Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học“phân lập và định danh vi khuẩn lactic lên men nem chuatỉnh đồng tháp và thành phố cần thơ”

Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nem chua là thực phẩm lên men truyền thống được sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm lưu truyền từ đời này sang đời khác của người Việt Nam. Tuy nem chua không phải là một món ăn đòi hỏi cần phải chế biến công phu, cầu kỳ và trang trí đẹp mắt, nhưng nó lại luôn là một món ăn được người dân yêu thích từ trước đến nay. Hay cũng có thể nói chính sự đơn giản trong khâu chế biến cùng với hương thơm và vị chua dễ chịu của nem chua đã mang lại lợi thế cho sản phẩm này. Quá trình chín của nem chua không qua phương pháp xử lí nhiệt, nên phần lớn các chất dinh dưỡng quí trong thịt như các acid amin hòa tan không bị mất đi. Hương thơm và vị chua đặc trưng của nem chua giúp cho người sử dụng có cảm giác dễ chịu khi ăn cũng như quá trình tiêu hóa được dễ dàng hơn. Từ trước đến nay, nem chua được chế biến theo phương pháp truyền thống nên không thể tránh khỏi những nhược điểm của phương pháp này. Đó là phụ thuộc vào hệ vi sinh vật có trong tự nhiên và có trong thịt, phụ thuộc vào điều kiện giết mổ, chất lượng thịt, môi trường bên ngoài, đặc biệt là nhiệt độ…Tất cả những yếu tố đó không thể khống chế được, gây ra sự mất ổn định chất lượng của sản phẩm, tăng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường hay khó kiểm soát được sự phát triển của các tạp khuẩn có trong thịt gây nguy hiểm cho sức khoẻ người tiêu dùng. Trong chiến lược công nghiệp hóa qui trình sản xuất sản phẩm truyền thống trên thị trường, việc tạo ra được một sản phẩm có chất lượng ổn định và mùi vị phù hợp với thị hiếu tiêu dùng của người Việt Nam là cần thiết. Đề tài: “Phân lập và định danh vi khuẩn lactic lên men nem chua tỉnh Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ” nhằm mục đích là chủ động được giống vi khuẩn cho sản xuất nem chua, từ đó làm cơ sở để tăng hương vị thơm ngon, tăng giá trị dinh dưỡng, rút ngắn thời gian sản xuất, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng, giúp sản phẩm được sản xuất với qui mô lớn, mang sản phẩm đến thị trường tiêu thụ rộng hơn. 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Phân lập vi khuẩn lactic từ nem chua Khảo sát khả năng sinh acid lactic từ đường glucose Định danh một số vi khuẩn lactic bằng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) và giải trình tự gen

Chương GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nem chua thực phẩm lên men truyền thống sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm lưu truyền từ đời sang đời khác người Việt Nam Tuy nem chua khơng phải ăn địi hỏi cần phải chế biến công phu, cầu kỳ trang trí đẹp mắt, lại ln ăn người dân yêu thích từ trước đến Hay nói đơn giản khâu chế biến với hương thơm vị chua dễ chịu nem chua mang lại lợi cho sản phẩm Q trình chín nem chua khơng qua phương pháp xử lí nhiệt, nên phần lớn chất dinh dưỡng quí thịt acid amin hịa tan khơng bị Hương thơm vị chua đặc trưng nem chua giúp cho người sử dụng có cảm giác dễ chịu ăn q trình tiêu hóa dễ dàng Từ trước đến nay, nem chua chế biến theo phương pháp truyền thống nên tránh khỏi nhược điểm phương pháp Đó phụ thuộc vào hệ vi sinh vật có tự nhiên có thịt, phụ thuộc vào điều kiện giết mổ, chất lượng thịt, mơi trường bên ngồi, đặc biệt nhiệt độ…Tất yếu tố khơng thể khống chế được, gây ổn định chất lượng sản phẩm, tăng nguy nhiễm vi sinh vật khơng mong muốn từ mơi trường hay khó kiểm sốt phát triển tạp khuẩn có thịt gây nguy hiểm cho sức khoẻ người tiêu dùng Trong chiến lược cơng nghiệp hóa qui trình sản xuất sản phẩm truyền thống thị trường, việc tạo sản phẩm có chất lượng ổn định mùi vị phù hợp với thị hiếu tiêu dùng người Việt Nam cần thiết Đề tài: “Phân lập định danh vi khuẩn lactic lên men nem chua tỉnh Đồng Tháp Thành phố Cần Thơ” nhằm mục đích chủ động giống vi khuẩn cho sản xuất nem chua, từ làm sở để tăng hương vị thơm ngon, tăng giá trị dinh dưỡng, rút ngắn thời gian sản xuất, đáp ứng nhu cầu ngày cao người tiêu dùng, giúp sản phẩm sản xuất với qui mô lớn, mang sản phẩm đến thị trường tiêu thụ rộng 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Phân lập vi khuẩn lactic từ nem chua - Khảo sát khả sinh acid lactic từ đường glucose - Định danh số vi khuẩn lactic phương pháp PCR (polymerase chain reaction) giải trình tự gen Chương LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Nem chua Nem chua sản phẩm lên men thịt tươi sản xuất tiêu thụ nhiều Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) Đây sản phẩm sản xuất hồn tồn thủ cơng, tùy theo kinh nghiệm vùng mà chất lượng khả bảo quản nem chua khác Bản chất lên men q trình chuyển hóa đường (cho thêm vào chế biến) thành acid lactic nhờ hoạt động vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus Micrococcus Trong nhiều đóng vai trò quan trọng Lactobacillus (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Việt Nam có nhiều vùng sản xuất nem tiếng mang nét đặc trưng vùng như: nem Vẽ (Từ Liêm, Hà Nội), nem Phủ Từ (Bắc Ninh), nem chua Đơng Ba (Huế), nem chua Chợ Huyện (Bình Định), nem chua Ninh Hòa (Khánh Hòa), nem Thủ Đức (Thành phố Hồ Chí Minh), Lai Vung (Đồng Tháp), Tân Hưng (Tiền Giang), (http://www.scribd.com/doc/3175604/-an-cong-ngh1-vi-khn-lactic1) Bảng Thành phần dinh dưỡng nem chua Thành phần dinh dưỡng Đơn vị 100 g ăn Năng lượng Kcalo 410 H2O g 68,0 Protein g 21,7 Glucid tổng số g 4,3 Lipid g 3,7 Canxi mg 24,0 Photpho mg 78,0 (Nguồn http://www.scribd.com/doc/3175604/-an-cong-ngh1-vi-khn-lactic1) 2.1.2 Hệ vi sinh vật thịt Thịt gia súc khỏe thường vi sinh vật, nhiên thịt bị nhiễm bẩn giết mổ, vận chuyển bảo quản Hai nguồn gây nhiễm vi sinh vật thịt quan nội tạng có bệnh viêm nhễm, đặc biệt vi sinh vật đường tiêu hóa vi sinh vật từ bên Vi sinh vật thường nhiễm nhiều bề mặt thịt phát triển làm cho số lượng tăng nhanh dần lên, đặc biệt miếng thịt giữ điều kiện nóng làm cho số lượng vi sinh vật tăng nhanh, gây cho thịt chóng bị hư hỏng Ở tìm thấy bào tử nấm mốc thuộc giống Mucor, Penicilium,… giống vi khuẩn Bacillus, Salmonella,… vi sinh vật phát triển thịt nhiệt độ lạnh có Achromobacter, Pseudomonas…Ngoài nấm men thấy phát triển thịt (Lương Đức Phẩm, 2002) Sau vi sinh vật phát triển thịt dần ngấm sâu vào bên làm hư hỏng thịt Quá trình ngấm phụ thuộc vào loại vi sinh vật vào điều kiện bên ẩm độ, nhiệt độ, kỹ thuật bảo quản, phương pháp chế biến… Vi khuẩn Salmonella điều kiện nhiệt độ bình thường sau 24-48 ngấm sâu vào thịt 14 cm; điều kiện, vi khuẩn hoại sinh ngấm từ 4-5 cm Ở nhiệt độ thấp, vi khuẩn ngấm cm tháng (Lương Đức Phẩm, 2002) 2.1.3 Thịt nạc Thịt nạc nguyên liệu để tạo nên sản phẩm nem chua Vì tính chất quan trọng nên thịt heo dùng để sản xuất nem chua cần phải lựa chọn kỹ, đạt yêu cầu thịt mổ (thịt nóng), khơng dùng thịt ơi, sẫm màu Ngun liệu làm nem phải dùng thịt nạc đùi sau thịt mơng, khơng rửa qua nước Thành phần hóa học thịt thay đổi tùy theo vị trí miếng thịt thể động vật, trọng lượng thể giống vật ni (http://www.scribd.com/doc/3175604/-an-cong-ngh1-vi-khn-lactic1 ) Bảng Thành phần hóa học thịt Loại thịt Thành phần hóa học (g/100 g) Nước Bị Lợn mỡ Lợn ½ nạc Lợn nạc 70,5 47,5 60,9 73 Protein Lipid 18 14,5 16,5 19 10,5 37,5 21,5 Khoáng Năng lượng (Cal) 0,7 1,1 171 406 268 143 Nguồn (http://giaoan.violet.vn/present/show/entry_id/240405) 2.1.4 Da heo Da heo có giá trị dinh dưỡng thấp thịt nạc Da heo cấu tạo từ protein colagen elastin Từ nguyên liệu da heo sau giết mổ, rửa sau đem luộc chín, tách mỡ cắt tạo hình Da heo xử lý đóng vai trị chất độn, chất kết dính phần tử mơ giúp định hình sản phẩm, làm tăng giá trị cảm quan nem chua, tăng độ giòn, Tỉ lệ lượng thịt nạc (heo) da heo dùng để sản xuất mẻ nem chua thường khoảng 3:7 (http://www.scribd.com/doc/3175604/-an-cong-ngh1-vi-khn-lactic1) 2.1.5 Các loại gia vị 2.1.5.1 Đường Đường sử dụng sản xuất nem chua ngồi tác dụng tạo hương vị, cịn chất cho trình lên men tạo acid Do có tính chất háo nước nên đường giúp trạng thái liên kết gel thịt thêm chặt chẽ Trong trình sản xuất nhiều loại đường khác sử dụng đường lactose, galactose, maltose, saccarose Quá trình sản xuất nem chua phía Nam sử dụng nhiều đường, từ 30%35% so với trọng lượng nguyên liệu chính, ngược lại lượng đường sử dụng tỉnh phía Bắc thường từ 10%-15% (http://www.scribd.com/doc/3175604/-ancong-ngh1-vi-khn-lactic1) 2.1.5.2 Muối Muối có tác dụng làm tăng vị sản phẩm, diệt khuẩn, hạn chế hoạt động vi sinh vật gây thối, tăng cường hoạt động vi khuẩn lactic nên tạo điều kiện lên men lactic sản phẩm có hương vị thơm ngon, muối nồng độ cao ức chế hoạt động nhiều loại vi sinh vật, kể vi khuẩn lactic Do điều chỉnh lượng acid lactic theo ý muốn cách khống chế nồng độ muối mức thích hợp (Nguyễn Văn Tiếp et al., 2003) 2.1.5.3 Tỏi Tỏi trồng khắp nơi giới, tỏi loại gia vị dùng để ướp, khử mùi hay tạo mùi cho ngun liệu Tỏi có vị cay, tính ơn, ngồi làm gia vị, thành phần khác tỏi có tác dụng kháng sinh mạnh Ngồi iode tinh dầu (100 kg tỏi chứa 60-200 g tinh dầu), thành phần chủ yếu tỏi chất kháng sinh alicin (C6H10OS2) hợp chất sulfur có tác dụng diệt khuẩn mạnh vi sinh vật Staphylococcus, Salmonella, Shigella… (http://www.scribd.com/doc/3175604/-an-cong-ngh1-vi-khn-lactic1) 2.1.5.4 Tiêu Tiêu loại gia vị thường sử dụng để tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm Thành phần hóa học tiêu gồm có tinh dầu hai loại ankaloid piperin chavicine Ngồi cịn số chất khác cellulose muối khống Tiêu có vai trị tạo vị cay, kháng vi khuẩn, kháng nấm mốc, kích thích tiêu hóa (http://www.scribd.com/doc/3175604/-an-cong-ngh1-vi-khn-lactic1) 2.1.5.5 Ớt Cũng tỏi, ớt loại gia vị tạo vị cay giúp tăng giá trị cảm quan cho thực phẩm Trong 100 g ớt có khoảng 91% nước, 1,3% protid, 5,7% glucid, 250 mg vitamin C, 10 mg caroten Lượng tinh dầu ớt chiếm tỷ lệ cao 12% gồm capsisina, casaicine (ankaloid) Ngồi ớt cịn có vitamin K số chất khoáng (http://www.scribd.com/doc/3175604/-an-cong-ngh1-vi-khn-lactic1) 2.2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC 2.2.1 Định nghĩa trình lên men lactic Lên men lactic q trình chuyển hóa sinh học kị khí chứa hợp chất đường thành acid lactic (chủ yếu) số sản phẩm khác (Nguyễn Thành Đạt, 2001) 2.2.2 Acid lactic Acid lactic sản phẩm trình lên men lactic vi khuẩn Lactobacillus, sản phẩm cuối q trình đường phân kị khí glucose Acid lactic chất lỏng không màu, không mùi; khối lượng riêng 1,24 g/cm 3; tnc = 18oC; ts = 119oC/12 mmHg, tan nước, etanol Acid lactic tồn hai dạng đồng phân quang học D-acid lactic L-acid lactic Công thức phân tử: C3H6O3 Công thức cấu tạo: CH3-CHOH-COOH (http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn/) 2.2.3 Vi khuẩn lactic Năm 1780, nhà bác học Thụy Điển Schaele lần tách acid lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1857, L Pasteur chứng minh sữa chua kết hoạt động nhóm vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn lactic Năm 1878, Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đặt tên Bacterium lactis, gọi Streptococcus lactis (Nguyễn Thành Đạt, 2001) 2.2.3.1 Đặc điểm chung Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu (hoặc hình ovan) hình que, kích thước 0,5-1,1 µm, đơi đến 1,6 µm, tạo khuẩn lạc nhỏ mm-5 mm, khuẩn lạc có đặc điểm bìa liền, lồi, nhẵn, sáng (Kandler Weiss, 1986) Tất vi khuẩn lactic không chuyển động, không sinh bào tử, Gram dương, kị khí khơng bắt buộc Các lồi vi khuẩn lactic có khả tạo thành acid lactic khác môi trường sức chịu acid (hay độ bền với acid) khác Đa số trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao (khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn phát triển pH khoảng 3,8-4 Hoạt lực lên men tốt trực khuẩn vùng pH khoảng 5,5-6 (Lương Đức Phẩm, 2002) Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích 35 oC, lồi ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40oC-45oC, ưa lạnh phát triển nhiệt độ tương đối thấp (5oC thấp hơn) Khi gia nhiệt tới 60 oC-80oC hầu hết chúng bị chết sau 1030 phút Trong tự nhiên vi khuẩn lactic thường gặp đất, khơng khí, nước chủ yếu thực vật sản phẩm thực phẩm (trên loại rau, quả, sữa, thịt ) (Lương Đức Phẩm, 2002) 2.2.3.2 Một số giống vi khuẩn lactic * Lactobacillus Vi khuẩn Lactobacillus Gram dương, kích thước 0,5-1,1µm đơi lên tới 1,6 µm, dạng trực khuẩn nhỏ, thường kết đơi chuỗi Nhiệt độ tối thích để Lactobacillus sinh trưởng 30°C-40°C pH từ 5,5-6,2 Lactobacillus phát triển điều kiện kị khí thiếu oxy Khuẩn lạc có dạng bìa liền, lồi, nhẵn, sáng (Kandler Weiss, 1986) Tùy vào điều kiện mơi trường sống, hình dạng vi khuẩn Lactobacillus thay đổi từ que ngắn đến que dài, xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ Lactobacillus chiếm phần lớn nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, chúng phổ biến thơng thường có lợi (Hồ Nhân, 2008) * Streptococcus Giống Streptococcus có dạng hình cầu hình ovan, đường kính tế bào 0,5-1 µm Sau phân chia chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi chuỗi ngắn Streptococcus thuộc dạng lên men lactic đồng hình, Gram dương, catalase âm tính, khơng sinh bào tử, khơng di động kỵ khí tùy ý (Nguyễn Đức Lượng, 2004) * Leuconostoc Giống Leuconostoc có đường kính từ 0,5-0,8 µm chiều dài khoảng 1,6 µm, số điều kiện chúng có dạng trịn, chiều dài khoảng 1,3 µm Sau phân chia Leuconostoc thường xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Leuconostoc thường vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc có nhu cầu cao dinh dưỡng Leuconostoc phát triển từ 20°C-30°C không phát triển 45°C Đó giống lây nhiễm thường xuyên thực phẩm gây rủi ro trình sản xuất sản phẩm đường, sản phẩm acid hay sản phẩm thực vật khác Leuconostoc có vai trị trình lên men malolactic rượu vang chúng cần thiết cho lên men vài loại phơmai Ngồi ra, Leuconostoc tham gia việc chế biến sản phẩm thức ăn gia súc lên men sản phẩm rau lên men (Roissart Luquet, 1994; Guiraud, et al., 1998) Leuconostoc thuộc nhóm lên men lactic dị hình, catalase âm tính Leuconostoc phát triển chậm, thường gây nên mơi trường có độ nhớt cao chúng tạo hợp chất thơm axetyle, axetole,…(Larpent et al., 1997) * Pediococcus Pediococcus có dạng tứ cầu song cầu Pediococcus cần nhu cầu dinh dưỡng cao hoạt tính thủy phân protein yếu Khuẩn lạc có màu vàng xanh, kích thước khuẩn lạc 1-3 mm, hình dạng khuẩn lạc trơn láng (Nguyễn Thành Đạt, 2001) Vi khuẩn lactic phân loại tùy theo hình thức lên men chúng, chúng chia làm hai loại gồm nhóm vi khuẩn lactic đồng hình nhóm vi khuẩn lactic dị hình * Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình Lactobacillus plantarum thường diện nước bọt đường tiêu hóa người Tên khác Lactobacillus plantarum Lactobacillus pentosus, Lactobacillus arabinosus (Robert, 1957) Lactobacillus plantarum vi khuẩn kị khí, ngẫu nhiên, trực khuẩn nhỏ, thường kết đôi chuỗi Nhiệt độ tối thích cho vi khuẩn sinh trưởng 30oC (Lương Đức Phẩm, 2002) Lactobacillus plantarum thường sử dụng q trình lên men thực phẩm (ví dụ số loại thực phẩm có chứa Lactobacillus plantarum yaourt, phơmai, kim chi, xúc xích, muối chua rau dưa ) (Lương Đức Phẩm, 2002) Lactobacillus plantarum làm tăng hoạt động trao đổi chất tế bào đường ruột, kích thích phản ứng miễn dịch (Nissen et al., 2009) Lactobacillus plantarum chứng minh có khả giảm cholesterol chủng riêng rẽ kết hợp với Lactobacillus paracasei phần ăn chuột (Hanaa et al., 2009) Ngồi ra, Lactobacillus plantarum cịn tạo bacteriocin ức chế tăng trưởng Lactobacillus casei, Lactobacillus sakei, Lactobacillus delbreckii subsp, Lactobacillus bulgaricus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus cloacae Pseudomonas aeruginosa (Todorov Dicks, 2005) Lactobacillus acitophilus trực khuẩn, Gram dương, có khả lên men loại đường glucose, fructose, galactose, manose, mantose Chúng hồn tồn khơng có khả lên men xylose, arabinose, glycerol manitol, sorbitol Trong trình lên men chúng tạo hai dạng đồng phân quang học acid lactic Nhiệt độ tối ưu để Lactobacillus acitophilus phát triển 45oC-50oC (Nguyễn Thành Đạt, 2001) Lactobacillus farciminis thường tìm thấy thực phẩm sản phẩm thịt, xúc xích Các nhà nghiên cứu chứng minh Lactobacillus làm giảm co thắt bụng tình trạng viêm ruột kết chuột, dùng điều trị phòng ngừa bệnh lý viêm mãn tính hay cấp tính ruột (www.international.inra.fr/ /mechanisms_of_action_of_the_probiotic_lacto) - Nhóm vi khuẩn lactic dị hình Lactobacillus brevis tìm thấy chủ yếu muối chua bắp cải, rau cải, dưa chuột nên gọi trực khuẩn bắp cải Trong lên men, acid lactic (1,2%) cịn tạo thành acid acetic, etanol (tới 2,4%), CO 2, cịn tạo hương làm cho sản phẩm có hương vị dễ chịu (Lương Đức Phẩm, 2002) Weissella paremesenteroides tìm thấy dưa chuột khả sinh bacteriocin DFR-8 ngăn chặn số lượng lớn mầm bệnh Listeria monocytogenes (Pal Ramana, 2010) 2.2.3.3 Ý nghĩa thực tế lên men lactic Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt công nghiệp chế biến sữa Các vi khuẩn có ý nghĩa lớn sản xuất sữa, phômai, việc muối chua rau ủ chua thức ăn chăn nuôi Những 10 Phụ lục 2.1.4 Ngày Analysis of Variance for OD - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 2.49364 12 0.207804 175.66 0.0000 RESIDUAL 0.030758 26 0.001183 -TOTAL (CORRECTED) 2.5244 38 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for OD by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -SX1 0.716333 X UT11 0.923667 X UT10 1.13433 X CP10 1.20933 X SX4 1.295 X CP1 1.30467 X CP4 1.31133 X TK2 1.344 X TK3 1.43133 X TK1 1.55033 X CP2 1.553 X TS8 1.589 X UT13 1.58967 X -Multifactor ANOVA - Acid tong Analysis of Variance for Acid tong - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 420.808 12 35.0673 33.53 0.0000 RESIDUAL 27.1944 26 1.04594 -TOTAL (CORRECTED) 448.002 38 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for Acid tong by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -UT11 8.1 X SX1 8.46 X UT10 10.2 XX SX4 11.4 X TK3 13.8 X CP4 15.36 XX CP1 15.66 XX TK2 15.78 XX TS8 16.2 XX CP10 16.44 XX CP2 16.62 XX TK1 17.04 XX UT13 18.36 X Phụ lục 2.1.5 Ngày Analysis of Variance for OD - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 2.47734 12 0.206445 11.79 0.0000 RESIDUAL 0.455261 26 0.0175101 -TOTAL (CORRECTED) 2.9326 38 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for OD by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -SX1 0.708333 X SX4 0.739333 XX UT11 0.921667 XXX CP10 1.03567 XXX TK1 1.12067 XXX UT10 1.20667 XXX TK3 1.274 XX CP1 1.27767 XX CP4 1.30367 XXX TK2 1.31967 XXX CP2 1.38367 XX UT13 1.41567 XX TS8 1.589 X -Multifactor ANOVA - Acid tong Analysis of Variance for Acid tong - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 493.881 12 41.1567 18.24 0.0000 RESIDUAL 58.6656 26 2.25637 -TOTAL (CORRECTED) 552.546 38 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for Acid tong by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -UT11 7.68 X SX1 8.16 X SX4 8.4 X TK1 9.78 XX UT10 9.9 XX TK3 12.3 XX CP1 13.14 XXX CP4 14.94 XXX CP10 15.24 XXXX TK2 15.78 XXX TS8 15.96 XXX CP2 17.04 XX UT13 18.48 X Phụ lục 2.2 Các dịng vi khuẩn hình cầu Phụ lục 2.2.1 Ngày Analysis of Variance for OD - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 16.2929 28 0.581889 314.24 0.0000 RESIDUAL 0.1074 58 0.00185172 -TOTAL (CORRECTED) 16.4003 86 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for OD by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -GT2 0.193333 X CH3 0.2 XX TS5 0.22 XXX CH1 0.256667 XXXX GT1 0.293333 XXX CH4 0.303333 XX TS7 0.31 XX TS4 0.35 X TS2 0.456667 X SX2 0.583333 X UT3 0.64 X UT4 0.75 X GT3 0.993333 X TV2 1.02667 XX TS3 1.07 XXX GT5 1.10333 XXX TV6 1.11 XXX UT6 1.11667 XXX GT6 1.14333 XXX UT7 1.15 XXX TV5 1.16 XXX UT9 1.18333 XXX UT5 1.19333 XXXX UT8 1.22333 XXXX TV4 1.25667 XXX GT4 1.28333 XX TV8 1.31333 X SX3 1.43 X UT12 1.59333 X -Multifactor ANOVA - Acid tong Analysis of Variance for Acid tong - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 1025.73 28 36.6333 71.32 0.0000 RESIDUAL 29.7916 58 0.513648 -TOTAL (CORRECTED) 1055.52 86 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for Acid tong by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -GT2 3.84 X CH3 4.5 XX CH4 4.98 XXX CH1 5.04 XXX GT1 5.16 XXX TS4 5.94 XXX TS7 6.0 XXX TS5 6.12 XX GT3 7.248 XX TV2 7.26 XX GT6 7.26 XX UT3 7.32 XX TV6 7.44 XXX UT7 7.86 XXX UT8 7.92 XXX UT5 8.16 XXX UT9 8.22 XXX TS2 8.34 XXX UT4 8.52 XXX SX2 8.52 XXX TV5 8.58 XXX GT5 8.94 XXX TV4 9.06 XX UT6 10.14 XX GT4 10.86 X TV8 14.7 X SX3 15.24 XX TS3 16.62 XX UT12 17.64 X Phụ lục 2.2.2 Ngày Analysis of Variance for OD - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 11.2872 28 0.403113 3.32 0.0001 RESIDUAL 7.0466 58 0.121493 -TOTAL (CORRECTED) 18.3338 86 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for OD by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -CH1 0.446667 X CH3 0.45 X SX2 0.753333 XX TS5 0.786667 XXX TS2 0.803333 XXX TS7 0.81 XXX CH4 0.896667 XXXX UT4 1.03 XXXX UT3 1.10667 XXXX GT3 1.10667 XXXX GT2 1.17 XXXX UT6 1.22333 XXX TS3 1.23333 XXX UT5 1.23667 XXX UT9 1.24667 XXX GT6 1.25667 XXX GT5 1.25667 XXX TV5 1.30333 XXX TV2 1.31333 XXX TV6 1.31667 XXX GT1 1.36667 XXX GT4 1.39 XXX TV4 1.40667 XXX TS4 1.40667 XXX TV8 1.49667 XXXX SX3 1.52667 XXX UT8 1.54 XXX UT12 1.65 XX UT7 2.25 X -Multifactor ANOVA - Acid tong Analysis of Variance for Acid tong - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 765.61 28 27.3432 48.88 0.0000 RESIDUAL 32.4432 58 0.559366 -TOTAL (CORRECTED) 798.053 86 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for Acid tong by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -CH3 5.52 X CH1 7.8 X GT4 7.8 X TS7 7.86 XX UT9 7.98 XXX GT3 8.34 XXXX UT7 9.06 XXXXX UT5 9.12 XXXXXX TV2 9.12 XXXXXX UT6 9.3 XXXXXXX CH4 9.48 XXXXXXX TS5 9.54 XXXXXX TS2 9.78 XXXXXX SX2 9.96 XXXXXX GT2 10.02 XXXXX GT6 10.14 XXXXXX GT1 10.38 XXXXXX GT5 10.44 XXXXXX TS3 10.74 XXXXXX TV6 10.92 XXXXX UT4 11.04 XXXX UT3 11.1 XXXX TV5 11.28 XXX TS4 11.7 XX UT8 12.18 XX TV4 13.62 X SX3 17.94 X UT12 18.06 X TV8 18.24 X Phụ lục 2.2.3 Ngày Analysis of Variance for OD - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 4.85691 28 0.173461 87.31 0.0000 RESIDUAL 0.115232 58 0.00198676 -TOTAL (CORRECTED) 4.97214 86 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for OD by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -CH1 0.596667 X UT3 0.876667 X TS5 0.936667 X TS7 0.956667 X GT4 1.18667 X UT4 1.21333 XX TS2 1.22 XX UT8 1.24333 XXX GT3 1.24333 XXX CH4 1.25333 XXXX SX2 1.25367 XXXX GT1 1.28667 XXXX GT2 1.33333 XXXX UT9 1.33667 XXXX UT5 1.33667 XXXX CH3 1.33667 XXXX UT7 1.34333 XXX UT6 1.36 XX TV5 1.36 XX GT5 1.36667 XX TV2 1.38 XX TV6 1.40667 XX TS3 1.42 XX TV4 1.49333 XX UT12 1.54 XX GT6 1.54133 XX TV8 1.61 X TS4 1.72 X SX3 1.72667 X -Multifactor ANOVA - Acid tong Analysis of Variance for Acid tong - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 708.164 28 25.2916 48.58 0.0000 RESIDUAL 30.1968 58 0.520634 -TOTAL (CORRECTED) 738.361 86 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for Acid tong by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -CH4 8.34 X TS2 8.46 X TS7 8.82 XX CH3 8.88 XXX TS5 9.0 XXXX CH1 9.12 XXXX UT6 9.18 XXXX UT9 9.3 XXXX UT7 9.36 XXXXX UT5 9.72 XXXXXX UT8 9.78 XXXXXX TV2 9.78 XXXXXX TV6 9.84 XXXXXX TS3 9.9 XXXXXX GT4 10.08 XXXXX GT1 10.44 XXXXX UT4 10.56 XXXX GT6 10.92 XXXX GT2 10.98 XXX GT3 11.28 XXX GT5 11.7 XX SX2 11.94 XX UT3 12.3 XX TV5 13.68 XX TV4 14.04 X TS4 16.62 X TV8 17.58 X UT12 17.82 X SX3 18.06 X Phụ lục 2.2.4 Ngày Analysis of Variance for OD - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 4.87254 28 0.174019 910.18 0.0000 RESIDUAL 0.0110892 58 0.000191193 -TOTAL (CORRECTED) 4.88363 86 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for OD by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -SX2 0.753333 X UT3 0.883 X UT5 1.12367 X UT9 1.127 X UT7 1.129 X GT6 1.14253 XX UT4 1.14333 XX TS3 1.16167 X GT4 1.16833 XX TS7 1.17033 XX TV6 1.19233 XX UT6 1.208 XX UT8 1.23633 XX GT3 1.25767 X TS5 1.29267 X GT1 1.32033 XX GT5 1.34233 XX GT2 1.35667 X TV5 1.35933 X TV4 1.36167 X TV2 1.401 X CH1 1.40567 X TS2 1.499 X UT12 1.58767 X TS4 1.65867 X TV8 1.671 X CH3 1.682 X SX3 1.72433 X CH4 1.735 X -Multifactor ANOVA - Acid tong Analysis of Variance for Acid tong - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 818.681 28 29.2386 113.46 0.0000 RESIDUAL 14.9472 58 0.25771 -TOTAL (CORRECTED) 833.628 86 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for Acid tong by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -UT7 8.7 X SX2 8.88 XX UT8 8.88 XX GT5 8.88 XX UT6 9.66 XXX TS3 9.72 XXX GT6 9.72 XXX UT5 9.78 XXX UT9 9.96 XX GT4 10.02 X TV2 10.02 X UT4 10.2 XX TV6 11.16 XX GT1 11.28 XX GT2 11.34 X TS7 11.46 X GT3 13.26 X TS5 13.32 X CH1 13.38 X UT3 13.44 X TV4 13.68 X TV5 13.86 X TS4 16.26 X TS2 17.22 XX SX3 17.22 XX CH4 17.22 XX CH3 17.28 XX TV8 17.4 X UT12 17.46 X Phụ lục 2.2.5 Ngày Analysis of Variance for OD - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 5.70887 28 0.203888 284.06 0.0000 RESIDUAL 0.04163 58 0.000717759 -TOTAL (CORRECTED) 5.7505 86 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for OD by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -TS5 0.764667 X TS7 0.784 XX UT3 0.823 X SX2 0.9 X UT7 1.128 X GT5 1.12967 XX UT5 1.13467 XX UT6 1.14233 XX UT9 1.15733 XXX TV2 1.16 XXX GT4 1.166 XXX CH3 1.17267 XXXX TV6 1.18767 XXXX TS3 1.20667 XXXX UT8 1.23067 XXX UT4 1.233 XXX GT3 1.25267 XX GT1 1.289 X GT2 1.35333 X TV5 1.35867 X GT6 1.36667 X TV4 1.40433 X CH1 1.40767 X TV8 1.47967 X TS2 1.486 X TS4 1.65133 X SX3 1.698 XX CH4 1.73233 XX UT12 1.769 X -Multifactor ANOVA - Acid tong Analysis of Variance for Acid tong - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Dong vi khuan 770.548 28 27.5196 103.06 0.0000 RESIDUAL 15.4872 58 0.267021 -TOTAL (CORRECTED) 786.035 86 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for Acid tong by Dong vi khuan -Method: 99.0 percent LSD Dong vi khuan Count LS Mean Homogeneous Groups -UT6 8.16 X TS5 8.4 XX TS7 8.52 XXX SX2 8.64 XXX UT7 8.7 XXXX GT5 8.88 XXXXX GT6 9.06 XXXXX UT5 9.36 XXXX UT8 9.36 XXXX TV2 9.48 XXXXX UT9 9.6 XXXX TS3 9.78 XXXX GT4 9.78 XXXX TV6 9.96 XXXX UT4 10.5 XXXX GT1 10.86 XXX GT2 10.92 XX CH3 11.16 X UT3 11.16 X GT3 12.42 X CH1 13.38 XX TV5 13.56 X TV4 13.62 X TS2 15.84 X TV8 15.9 X TS4 16.26 XX SX3 16.74 XXX CH4 17.04 XX UT12 17.76 X Phụ lục 3: Khả sinh acid tổng dòng vi khuẩn phân lập với đường glucose ngày thứ 1, 2, 3, 4, Hình Khả sinh acid tổng trung bình 13 dịng vi khuẩn hình que ngày thứ 1, 2, 3, 4, Hình Khả sinh acid tổng trung bình 29 dịng vi khuẩn hình cầu ngày thứ 1, 2, 3, 4, Muc luc 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2.1 GIỚI THIỆU NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Nem chua 2.1.2 Hệ vi sinh vật thịt 2.1.3 Thịt nạc Nguồn (http://giaoan.violet.vn/present/show/entry_id/240405) .5 2.1.4 Da heo 2.1.5 Các loại gia vị 2.1.5.1 Đường 2.1.5.2 Muối .6 2.1.5.3 Tỏi 2.1.5.4 Tiêu 2.1.5.5 Ớt 2.2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC 2.2.1 Định nghĩa trình lên men lactic 2.2.2 Acid lactic 2.2.3 Vi khuẩn lactic 2.2.3.1 Đặc điểm chung .7 2.2.3.2 Một số giống vi khuẩn lactic 2.2.3.3 Ý nghĩa thực tế lên men lactic 10 2.2.6 Lên men lactic 11 2.2.7 Điều kiện trình lên men lactic 12 2.2.7.1 Các cấu tử môi trường 12 2.2.7.2 Các nhân tố bên 12 2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN NEM CHUA .13 2.4 MỘT SỐ HIỆN TƯỢNG XẢY RA TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN 14 2.5 PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VI KHUẨN BẰNG KỸ THUẬT PCR 15 2.5.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 15 2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 16 2.6 Điện di gel agarose .18 2.6.1 Nguyên tắc .18 2.6.2 Gel agarose 18 2.7 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ ADN 18 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .20 3.1.1 Thời gian thực 20 3.1.2 Địa điểm 20 3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .21 3.2.1 Dụng cụ, thiết bị 21 3.2.2 Hóa chất 22 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.3.1 Phân lập vi khuẩn lactic 23 3.3.2 Xác định vi khuẩn lactic thử nghiệm sinh hóa .24 3.3.2.1 Nhuộm Gram quan sát kính hiển vi 24 3.3.2.2 Phản ứng catalse 25 3.3.3 Thử khả sinh acid tổng dòng vi khuẩn phân lập với đường glucose 25 3.3.4 Nhận diện vi khuẩn phương pháp PCR 26 3.3.4.1 Ly trích ADN .26 3.3.4.2 Nhận diện vi khuẩn kỹ thuật PCR 27 3.3.5 Phương pháp xử lí số liệu 29 4.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN 30 4.2 ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN ĐÃ PHÂN LẬP .35 4.2.1 Nhuộm Gram 35 4.3 KẾT QUẢ THỬ KHẢ NĂNG SINH ACID TỔNG CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN ĐÃ PHÂN LẬP VỚI ĐƯỜNG GLUCOSE 36 4.4 ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 46 4.4.1 Kết nhận diện vi khuẩn Lactic kỹ thuật PCR 46 4.4.2 Kết giải trình tự 46 5.1 KẾT LUẬN 50 5.2 ĐỀ NGHỊ 50 ... 2.2.6 Lên men lactic Lên men lactic đồng hình loại lên men lactic cho sản phẩm acid lactic C6H12O6 2C3H6O3 + 94 kcal (Glucose) (Acid lactic) Lên men lactic dị hình loại lên men, ngồi acid lactic. .. THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN 42 dòng vi khuẩn phân lập từ mẫu nem thuộc huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp Thành phố Cần Thơ Kết phân lập trình bày Bảng 4.1 bên Bảng Kết phân lập dòng vi khuẩn. .. đến lên men vi khuẩn nhiên thiếu oxy có lợi cho q trình lên men lactic (Trần Minh Tâm, 1998) 2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA Q TRÌNH LÊN MEN NEM CHUA Q trình lên men lactic sản xuất nem chua xảy đồng