Đồ án tốt nghiệp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM MỐC SINH AFLATOXIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực MSSV: 1311100092 : Nguyễn Trần Yến Tiên Lớp: 13DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu hướng dẫn Tiến sĩ Nguyễn Hồi Hương khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Những kết hồn tồn khơng chép từ nghiên cứu khoa học khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án hồn tồn trung thực Tơi xin chịu trách nhiệm tồn đồ án Tp.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Trần Yến Tiên Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành đồ án “Phân lập định danh vi khuẩn lactic có khả ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin” suốt trình học tập, rèn luyện trau dồi kiến thức Cũng khơng lần gặp khó khăn trắc trở nhờ hướng dẫn tận tình Cơ Nguyễn Hoài Hương em hoàn thành đồ án Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tận tình Cơ Nguyễn Hồi Hương Khoa Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Cơng nghệ TPHCM Chính nhờ Cơ truyền tải kiến thức kỹ để em đạt thành đồ án mà em thực hôm Chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc đến Thầy cô giảng viên Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM tạo điều kiện cho em tìm hiểu tài liệu để hồn thành đồ án tốt nghiệp thời gian quy định Dù hồn thành đồ án khó tránh khỏi sai sót định khả hiểu biết hạn hẹp thông tin tài liệu không khả quan để phục vụ trình thực đồ án Kính mong có góp ý hướng dẫn tận tình thầy để em học hỏi thêm kinh nghiệm, tích lũy cho q trình học tập rèn luyện chuẩn bị hành trang bước sang mơi trường làm việc sau Kính chúc Cơ Nguyễn Hồi Hương Thầy giảng viên, Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM sức khỏe, thành công may mắn Em xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Trần Yến Tiên Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU 10 Tính cấp thiết đề tài 10 Tình hình nghiên cứu 11 Mục tiêu nghiên cứu 12 Nội dung nghiên cứu 12 Phương pháp nghiên cứu .12 5.1 Phương pháp luận 12 5.2 Phương pháp xử lý số liệu 13 Kết cấu đồ án 13 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .14 1.1 Tổng quan nấm 14 1.1.1 Giới thiệu chung 14 1.1.2 Độc tố nấm 15 1.1.3 Tác hại nấm 17 1.1.4 Một số chủng nấm gây độc thực phẩm .18 1.1.5 Một số phương pháp khử nhiễm độc tố 19 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic .21 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 21 1.2.2 Phân loại .22 1.2.3 Đặc điểm hình thái vi khuẩn lactic 23 1.2.4 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 25 1.2.5 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 26 1.2.6 Quá trình trao đổi chất 28 1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men, trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic .31 1.2.8 Ứng dụng vi khuẩn lactic .32 Đồ án tốt nghiệp 1.2.9 Hoạt tính sinh học 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Địa điểm nghiên cứu .38 2.2 Thời gian thực .38 2.3 Vật liệu 38 2.3.1 Nguồn phân lập .38 2.3.2 Thiết bị dụng cụ 38 2.3.3 Hóa chất 38 2.3.4 Giống nấm 40 2.4 Phương pháp luận 40 2.5 Phương pháp thí nghiệm 43 2.5.1 Thu thập mẫu 43 2.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 43 2.5.3 Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hoá .45 2.6 Khảo sát khả tăng trưởng lên men lactic 49 2.7 Khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic phương pháp in vitro .49 2.7.1 Khảo sát khả đối kháng nấm trực phương pháp in vitro 49 2.7.2 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào 53 2.8 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic bảo quản hạt 55 2.8.1 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: 55 2.8.2 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: 57 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .60 3.1 Kết khảo sát hình thái, sinh lý, snh hoá .60 3.1.1 Thử nghiệm Catalase 61 3.1.2 Nhuộm Gram .62 3.1.3 Nhuộm bào tử 63 3.1.4 Khả lên men đường khả sinh khí 64 3.1.5 Thử nghiệm khả di động phương pháp thạch mềm .66 Đồ án tốt nghiệp 3.2 Khảo sát khả tăng trưởng lên men lactic 71 3.3 Khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic phương phap in vitro 73 3.3.1 Khảo sát khả kháng nấm trực tiếp chủng vi khuẩn lactic 73 3.3.2 Khả sinh enzyme ngoại bào 76 3.4 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: 78 3.5 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: 87 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .94 4.1 Kết luận 94 4.2 Kiến nghị 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 PHỤ LỤC Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales VK Vi khuẩn MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng chi vi khuẩn lactic 25 Bảng 1.2 Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) .34 Bảng 1.3 Các sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic có tính kháng sinh (Holzapfel cộng sự, 1995) 35 Bảng 1.4 Khả đối kháng sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB (Holzapfel cộng sự, 1995) 37 Bảng 2.1: Kí hiệu nguồn phân lập 43 Bảng 3.1: Bảng kí hiệu chủng vi khuẩn phân lập .61 Bảng 3.2 Trình bày hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào vi khuẩn phân lập 67 Bảng 3.3 Trình bày tóm tắt chủng phân lập có đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn lên men lactic 70 Bảng 3.4: Bảng xử lý số liệu khả sinh acid giá trị OD 11 chủng vi .71 khuẩn phân lập .71 Bảng 3.5: Phân nhóm chủng vi khuẩn lactic 72 Bảng 3.6 Thống kê số liệu phần trăm tỉ lệ ức chế 11 chủng vi khuẩn phân lập với chủng nấm mốc theo phương pháp cấy đường vi khuẩn 74 Bảng 3.7 Kết khả sinh enzyme chủng vi khuẩn 76 Bảng 3.8 Khả kháng nấm CĐP1 Canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng .78 Bảng 3.9 Khả kháng nấm CĐP2 Canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng .82 Bảng 3.10 Khả kháng nấm CĐP1 Canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng .87 Bảng 3.11 Khả kháng nấm CĐP2 Canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng .89 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.12 Thời gian bắt đầu xuất tơ nấm (ngày) 11 chủng vi khuẩn với mật độ cảm nhiễm 101bt/g đậu phộng 102bt/g đậu phộng 90 Bảng 3.13 So sánh khả tăng trưởng, lên men lactic, kháng nấm in vitro in vivo chủng vi khuẩn phân lập 91 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1: Một số vi khuẩn lactic điển hình 24 Hình 1.2 Sơ đồ đường lên men lactose vi khuẩn lactic .29 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập định danh sơ vi khuẩn lactic 42 Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu 44 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy đường vi khuẩn .50 Hình 2.4: Mơ tả cách đo đường kính vịng ức chế phương pháp vạch đường vi khuẩn 52 Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm khả sinh enzyme chủng LAB 53 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic 60 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic mơi trường có chứa chất thị 61 Hình 3.3: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính chủng vi khuẩn KC1A, Đối chứng âm nước cất, thử nghiệm dương tính Bacillus spp 62 Hình 3.4 Kết nhuộm gram chủng vi khuẩn: A Vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu tím B Vi khuẩn E.coli bắt màu hồng C Vi khuẩn phân lập 63 Hình 3.5 Kết nhuộm bào tử chủng vi khuẩn A Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử B Vi khuẩn E.coli không sinh bào tử C Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử 64 Hình 3.6 Thử nghiệm lên men đường Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường Ống 2: Vi khuẩn lên men đường có sinh khí Ống 3: Vi khuẩn lên men đường khơng sinh khí 65 Hình 3.7 Vi khuẩn lactic phân lập có khả lên men đường 66 Sau thử nghiệm lên men đường, thu kết cho thấy số 11 chủng phân lập có 10 chủng vi khuẩn lên men đồng hình, chủng cịn lại lên men dị hình Các chủng phân lập từ Kim chi lên men đồng hình sinh acid lactic, với chủng phân lập từ Nem chua có chủng lên men dị hình, ... 12 Đồ án tốt nghiệp - Tuyển choṇ chủng vi khuẩn phân lập kháng nấm in vitro chủng phân lập áp dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy đường vi khuẩn) - Tuyển choṇ chủng vi khuẩn phân lập. .. thông tin khoa học để thực đề tài ? ?Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin? ?? Loại vi khuẩn có khả kháng lại loại nấm mốc dùng chế biến bảo quản thực phẩm Đảm bảo thực... trưởng lên men lactic chủng phân lập - Khảo sát khả đối kháng nấm sinh aflatoxin in vitro - Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào cac chủng phân lập - Khảo sát khả kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo