Sau khi trích ADN từ các dòng vi khuẩn đã phân lập, phản ứng PCR được thực hiện với cặp primer giống Lactobacillus với trình tự primer như sau để nhận diện các dòng vi khuẩn lactic:
LbF1 (5’ -CTC AAA ACT AAA CAA AGT TTC- 3’) LbR1 (5’ -CTT GTA CAC ACC GCC CGT CA-3’) (Dubernet, 2002).
* Qui trình phản ứng PCR
Gồm 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn tách mạch ở nhiệt độ 94oC trong 3 phút + Giai đoạn nhân bản: 35 chu kỳ
* 94oC trong 30 phút * 46oC trong 30 giây * 72oC trong 1 phút
+ Giai đoạn hoàn tất ở 72oC trong 7 phút
94oC 94oC 46oC 72oC 72oC 10oC 3’ 30’ 1’ 7’
Hình 3 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi Lactobacillus
Thành phần phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 3.3
Bảng 5 Thành phần cho 1 phản ứng PCR Thành phần cho một phản ứng PCR 25 µl Dung tích (µl) Nước cất 2 lần 11 Buffer NH4 2,5 Dntp 4,0 MgCl2 2 Primer LbF1 (10 ppm) 1 Primer LbR1 (10 ppm) 1 BSA 0,25 Taq polymeraz 0,25 ADN 3 Tổng cộng 25
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, mẫu được trữ lạnh ở 4°C. Sau đó, mẫu được điện di trên gel 1,2% agarose. Sau khi điện di, ADN được quan sát và chụp hình gel bằng máy Bio-Rad. ADN để nhận diện giống Lactobacillus có kích thước 200 bp được quan sát và so sánh với ADN chuẩn.
Sau đó, các dòng vi khuẩn khác nhau có khả năng sinh acid tổng cao được chọn ngẫu nhiên để giải trình tự nucleotide và định danh. Các dòng vi khuẩn lactic được giải trình tự nucleotide bằng máy giải trình tự tự động, sau đó so sánh với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu của NCBI bằng phần mềm BLAST để xác định mức độ đồng hình của các dòng vi khuẩn đó (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).