phân lập và định danh vi khuẩn acetic từ giấm nuôi

TRƯỜNG KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC - CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thực tập chuyên ngành vi sinh PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN ACETIC TỪ GIẤM NUÔI NỘI DUNG CHÍNH I VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP II KẾT QUẢ III BIỆN LUẬN KẾT QUẢ Phương pháp - Tăng trưởng pH thấp, pH = 3,5 – 4,0 - Có khả sinh acid acetic (tan CaCO 3) Mục tiêu: Thu nhận vi - Sinh trưởng hiếu khí bắt buộc (catalase) khuẩn Acetic - Gram âm, trực khuẩn, tồn độc lập, kết chuỗi… Phân lập Định danh Mục tiêu: Định danh đến cấp độ giống (genus) vi - Dựa vùng trình tự 16S RNA - So sánh với ngân hàng liệu gen khuẩn Acetic thu nhận Phương pháp (pH thấp) Tăng sinh chọn lọc Tách chiết DNA (Khả sinh acid acetic) PCR Phân lập, làm Giữ giống (Test Catalase, nhuộm Gram) Test sinh hóa Định danh Chạy điện di Giải trình tự Thu mẫu ->Tăng sinh • Môi trường GE pH = 3,5 (K Matsushita (2016)) Thành phần Tỷ lệ D-glucose 1,0 % Pepton 0,3% Cao nấm men 0,2% Ethanol 99,8% 0,5% Thờm 200àL mu gim 5ml mơi trường pH 3,5 • Ni mơi trường xuất đục, có sinh khối ống nghiệm mang phân lập Phân lập Môi trường GECA Dùng cối nghiền sinh khối Vi khuẩn, dùng que cấy vòng vi khuẩn mơi trường GECA => ủ nhiệt độ phòng ngày xem kết Tỷ lệ D - glucose 5% Cao yeast extract 1% CaCO3 1% Ethanol 1% Agar 2% Phân lập  Chọn khuẩn lạc làm tan CaCO3 môi trường (môi trường từ đục trở nên suốt)  cấy ria làm môi trường GECA Ủ nhiệt độ phòng  Lặp lại nhiều lần có mẫu Vòng tan CaCO3 Giữ giống  Giữ giống môi trường GECA thạch nghiêng Ủ nhiệt độ phòng cho lên sinh khối (Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng, 2007)  Cứ khoảng 10 ngày ta cấy chuyền giữ giống lại lần Nḥm gram  Nhuộm Gram xác định • Gram âm • Quan sát hình dạng  Các mẫu nhuộm gram cần lấy độ tuổi 18h – 24h để có giống trẻ, khỏe  Đối chứng: Bacillus subtilis Nhuộm gram Phương pháp nhuộm Gram ( Tài liệu Thực tập Vi Sinh sở) Dàn tiêu cố định tiêu Nhuộm tím kết Nhuộm thêm Rửa cồn 90 độ, Nhuộm Safranin Thấm nhẹ cho tinh phút, rửa lugol phút, rửa 30 giây, rửa phút, rửa nước, khô mẫu quan nước nước nước để khô sát 10 KẾT QUẢ NHUỘM GRAM C4B4.2 Gram âm, hình que Kích thước: 0,5 – µm x µm => Nghi ngờ chủng acetic 33 KẾT QUẢ NHUỘM GRAM C4B4.4 Gram âm, hình que Kích thước: 0,5 – µm x µm => Nghi ngờ chủng acetic 34 KẾT QUẢ NHUỘM GRAM C4B4.7 Gram âm, hình que Kích thước: 0,5 – µm x µm => Nghi ngờ chủng acetic 35 KẾT QUẢ NHUỘM GRAM C4B5.3 Gram âm, hình que Kích thước: 0,5 – µm x 2-3 µm => Nghi ngờ chủng acetic 36 KẾT QUẢ NHUỘM GRAM C4B5.6 Khuẩn lạc đống cục, tròn, gram âm => Có khả khơng phải chủng acetic 37 THANG SO SÁNH ❖ Thang dùng để so sánh thang HyperLadder 1kb hãng Bioline 38 ĐỊNH DANH BẰNG PP SINH HỌC PHÂN TỬ Kết điện di gel AGAROSE 0.8% ĐLM24a ĐLM26a -1 -2 -1 -2 39 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ ➢ Mở file LG1TN01-27F.ab1 vào phần mềm BioEdit ➢ Chỉ lấy nucleotide từ vị trí 40 – 670 ➢ Copy nucleotide từ vị trí 40 - 670 qua Text Document ➢ So sánh đoạn gen có kích thước khoảng 630 bp vùng 16S rDNA với trang web NCBI (Mỹ) để tìm vùng trình tự tương đồng 40 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ 41 KẾT QUẢ GIÃI TRÌNH TỰ 42 KẾT QUẢ DỊ TÌM NCBI 43 KẾT LUẬN • Khuẩn lạc có vòng tan CaCO3 → Vi khuẩn có khả sinh acid • Nhuộm gram bắt màu hồng → gram âm • Test catalase dương tính → có ezyme catalase (hiếu khí) • Sinh trưởng phát triển mơi trường pH 3.5 • Quan sát hình dạng → hình que => Đã phân lập thu nhận mẫu nghi ngờ vi khuẩn sinh acid acetic từ giấm ăn, thuộc họ Acetobacteraceae 44 Tài liệu tham khảo Lương Đức Phẩm Công nghệ vi sinh vật Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội, 1998 Giáo trình Vi sinh vật học đại cương Trường ĐH Công nghiệp Tp.HCM 2008 Food Microbiology Martin R Adams and Maurice O Moss; University of Surrey, Guildford, UK Vi sinh thực phẩm Trường DDH Công Nghiệp Tp.HCM Tháng năm 2004 Trần Linh Thước, 2005 Phân lập Acetobacter có khả sinh acid acetic hiệu suất cao từ giấm nuôi Đề tài nghiên cứu cấp trường, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Nguyễn Hữu Hiệp, 2012 Khảo sát vùng gen 16S rDNA số dòng vi khuẩn có khả cố định đạm đất vùng rễ lúa tỉnh Đồng Tháp Tạp chí khoa học Trường Đại học cần Thơ số 23A, trang 184- 192 Ilkin Yucel Sengun Seniz Karabiyikli (2010) Importance of acetic acid bacteria in food industry, Food Control 22 (2011) 647-656 Yuzo Yamada, Pattaraporn Yukphan (2007) Genera and species in acetic acid bacteria, International Journal of Food Microbiology 125 (2008) 15–24 Nguyễn Thị Thùy Dương (2014) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái có múi, Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành vi sinh vật học, Trường đại học Cần Thơ Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 45 Tài liệu tham khảo Adams, M.R and Moss, M.O (2000), Food microbiology, 2nd ed Bergey, D.H., Krieg, N.R and Holt, J.G (1984), Bergey’s manual of systematic bacteriology, Williams & Wilkins, Baltimore, MD 10 Cleenwerck, I and De Vos, P (2008), “Polyphasic taxonomy of acetic acid bacteria: An overview of the currently applied methodology”, International Journal of Food Microbiology, 125(1), 2–14 11 Gullo, M and Giudici, P (2008), “Acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar: Phenotypic traits relevant for starter cultures selection”, International Journal of Food Microbiology, 125(1), 46–53 12 Tài liệu thực tập vi sinh sở 13 Sách thực tập Sinh học phân tử 46 47 ... (catalase) khuẩn Acetic - Gram âm, trực khuẩn, tồn độc lập, kết chuỗi… Phân lập Định danh Mục tiêu: Định danh đến cấp độ giống (genus) vi - Dựa vùng trình tự 16S RNA - So sánh với ngân hàng liệu gen khuẩn. .. diện vi khuẩn làm tan CaCO3 20 KẾT QUẢ PHÂN LẬP Mẫu C4B4 sau ngày nuôi 21 KẾT QUẢ PHÂN LẬP Mẫu C4B5 sau ngày nuôi 22 KẾT QUẢ LÀM THUẦN • • Dùng que cấy vòng lấy sinh khối khuẩn lạc nghi ngờ đĩa phân. .. QUẢ PHÂN LẬP ➢ Tăng sinh mẫu giấm môi trường pH 3,5 • Thêm 200µL mẫu giấm 5ml mơi trường GE pH 3,5 • Ni nhiệt độ phòng sau 24h thấy có lớp màng ống nghiệm => Có diện vi khuẩn acetic 18 KẾT QUẢ PHÂN