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả phân giải pectin, với mục đích tìm số chủng có hoạt tính pectinase mạnh nhằm phát nguồn gen để tạo sở cho nghiên cứu ứng dụng pectinase sau I PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng nấm mốc có khả phân giải pectin phân lập từ nhiều loại trái cam sành (Citrus nobilis), cam Vinh (Citrus sinensis), quýt đường (Citrus reticulata Blanco) , bưởi da xanh (Citrus maxima), sung (Ficus racemosa),… thu thập tỉnh Thừa Thiên-Huế Phƣơng pháp nghiên cứu - Phương pháp phân lập đếm số lượng tế bào: sử dụng phương pháp Koch để phân lập nấm mốc mơi trường Czapek có bổ sung chất pectin Phân lập mẫu nồng độ, nồng độ phân lập đĩa Tiếp đến đĩa thạch phân lập đặt tủ ấm nhiệt độ 30oC ngày Sau đó, lấy đĩa thạch phân lập đếm số lượng tế bào nấm mốc phương pháp đếm gián tiếp thông qua số lượng khuẩn lạc mọc môi trường thạch đĩa (Phạm Thị Ngọc lan (2012)) - Sơ tuyển trực tiếp chủng nấm mốc có khả sinh pectinase: tiến hành cấy trực tiếp chủng môi trường thạch đĩa bổ sung nguồn carbon petin Cấy trực tiếp chủng nấm mốc lên đĩa thạch, đĩa chấm Đặt đĩa cấy vào tủ ấm nhiệt độ 30 0C Sau ngày lấy đĩa thạch cấy nấm mốc nhuộm Lugol - phút, loại bỏ phần thuốc nhuộm lại đĩa thạch Khả sinh tổng hợp enzyme pectinase đánh giá dựa vào hiệu số đường kính vịng phân giải pectin với đường kính khuẩn lạc - Sơ tuyển gián tiếp chủng nấm mốc có khả sinh pectinase: xác định đường kính vịng phân giải enzyme pectinase mơi trường thạch - chất pectin Cho enzyme tác dụng lên chất môi trường agar, chất bị phân giải, độ đục môi trường giảm, môi trường trở nên suốt, độ lớn phần môi trường suốt phản ánh hoạt tính enzyme Ni cấy lắc chủng nấm mốc môi trường Czapek - pectin dịch thể với lượng bào tử nấm mốc đưa vào bình thí nghiệm đồng ml dịch huyền phù/50 ml môi trường tốc độ lắc 120 rpm nhiệt độ phòng thời gian ngày Phần sinh khối nấm mốc sấy khô tuyệt đối để đánh giá khả sinh trưởng phát triển Phần dịch enzyme sử dụng để xác định hoạt tính pectinase phương pháp khuếch tán đĩa thạch - Xác định hoạt độ pectinase: để xác định hoạt độ xác ta tiến hành xác định hoạt độ chung (HĐC) hoạt độ riêng (HĐR) cách đo lượng đường khử mẫu, 1304 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ phương pháp acid picric định lượng protein theo phương pháp Bradford (Trần Thanh Phong cộng (2013)) HĐC HĐR tính theo cơng thức: Trong đó: X: nồng độ đường khử dung dịch mẫu (mg/mL), V: thể tích mẫu thí nghiệm (1 mL); t: thời gian phản ứng (30 phút), P: nồng độ enzyme mẫu (mg/mL) - Xác định số đặc điểm hình thái phân loại chủng nấm mốc: quan sát khuẩn lạc nấm mốc môi trường Czapek thạch đĩa Ni cấy kính để quan sát vi thể - Chẩn loại phân tử chủng nấm mốc: chủng nấm mốc có hoạt tính pectinase mạnh gửi định danh phương pháp sinh học phân tử phịng thí nghiệm sinh học phân tử, công ty TNHH Dịch vụ Thương mại Nam Khoa, thành phố Hồ Chí Minh Phương pháp dựa việc giải trình tự gen vùng ITS (internal transcribed spacer) sau trình tự so sánh với sở liệu trang web NCBI công cụ BLAST SEARCH (Sambrook J and Russell D.W (2001)) - Xử lý số liệu: thí nghiệm lặp lại ba lần, xử lí thống kê mơ tả (Microsoft Excel 2010) phân tích ANOVA (Duncan‟s test p