Phân lập vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzym llactete oxidase

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH MỤC LỤC SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các giống khác vi khuẩn lactic Bảng 2.1 Các test sinh hóa định danh vi khuẩn lactic 28 Bảng 3.1 Bảng kết khảo sát đại thể vi thể vi khuẩn lactic phân lập Bảng 3.2 Kết phản ứng màu định lượng LOX chủng LAB phá vỡ màng tế bào phương pháp Lysozym 45 Bảng 3.3 Bảng kết định lượng LOX chủng LAB chủng vi khuẩn LAB phá vỡ màng tế bào phương pháp Acetone-SDS 46 Bảng 3.4 Bảng kết định lượng enzym chủng LAB chủng vi khuẩn LAB phá vỡ màng tế bào phương pháp Lysozym Bảng 3.5 Kết định danh nhóm LAB lên men đồng hình nhóm A DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Đồ thị biểu diễn hoạt độ enzym sinh chủng LAB phá vỡ màng tế bào phương pháp Acetone-SDS Đồ thị 3.2 Đồ thị biểu diễn hoạt độ enzym sinh chủng LAB phá vỡ màng tế bào phương pháp Lysozym9 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ thí nghiệm6 SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Streptococcus Hình 1.2 Leuconostoc Hình 1.3 Lactococcus Hình 1.4 Enterococcus Hình 1.5 Pediococcus Hình 1.6 Lactobacillus Hình 1.7 Bifidobacterium Hình 1.8 Cấu trúc phân tử LOX từ A viridans Hình 1.9 Vị trí ion Zn hai tetramer L-lactate oxidase Hình 3.1 Các chủng vi khuẩn làm môi trường MRSA Hình 3.2 Hình thái vi thể số chủng LAB Hình 3.3 Phản ứng màu định tính LOX chủng LAB phá vỡ màng tế bào phương pháp Acetone-SDS 41 Hình 3.4 Phản ứng màu định tính LOX chủng LAB phá vỡ màng tế bào phương pháp Lysozyme Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc mơi trường HHD Hình 3.6 Hình dạng khuẩn lạc mơi trường MRSA 1% CaCO3 Hình 3.7 Hình dạng vi thể chủng vi khuẩn lactic Hình 3.8 Thử nghiệm catalase đối chứng Hình 3.9 Thử nghiệm oxidase đối chứng Hình 3.10 Định tính acid lactic thuốc thử Unphenment mẫu (+) Hình 3.11 Định tính acid lactic thuốc thử Unphenment mẫu (-) SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Bp base pair (cặp base) Cs cộng Dd dung dịch E coli Escherichia coli EMP Embden- Meyerhoff-Parnas Gram (-) Gram âm Gram (+) Gram dương HHD Môi trường Homofermentative heterofermentative KL Khuẩn lạc LAB Lactic acid bacteria LOX L-lactate oxidase MRS Môi trường deMan Rogosa and Sharpe MRSA Môi trường deMan Rogosa and Sharpe agar MT Môi trường OD Optical Density (mật độ quang) PP Pentose photphat TB Tế bào v/p Vòng/phút VK Vi khuẩn POD Peroxidase FMN flavin mononucleotide VEGF Vascular endothelial growth factor (yếu tố tăng trưởng nội mơ mạch máu SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH Lactate chất chuyển hóa hình thành từ q trình trao đổi chất kị khí glucose bắp Khi lượng lactate tạo đủ cao gây tượng nhiễm toan lactic (Kemp, 2005), bệnh lý liên quan đến cường lactate hay bệnh lý thiếu hụt oxy suy tim, suy hô hấp, suy thận, thiếu máu cấp, nhồi máu tim…Vì vậy, việc kiểm soát nồng độ lactate số sinh hóa đóng vai trò vơ quan trọng Sự tích lũy lactate thể nhiều lí khác q trình chuyển hóa acid pyruvate sinh q trình đường phân tế bào từ thức ăn, đặc biệt sản phẩm thực phẩm lên men (Carr, 2002) Trong năm gần đa số nghiên cứu lactate tập trung vào mối quan hệ lactate khối u Một nghiên cứu nhà khoa học Mỹ đến từ nhiều trường đại học phát lactate-chất tuần hồn tích tụ mơ máu, gây cứng cản trở trình trao đổi chất tác nhân khiến tế bào ung thư phát triển mạnh đẩy nhanh tốc độ di khối u ác tính thể người bệnh (Joanne cs, 2013) Trong nghiên cứu này, nhà nghiên cứu phần làm sáng tỏ vai trò lactate q trình hình thành mạch máu khối u, cách thức chất can thiệp vào hệ miễn dịch thể phản ứng với tế bào ung thư cách thức lactate hình thành mơi trường vi mơ có tính acid hay khu vực bên ngồi tế bào ung thư, đẩy nhanh tốc độ di khối u ác tính (Hirschhaeuser, 2011) Vì việc kiểm soát hàm lượng lactate quan trọng Trong diện oxy hòa tan, L-lactate oxidase xúc tác q trình oxy hóa L-lactate thành pyruvate tạo thành hydrogen peroxide (Haccoun cs, 2004) LOX nguyên liệu cảm biến sinh học dùng để phát định lượng lactate (Palmisano, 2000) L-lactate oxidase lần phát chủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae vào năm 1959 (Udaka cs, 1959) Enzym dùng để phát lactate máu bệnh nhân có bệnh lý liên quan đến việc thiếu hụt oxy xuất huyết cấp tính, nhồi máu tim, thiếu máu oxy cấp… (Biryukova cs, 2009) L-lactate oxidase tìm thấy nhiều vi SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH sinh vật chủng vi khuẩn thuộc loài Aerococcus viridans (Yorita cs, 1996), Pseudomomas sp (Gu cs, 2002) Ở chủng vi khuẩn lactic Streptococcus iniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (Seki cs, 2004), (Taniai cs, 2008), Lactococcus lactis subsp lactis, Lactococcus lactis subsp cremoris (Toda cs, 1998) Ngồi tìm thấy nấm men Yarrowia lipolytica (Biryukova cs, 2009) nấm mốc Goetrichum candidum (Kupletskaya cs, 2007), (Sztajer cs, 1996) Hiện giới, L-lactate oxidase tinh chế thương mại hóa cơng ty hóa chất Sigma, Genzym Diagnostic… dùng làm nguyên liệu cho cảm biến sinh học để phát kiểm soát hàm lượng lactate Tuy nhiên, Việt Nam có nghiên cứu L-lactate oxidase Chính vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh L-lactate oxidase”  Mục tiêu nghiên cứu: Sàng lọc chủng vi khuẩn lactic có khả sinh L-lactate oxidase  Nội dung thực hiện: − Phân lập chủng vi khuẩn lactic từ sản phẩm lên men truyền thống − Định tính khả sinh enzym L-lactate oxidase − Xác định hoạt tính enzym L-lactate oxidase − Định danh chủng phương pháp sinh hóa − SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH T ỔNG QUAN SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 1.1.1 Giới thiệu LAB (tên gọi chung nhóm vi khuẩn lactic) đóng vai trò quan trọng sức khoẻ người, sử dụng nhiều công nghiệp chế phẩm sinh học an toàn cho người (David, 2013) Nhóm vi khuẩn lactic vi khuẩn Gram dương, thường không di động, không sinh bào tử, phản ứng catalase âm tính, oxydase âm tính Những vi khuẩn khơng có khả sản xuất hợp chất cần thiết để tồn phát triển, chúng vi sinh vật khuyết dưỡng nhiều loại acid amin, base nucleotic, nhiều loại vitamin…, bình thường chúng khơng có cytochrome Vì vậy, chúng xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi gọi vi hiếu khí, vi khuẩn có khả lên men điều kiện vi hiếu khí kỵ khí (Kenneth, 1990) Nhóm vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố mơi trường như: pH, nhiệt độ tích lũy sản phẩm chuyển hóa Chúng đòi hỏi vitamin như: thimine, biotin, acid pantotemic, acid nicotinic acid amin Do đó, người ta thường ni cấy chủng vi khuẩn môi trường chứa lượng tương đối cao nấm men, nước chiết cà chua, nước chiết giá, cao thịt… (Kenneth, 1990) LAB có liên kết chặt chẽ với vi khuẩn có lợi niêm mạc ruột người động vật LAB bao gồm khoảng 20 chi chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pedicoccus Streptococcus chi điển hình (Marcel, 2005) 1.1.2 Phân loại Phân loại theo khóa phân loại Bergey’s (2001), vi khuẩn lactic xếp: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ I: Lactobacillaceae SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH Giống I: Lactobacillus Giống II: Pediococcus Họ II: Enterococceae Giống: Enterococcus Họ III: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Họ IV: Streptococcaceae Giống I: Streptococcus Giống II: Lactococcus Nhóm vi khuẩn đa dạng gồm nhiều giống khác Tế bào chúng có dạng hình cầu Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus hình que Lactobacillus Theo Kandler Welss (1986), nhóm vi khuẩn lactic bổ sung thêm vi khuẩn Bifidobacterium Ngoài dựa vào khả lên men người ta chia LAB thành hai nhóm LAB đồng hình LAB dị hình (Kenneth, 1990) SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH 36 Qianwei Chen, Tai Sun, Xuefen Song, QincuiRan, Chongsheng Yu, Jun Yang, Hua Feng, Leyong Yu, Dapeng Wei, (2017), “Flexible Electrochemical Biosensors based on Graphene nanowalls for the Realtime Measurement of Lactate”, IOPscience, pp 1361-6528 37 Rahman M.M (2010) Fabrication of L-lactate biosensor based on redox species mediated lactate oxidase using micro-device Int J Biol Med Res 1(3): 09-14 38 Rassaei L, Olthuis W, Tsujimura S., Sudhölter E J R., van den Berg A (2013) Lactate biosensors: current status and outlook Analytical and Bioanalytical Chemistry Online publication date 39 Sambrook, J, Fritsch, E F, Maniatis, T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition Cold Spring Harbor Press NY 18.4718.59 40 Seidman C E., Struhl K., Sheen J., Jessen T (1997) Current Protocols in MolecularBiology 1.8.1-1.8.10 41 Seki M, Iida K, Saito M, Nakayama H, Yoshida S (2004) “Hydrogen peroxide production in Streptococcus pyogenes: Involvement of lactate oxidase and coupling with aerobic utilization of lactate”, J Bacteriol 186(7):2046-2051 42 Sigma Aldrich, (1999) Enzymatic Assay of LACTATE OXIDASE, SSLACT02 43 Sonomoto K, Yokota A (editor) (2011) Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria: Current Progress in Advanced Research Caister Academic Press ISBN 978-1-904455-82-0 44 Stanley W C., Gertz E W., Wisneski J A., Morris D L., Neese R A., Brooks G A (1985) Systemic lactate kinetics during graded exercise in man Am J Physiol 249(6 Pt 1):E595-E602 45 Stekelenburg F.K., Kant-Muermans M.L.T (2001) Effects of sodium lactate and other additives in a cooked ham product on sensory quality and development of a strain of Lactobacillus curvatus and Listeria monocytogenes INT J F MIC 66(3):97-203 SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ 60 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH 46 Sztajer H, Wang W, Lundsford H, Stocker A (1996) “Purification and some properties of a novel microbial lactate oxidase”, Appl Microbiol Biotechnol 45:600-606 47 Taniai H, Iida K, Seki M, Saito M, Shiota S, Nakayama H, Yoshida S (2008) Concerted action of lactate oxidase and pyruvate oxidase in aerobic growth of Streptococcus pneumoniae: Role of lactate as an energy source J Bacteriol 190(10):3572-3579 48 Taurino I., Reiss R., Richter M., Fairhead M., Thöny-Meyer L., Giovanni D.M, Carrara S (2013) Comparative study of three lactate oxidases from Aerococcus viridans forbiosensing applications Electrochimica Acta 93:72–79 49 Toda A and Nishiya Y (1998) Gene cloning, purification, and characterization of a lactate oxidase from Lactococcus lactis subsp cremoris IFO3427 J Ferment Bioeng 85(5):507-510 50 Udaka S, Koukol J, and Vennesland B (1959) Lactic oxidase of pneumococcus J Bacteriol 78:714-725 51 Valenza F, Aletti G, Fossali T, Chevallard C, Sacconi F, Irace M, Gattioni L (2005) Lactate as a marker of energyfailurein critically ill patients: hypothesis Crit Care 9(6):588-593 52 Vaughan E E, Heilig H G, Ben-Amor K, de Vos W M (2005) “Diversity, vitality and activities of intestinal lactic acidbacteria and bifidobacteria assessed by molecular approaches”, FEMS Microbiol Rev, 29, pp 477490 53 Warburg O On the origin of cancer cells Science 1956;123:309–14 54 Yi-sheng Chen, Hui-chung Wu, Fujitoshi Yana, (2010) “Isolation and characteristics of lactic acid bacteria isolated from ripe mulberries in taiwan”, Gida brazilian journal of microbiology, Vol 41, 916-921 55 Yorita K, Aki K, Ohkuma-S T, Kokubo T, Misaki H, Massey V (1996) Conversion of L-lactate oxidase to a long chain -hydroxyacid oxidase by site-directed mutagenesis of alanine 95 to glycine J Biol Chem 271:28300-28305 Tài Liệu Internet SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ 61 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH Bifidobacterium Website: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bifidobacterium Biotransformation, Website: http://www.google.com.vn/#hl=vi&output=search&sclient=psyab&q=Chapter+One++2+1.1.+Introduction++Cholester Enterococcus, Website: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Enterococcus Lactic Acid Bacteria, Website: http://textbookofbacteriology.net/lactics.html Lactic acid, Website: http://en.wikipedia.org/wiki/Lactic_acid SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ 62 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH PHỤ LỤC MƠI TRƯỜNG-THUỐC THỬ Mơi trường  Mơi trường MRS agar Pepton 10 g Cao thịt 10 g Cao nấm men 5g Glucose 20 g K2HPO4 2g Natri acetate (CH3COONa) 5g MgSO4.7H2O 0,2 g MnSO4.4H2O 0,2 g Triammonium citrate ((NH4)3C6H5O7) 2g Tween 80 1ml Agar 20 g Nước cất đủ 1000ml Hấp khử trùng 121oC/15 phút  Môi trường HHD (homofermentative heterofermentative) Fructose 2,5 g Trypticase pepton 10 g Phytone pepton 1,5 g Casamino acid 3g KH2PO4 2,5 g Yeast extract 1g Tween 80 1ml Bromcresol green 20ml Agar 20 g Nước cất đủ 1000mL SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ 63 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH Hấp khử trùng 121oC/15 phút Chú ý:0,1g Bromcresol green pha lỗng 30ml dung dịch NaOH 0,01N  Mơi trường thủy phân arginine Pepton 5g Yeast extact 3g Glucose 1g Bromcresol purple 0.02 g Arginine 5g Nước cất đủ 1000ml Môi trường khử nitrat Nutrient 13 g KNO3 2g Nước cất 1000ml pH = 7.2  Môi trường gelatin Nutrient broth 13 g Gelatine 150 g Nước cất 1000ml pH = 7.2 Thuốc thử- thuốc nhuộm  Thuốc thử Unphenment Phenol 5% 10ml FeCl3 2ml Nước cất đủ 25ml Lưu ý: để thành phần thuốc thử phản ứng 15-20 phút trước đem định tính acid lactic Thuốc thử pha dùng ngày  Thuốc nhuộm crystal violet Dung dịch SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ 64 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH Crystal violet 0,4 g Cồn 96o 10ml Dung dịch Phenol 1g Nước cất đủ 100ml Lưu ý: trộn hai dung dịch lại với nhau, khuấy cho hòa tan đem lọc Thuốc nhuộm ln bảo quản chai màu tránh ánh sáng  Thuốc nhuộm lugol I2 1g KI2 2g Nước cất đủ 300ml  Thuốc nhuộm safranin O Safranin O (dung dịch 2% cồn 960) 0, 25 g Ethanol 10 g Nước cất đủ 90ml SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ 65 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Hình Hình dạng khuẩn lạc mơi trường MRSA 1% CaCO3 SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ 66 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH Hình 3.7 Hình dạng vi thể chủng vi khuẩn lactic Hình 3.8.Thử nghiệm catalase đối chứng Hình 3.9 Thử nghiệm oxidase đối chứng Hình 3.10 Định tính acid lactic thuốc thử Unphenment (+) SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ 67 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH Hình 3.11 Định tính acid lactic thuốc thử Unphenment (-) SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ 68 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ Kết xử lý thống kê Anova yếu tố khả sinh enzym LOX chủng vi khuẩn LAB phá vỡ màng tế bào phương pháp Lysozym Gía trị OD bước sóng 565nm SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ 69 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH Hoạt tính LOX chủng vi khuẩn LAB phá vỡ màng tế bào phương pháp Lysozym (U/ml) SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ 70 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH 71 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH Kết sử lý thống kê định tính LOX chủng vi khuẩn LAB phá vỡ màng tế bào phương pháp Acetone-SDS SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ 72 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH 73 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ GVHD: THS DƯƠNG NHẬT LINH 74 ... phẩm Vi khuẩn lactic có khả tạo hợp chất kháng khuẩn Trong đó, vi c sản sinh acid lactic acid acetic quan trọng Tuy nhiên số chủng vi khuẩn lactic biết đến vi c sản sinh phân tử có hoạt tính sinh. .. L-lactate oxidase Chính vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh L-lactate oxidase  Mục tiêu nghiên cứu: Sàng lọc chủng vi khuẩn lactic có khả sinh. .. BẢNG Bảng 1.1 Các giống khác vi khuẩn lactic Bảng 2.1 Các test sinh hóa định danh vi khuẩn lactic 28 Bảng 3.1 Bảng kết khảo sát đại thể vi thể vi khuẩn lactic phân lập Bảng 3.2 Kết phản ứng