Tinopal CBSX là chất làm trắng dạng bột là chất cấm dùng trong thực phẩm thường được dùng làm trắng các sản phẩm từ tinh bột. Mục tiêu của nghiên cứu là xác định phương pháp tối ưu của quá trình định lượng Tinopal CBSX trong thực phẩm. Điều kiện định lượng bao gồm 2 yếu tố được khảo sát bằng thực nghiệm là dung môi chiết tách và thông số hệ thống. Phương pháp HPLC đầu dò UVVIS được sử dụng để khảo sát xuyên suốt đề tài. Kết quả nghiên cứu ở những mẫu thực phẩm bị làm trắng bởi Tinopal CBSX gồm mẫu chứa tinh bột và mẫu giàu chất xơ như củ kiệu, măng thì với phương pháp định tính bằng máy soi UV bước sóng 365 nm được xây dựng với LOD: 25,0 µgkg. Đối với phương pháp định lượng độ thu hồi đạt 81 % – 108 %, dung môi thích hợp được sử dụng là acetonitril có mặt 4 % H3PO4. Các thông số điều kiện tối ưu trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò UVVIS để phân tích Tinopal CBSX gồm: Cột sắc ký lỏng pha đảo Eclipse C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và cột bảo vệ hay tương đương; bước sóng: 347 nm; pha động gồm ACN và đệm ammonium formate pH 5 (gradient); tốc độ dòng: 1,0 mlmin. Thể tích tiêm: 10 µl; giới hạn phát hiện và định lượng tính trên nền mầu thử lần lượt là 0,4 mgkg và 2,0 mgkg. Từ đó nghiên cứu thêm ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình chế biến cho thấy Tinopal CBSX dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao với độ thu hồi giảm đi 50 % so với mẫu chuẩn. Đề tài sẽ tiếp tục nghiên cứu để mở rộng phạm vi áp dụng cho các nền thực phẩm cần độ trắng cảm quan khác trong những đề tài tiếp theo, tiếp tục đánh giá các phương pháp, quy trình và kết quả thu được; ứng dụng nhiều trong thực tiễn để phát triển phương pháp có độ thu hồi cao và giới hạn phát hiện thấp hơn trong việc xác định nồng độ Tinopal CBSX trong thực phẩm
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM - TRẦN THÁI THÀNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINOPAL CBS-X TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ TINH BỘT VÀ RAU CỦ MUỐI CHUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số ngành: 60420201 TP HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM - TRẦN THÁI THÀNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINOPAL CBS-X TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ TINH BỘT VÀ RAU CỦ MUỐI CHUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số ngành: 60420201 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng TP HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2020 TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC Độc lập – Tự do – Hạnh phúc TP HCM, ngày 04 tháng 05năm 2020 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Trần Thái Thành Giới tính: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 02/06/1994 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 1841880003 I- Tên đề tài: Nghiên cứu xác định hàm lượng Tinopal CBS-X trong mốt số thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột và rau củ muối chua bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao II- Nhiệm vụ và nội dung: + Nghiên cứu phương pháp sàng lọc mẫu + Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu để tách, chiết hàm lượng Tinopal CBS-X trong nền mẫu + Nghiên cứu điều kiện định lượng hàm lượng Tinopal CBS-X bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV-VIS III- Ngày giao nhiệm vụ: 05/10/2019 IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 04/05/2020 V- Cán bộ hướng dẫn: Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên và chữ ký) KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký) 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc Học viên thực hiện Luận văn (Ký và ghi rõ họ tên) 2 LỜI CẢM ƠN Để thực hiện và hoàn thành đề tài luận văn này, em đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ cũng như là quan tâm, động viên từ nhiều cơ quan và cá nhân Luận văn cũng được hoàn thành dựa trên sự tham khảo, học tập kinh nghiệm từ các kết quả nghiên cứu liên quan, các sách, báo chuyên ngành của nhiều tác giả ở các trường Đại học Đặc biệt hơn nữa là sự hợp tác của giáo viên trường Đại học Công nghệ Tp.HCM và sự giúp đỡ, tạo điều kiện về vật chất và tinh thần từ phía gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô Nguyễn Ngọc Hồng – người trực tiếp hướng dẫn khoa học đã luôn dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận văn Tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám đốc Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc – Mỹ phẩm – Thực phẩm cùng toàn thể các anh chị công tác trong phòng Thực phẩm đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu Một lần nữa tôi xin chân thành cám ơn! Hồ Chí Minh, 4 tháng 5 năm 2020 Tác giả Trần Thái Thành 3 TÓM TẮT Tinopal CBS-X là chất làm trắng dạng bột là chất cấm dùng trong thực phẩm thường được dùng làm trắng các sản phẩm từ tinh bột Mục tiêu của nghiên cứu là xác định phương pháp tối ưu của quá trình định lượng Tinopal CBS-X trong thực phẩm Điều kiện định lượng bao gồm 2 yếu tố được khảo sát bằng thực nghiệm là dung môi chiết tách và thông số hệ thống Phương pháp HPLC đầu dò UV-VIS được sử dụng để khảo sát xuyên suốt đề tài Kết quả nghiên cứu ở những mẫu thực phẩm bị làm trắng bởi Tinopal CBS-X gồm mẫu chứa tinh bột và mẫu giàu chất xơ như củ kiệu, măng thì với phương pháp định tính bằng máy soi UV bước sóng 365 nm được xây dựng với LOD: 25,0 µg/kg Đối với phương pháp định lượng độ thu hồi đạt 81 % – 108 %, dung môi thích hợp được sử dụng là acetonitril có mặt 4 % H 3PO4 Các thông số điều kiện tối ưu trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò UV-VIS để phân tích Tinopal CBS-X gồm: Cột sắc ký lỏng pha đảo Eclipse C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và cột bảo vệ hay tương đương; bước sóng: 347 nm; pha động gồm ACN và đệm ammonium formate pH 5 (gradient); tốc độ dòng: 1,0 ml/min Thể tích tiêm: 10 µl; giới hạn phát hiện và định lượng tính trên nền mầu thử lần lượt là 0,4 mg/kg và 2,0 mg/kg Từ đó nghiên cứu thêm ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình chế biến cho thấy Tinopal CBS-X dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao với độ thu hồi giảm đi 50 % so với mẫu chuẩn Đề tài sẽ tiếp tục nghiên cứu để mở rộng phạm vi áp dụng cho các nền thực phẩm cần độ trắng cảm quan khác trong những đề tài tiếp theo, tiếp tục đánh giá các phương pháp, quy trình và kết quả thu được; ứng dụng nhiều trong thực tiễn để phát triển phương pháp có độ thu hồi cao và giới hạn phát hiện thấp hơn trong việc xác định nồng độ Tinopal CBS-X trong thực phẩm 4 ABSTRACT Tinopal CBS-X is fluorescent whitening agent, which is banned from food use, and often used to bleach starch products The objective of the study is to determine the optimal method of quantifying Tinopal CBS-X in food product The quantitative conditions include two factors, which are experimentally examined, such as extraction solvent and system parameters The HPLC UV-VIS probe method is used for examination throughout the topic Research results on samples of food whitened by Tinopal CBS-X include samples containing starch and samples rich in fiber such as beets, bamboo shoots, with qualitative methods using 365 nm UV scanner built with LOD: 25.0 µg/kg For the method of quantitative recovery of 81 % - 108 %, the required solvent is Acetonitrile in H3PO4 4 % Optimal parameters on high-performance liquid chromatography UV-VIS detector for Tinopal CBS-X analysis include: Eclipse C18 reverse-phase liquid chromatography column (250 mm x 4.6 mm x 5 µm) and recolumn; wavelength: 347 nm; mobile phase: ACN and buffer ammonium formate pH 5 (gradient); flow rate: 1.0 ml/min Injection volume: 10 µl; The limit of detection and quantification is 0.4 mg/kg and 2.0 mg/kg, respectively Rased on the study, the effect of temperature during the process shows that Tinopal CBS-X easily decomposes at high temperatures with a recovery of 50 % less than the standard sample does The research will continue to expand the scope of the application for other sensory evalution such as whiteness in food in next topics, evaluate the methods, processes and results obtained; develop practical applications for high-recovery methods and lower detection limits for the determination of Tinopal CBS-X concentrations in food 5 MỤC LỤC Chương 1 16 TỔNG QUAN 16 1.1 Sơ lược về các thực phẩm nhiễm Tinopal CBS-X 16 1.1.1 Các sản phẩm về tinh bột gạo 16 1.1.2 Các sản phẩm có nguồn gốc từ củ kiệu, măng 18 1.2 Chất làm trắng quang học hay chất làm trắng huỳnh quang 19 1.2.1 Giới thiệu 19 1.2.2 Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học 19 Các chất làm trắng quang học có thể được phân loại dựa trên cấu trúc và thuộc tính, vào khoảng 11 nhóm chất lớn, mỗi thành phần có chứa gốc khác nhau, hàng trăm hợp chất, và hàng ngàn công thức khác nhau Tất cả OBs đa vòng hydrocarbon thơm, cấu trúc có chứa nhiều liên kết đôi có thể được kích hoạt bằng ánh sáng tia cực tím Hàng ngàn công thức OBs đã được dùng nhiều trong các ngành công nghiệp chất làm trắng, nhưng tương đối ít đáp ứng được yêu cầu của ngành công nghiệp, và chất làm trắng làm trắng huỳnh quang (FWAs) đã được nghiên cứu sử dụng 19 1.3 Tinopal CBS-X 21 1.3.1 Khái niệm 21 Theo Enzyclopediaof Industrial Chemistry, sản xuất distyrylbiphenylsulfonate bắt đầu với biphenyl, được sản xuất cùng với các hợp chất thơm khác trong tinh chế dầu thô Nó phản ứng nhanh với hydrogen chloride và formaldehyde và tạo thành 4, 4’–bis(chloromethyl)biphenyl, sau đó phản ứng với trimethylphosphite cho ra 4,4’-bis(dimethoxyphosphonomethyl)biphenyl Biphenylphosphonate đối xứng này được phản ứng với hai phân tử benzaldehyde-2-sulphonic acid, được sản xuất từ một hợp chất là 2- chlorbenzaldehyde và natri sunfit Thành phần sản phẩm hoạt chất sinh ra là xấp xỉ 90 %, các tạp chất khác < 1,2 % bao gồm các sản phẩm và số dư là natri clorua và nước[8] 22 1.3.2 Cơ chế làm trắng .22 1.3.3 Ứng dụng của Tinopal CBS-X 23 6 Tinopal CBS-X có nhiều dẫn chất ở dạng bột, dạng dung dịch được dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, vải sợi, nhựa, sơn, mực in hay mỹ phẩm và được dùng làm chất làm trắng trong gia dụng để làm trắng sản phẩm và làm sạch bề mặt vật dụng[13], [14], [22] 23 1.4 Một số kết nghiên cứu và phương pháp xác định 23 1.4.1 Phương pháp soi bằng đèn cực tím 25 1.4.2 Phương pháp định lượng HPLC bằng đầu dò huỳnh quang 26 1.4.3 Phương pháp định lượng HPLC bằng đầu dò tử ngoại khả kiến 27 1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 28 1.5.1 Cơ sở phương pháp và phạm vi ứng dụng 28 1.5.2 Khái niệm 29 1.5.3 Phân loại 29 Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng, HPLC được phân thành 4 loại: 29 1.5.4 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 30 1.5.5 Ứng dụng của HPLC 33 1.6 Các tiêu chí đánh giá thẩm định phương pháp .34 1.6.1 Tính đặc hiệu 34 1.6.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 36 1.6.3 Giới hạn phát hiện 38 1.6.4 Giới hạn định lượng 39 1.6.5 Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) .40 1.6.5.1 Độ chụm .41 1.6.5.2 Độ đúng (trueness) .45 * Định nghĩa 45 Chương 2 47 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 47 2.1 Vật liệu 47 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .47 2.1.2 Hóa chất và chất chuẩn[3]: .48 2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 49 2.1.4 Dụng cụ 49 80 Phương trình : y = 6800 x + 714,2 R2= 0,999 Bảng 3.8: Diện tích dung dịch chuẩn 0,5 – 5,0 mg/l ngày 2 Chỉ tiêu STT 1 2 3 4 5 Tinopal Nồng độ chuẩn Diện tích (mg/l) 0,51 1,02 2,54 3,05 5,08 33041 73203 169903 199875 334093 Hình 3.12: Đường chuẩn khảo sát khoảng nồng độ 0,5 – 5,0 mg/l ngày 2 Phương trình : y = 65165x + 3021 R2= 0,999 Nhận xét: Độ tuyến tính của đường chuẩn có hệ số xác định R2 ≥ 0,99 81 3.4.4 Độ chụm và độ thu hồi của phương pháp Áp dụng công thức 2.2 và 2.3 tính được SD và RSD của các lần lặp lại và tái lặp của các nền mẫu Thu được kết quả như sau: Bảng 3.9: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 0,5 mg/kg ngày 1 Độ thu hồi (%) STT 1 2 3 4 5 6 7 Trung RSD (%) bình Bánh canh 89,79 91,72 85,83 89,32 91,47 84,52 90,01 88,95 3,09 Bánh phở 83,49 86,06 85,10 80,66 81,76 83,33 83,93 83,48 2,41 Bún 82,50 82,15 81,23 83,99 85,19 82,93 87,27 83,61 2,47 Măng chua 81,87 80,98 84,09 84,14 83,34 85,40 85,89 83,67 2,12 Củ kiệu 83,88 81,43 88,98 86,56 82,51 81,34 88,42 84,73 3,62 Nhận xét: Tại kết quả phân tích của các nền mẫu ở nồng độ 0,5 mg/kg ở ngày 1 thực hiện thì độ thu hồi đều đạt trong khoảng từ 83 % đến 89 %, có mức lặp lại tốt và RSD < 4 % Như vậy các mẫu được thêm chuẩn nồng độ 0,5 mg/kg có độ thu hồi tốt, ít bị ảnh hưởng của nền mẫu và đúng theo yêu cầu ở mục 2.2.4.3 Bảng 3.10: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 2,5 mg/kg ngày 1 STT Độ thu hồi (%) RSD 82 1 2 3 4 5 6 7 Trung (%) bình Bánh canh 87,74 105,56 108,53 103,77 103,24 104,10 100,38 101,90 6,59 Bánh phở 82,66 82,69 89,24 97,25 97,93 98,53 99,95 92,61 8,22 Bún 83,04 82,89 83,44 83,61 84,29 83,73 86,64 87,03 0,62 Măng chua 100,13 99,84 95,37 94,73 94,81 94,25 99,96 97,02 2,88 Củ kiệu 82,72 93,67 100,23 87,49 99,68 100,22 100,16 94,88 7,60 Nhận xét: Tại kết quả phân tích của các nền mẫu ở nồng độ 2,5 mg/kg ở ngày 1 thực hiện thì độ thu hồi đều đạt trong khoảng từ 87 % đến 101 %, có mức lặp lại tốt và RSD < 8 % Ở đây trên nền củ kiệu,bánh canh, bánh phở có độ lặp lại khá cho thấy rằng 2 nền mẫu có thể bị ảnh hưởng trong quá trình xử lý, cần xem xét độ lặp lại tại ngày 2 Như vậy mẫu được thêm chuẩn nồng độ 2,5 mg/kg có độ thu hồi khá và đúng theo yêu cầu ở mục 2.2.4.3 Bảng 3.11: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 5,0 mg/kg ngày 1 Độ thu hồi (%) STT 1 2 3 4 5 6 7 Trung RSD (%) bình Bánh canh 95,93 94,05 95,15 95,09 94,54 99,89 99,67 96,33 2,52 Bánh phở 81,30 82,28 82,38 84,63 83,88 84,03 85,20 83,42 1,72 Bún 83,04 82,89 83,44 83,61 84,29 83,73 86,64 83,95 1,51 Măng chua 83,04 82,23 85,17 84,39 82,14 82,01 82,20 83,03 1,52 Củ kiệu 82,91 82,38 81,27 86,90 81,87 86,50 86,81 84,09 3,00 Nhận xét: Tại kết quả phân tích của các nền mẫu ở nồng độ 5,0 mg/kg ở ngày 1 thực hiện thì độ thu hồi đạt trong khoảng từ 83 % đến 96 %, có mức lặp lại tốt và RSD < 3 % Như vậy các mẫu được thêm chuẩn nồng độ 5,0 mg/kg có độ thu hồi tốt, ít bị ảnh hưởng của nền mẫu và đúng theo yêu cầu ở mục 2.2.4.3 Thực hiện lặp lại quy trình như ở ngày 1 nhưng ở một phòng thí nghiệm Mỹ Phẩm cùng trung tâm với cùng chung nền mẫu Áp dụng công thức 2.2 và 2.3 thu được kết quả như sau: 83 Bảng 3.12: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 0,5 mg/kg ngày 2 Độ thu hồi (%) STT 1 2 3 4 5 6 7 Trung RSD (%) bình Bánh canh 85,34 85,91 83,19 87,70 87,70 87,42 88,52 86,54 2,14 Bánh phở 88,73 87,08 88,34 82,35 85,41 83,08 88,14 86,16 3,02 Bún 86,07 87,95 93,88 88,29 91,60 91,14 90,12 89,86 2,92 Măng chua 81,69 82,98 81,36 83,38 82,72 85,94 88,53 83,80 3,06 Củ kiệu 88,54 86,58 84,47 90,16 83,65 90,93 91,31 87,95 3,53 Nhận xét: Tại kết quả phân tích của các nền mẫu ở nồng độ 0,5 mg/kg ở ngày 2 có kết quả gần giống với ngày 1 với độ thu hồi đạt trong khoảng từ 83 % đến 89 %, có mức lặp lại tốt và RSD < 4 % Như vậy các mẫu được thêm chuẩn nồng độ 0,5 mg/kg có độ thu hồi tốt, ít bị ảnh hưởng của nền mẫu và đúng theo yêu cầu ở mục 2.2.4.3 Bảng 3.13: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 2,5 mg/kg ngày 2 Độ thu hồi (%) STT 1 2 3 4 5 6 7 Trung RSD (%) bình Bánh canh 83,73 92,97 93,71 84,78 95,39 95,35 99,89 92,26 6,39 Bánh phở 97,95 102,49 87,28 99,55 92,30 93,15 102,50 96,46 5,94 Bún 85,18 82,35 81,71 82,70 85,15 81,83 85,49 86,31 3,09 Măng chua 100,76 106,78 108,98 108,42 106,94 108,49 102,64 106,14 3,01 Củ kiệu 85,06 85,07 82,93 85,32 83,58 84,90 86,21 84,72 1,31 Nhận xét: Tại kết quả phân tích của các nền mẫu ở nồng độ 2,5 mg/kg ở ngày 2 thực hiện thì độ thu hồi đạt trong khoảng từ 85 % đến 103 %, và RSD < 7 % đúng theo 84 yêu cầu ở mục 2.2.4.3 Tại ngày 2, nền mẫu bánh canh, bánh phở và củ kiệu có độ lặp lại tốt hơn ngày 1 nhưng vẫn còn ở mức khá Như vậy nên lưu ý khi thực hiện các mẫu bánh canh bánh phở và củ kiệu cần có mẫu kiểm soát khi thực hiện định lượng để đảm bảo kết quả chính xác Bảng 3.14 Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 5,0 mg/kg ngày 2 Độ thu hồi (%) STT 1 2 3 4 5 6 7 Trung RSD (%) bình Bánh canh 94,06 99,89 93,69 99,72 90,47 102,83 99,03 97,10 4,53 Bánh phở 87,22 84,14 87,60 84,14 85,94 84,69 88,23 85,99 1,99 Bún 85,18 82,35 81,71 82,70 85,15 81,83 85,49 83,49 2,04 Măng chua 90,09 90,18 90,72 90,52 90,74 90,82 91,25 90,62 0,44 Củ kiệu 87,83 85,59 87,98 87,93 87,74 88,10 88,12 87,61 1,03 Nhận xét: Tại kết quả phân tích của các nền mẫu ở nồng độ 5,0 mg/kg ở ngày 2 có kết quả gần giống với ngày 1 với độ thu hồi đạt trong khoảng từ 89 % đến 97 %, có mức lặp lại tốt và RSD < 5 % Như vậy các mẫu được thêm chuẩn nồng độ 5,0 mg/kg có độ thu hồi tốt, ít bị ảnh hưởng của nền mẫu và đúng theo yêu cầu ở mục 2.2.8.3 Kết luận: Khi tiến hành thêm chuẩn ở lần lượt các nồng độ 0,5 mg/kg; 2,5 mg/kg và 5,0 mg/k, từ kết quả thu được từ bảng 3.9 đến bảng 3.14 Áp dụng công thức 2.1 tính được: độ của quy trình phân tích đạt được từ 81 % đến 108 %, độ tái lặp của phương pháp < 9 % đáp ứng được yêu cầu của thẩm định phương pháp[2] 3.4.5 Giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp Từ các kết quả thu được từ mục 3.4.4 chọn SD của nồng độ 0,5 mg/kg để xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng trên các nền mẫu ở nồng độ thêm chuẩn 0,5 mg/kg Áp dụng công thức 2.4 và 2.5 tính được kết quả sau: Giới hạn phát hiện LODdd = 0,1 mg/kg Giới hạn định lượng LOQdd = 0,5 mg/kg Với kết quả tính quy về LOD và LOQ trên nền mẫu dựa vào lượng mẫu đã cân (5,0 g) và độ pha loãng (20 ml) Áp đụng công thức 2.6 tính được kết quả sau: 85 Giới hạn phát hiện LODmẫu = 0,4 mg/kg Giới hạn định lượng LOQmẫu = 2,0 mg/kg 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp làm giảm nồng độ Tinopal CBS-X Cách tiến hành Mẫu bún được thêm tại LOD của phương pháp định lượng là 1,0 mg/kg chuẩn Tinopal CBS-X Tiến hành xử lý theo 2 nghiệm thức: + Nghiệm thức 1 (Xử lý với nước sôi): Đun sôi nước ở nhiệt độ 100 oC Tiến hành thêm 100 ml nước sôi vào mẫu đã được thêm chuẩn, khuấy đều 5 phút Bỏ nước lấy phần mẫu, để nguội tiến hành chiết theo quy trình ở khảo sát được ở mục 3.2 + Nghiệm thức 2 (Xử lý trong lò vi sóng ở mức nhiệt độ cao): Mẫu được đặt trong đĩa petri đồng thời đặt thêm 20 ml nước trong lò Chỉ mức nhiệt độ cao với công suất 800 w Tiến hành gia nhiệt trong 2 phút Để nguội tiến hành chiết theo quy trình ở khảo sát được ở mục 3.2 Đem đo và so sánh với kết quả mẫu được thêm chuẩn không qua xử lý nhiệt Được trình bày trong hình 3.13: 86 Mẫu thêm chuẩn 1,0 mg/kg Xử lý nước sôi Xử lý Vi sóng Hình 3.13: Sắc ký đồ của mẫu thử sau khi xử lý so với mẫu được thêm chuẩn chưa qua xử lý Nhận xét: Qua sắc ký đồ của bún sau khi xử lý nghiệm thức 1 và nghiệm thức 2 so với mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 1,0 mg/kg, công thức 2.1 được áp dụng để tính được nồng độ Tinopal CBS-X đã giảm lần lượt còn 52,3 % và 48,9 % Như vậy cho thấy trong quá trình xử lý bằng nhiệt độ > 100 oC thì nồng độ Tinopal CBS-X đã bị giảm Điều đó có ý nghĩa cho thấy rằng trong quá trình nấu ăn tại gia đình có thể phòng ngừa ăn phải các sản phẩm có nhiễm Tinopal CBS-X bằng cách sơ chế qua nhiệt độ trước khi ăn Nhưng bên cạnh đó người tiêu dùng cần phải sử dụng các sản phẩm có xuất xứ và nguồn gốc rõ ràng để đảm bảo sức khỏe, phòng ngừa các sản phẩm bẩn trên thị trường 87 3.6 Khảo sát độ nhạy, độ chính xác của phương pháp định lượng Tinopal CBS-X bằng phương pháp đo quang phổ và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Mẫu thử sau khi thêm chuẩn ở nồng độ 1,0 mg/kg Sau đó tiến hành chiết mẫu theo phương pháp đã nghiên cứu được Đem mẫu đã chiết đo ở hai máy lần lượt là máy đo quang phổ UV và máy sắc kỷ lỏng hiệu năng cao UV-VIS Kết quả so sánh mẫu được thể qua hình 3.14 Mẫu Đồng nhất mẫu Bảo quản mẫu (5oC - 8oC) Định tính (soi UV 365 nm) Phát hiện Không phát hiện Tinopal CBS-X (LOD: 25,0 µg/kg) Cân 5,0 g mẫu dung môi Hình 3.14: Đồ thị so sánh kết qua20đomlmẫu giữa hai máy UV-VIS và quang phổ UV pha mẫu Nhận xét: Qua kết quả đo được cho thấy độ thu hồi của mẫu khi đo trên máy sắc Vortex ký lỏng UV-VIS có độ thu hồi tốt hơn (98 % -100 %) so với kết quả đo được trên máy quang phổ UV Từ đó nhận thấy phương pháp đo bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Siêu âm 15 phút có độ nhạy cao, chính xác với tỷ lệ 98,4 % so với 150,6 % của phương pháp đo quang phổ UV Ly tâm 3.7 Quy5000 trìnhvòng/ địnhphút lượng Tinopal CBS-X sau quá trình nghiên cứu Từ các thông số và kết quả khảoPha sát loãng được, quy trình định lượng Tinopal CBS-X được thể hiện Lọc qua sơ đồ như sau: (0,45 µm) Chạy máy HPLC đầu dò UV-VIS Xử lý phổ, Tính toán kết quả Cột C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) Bước sóng: 347 nm Pha động: ACN : Đệm ammonium formate pH 5 (Gradient) Tốc độ dòng: 1,0 ml/min Thể tích tiêm: 10 µl 88 Hình 3.15: Sơ đồ quy trình định lượng Tinopal CBS-X Thuyết minh quy trình: - Mẫu sau khi nhận được tiến hành đồng nhất mẫu bằng các phương pháp đồng nhất như xay, trộn, khuấy,… 89 - Mẫu sau khi đồng nhất sẽ được bảo quản ở tủ đựng mẫu có nhiết độ từ 5 oC 8oC Khi tiến hành thực hiện phép thử thì cần để về nhiệt độ phòng trước khi xử lý mẫu và mẫu còn tồn lại cần phải bảo quản trong tủ mát đựng mẫu - Trước khi tiến hành phương pháp định lượng hàm lượng Tinopal CBS-X cần thực hiện phép thử định tính bằng phương pháp soi UV ở bước sóng 365 nm Tại bước thử định tính cho 2 trường hợp kết luận: - Trường hợp 1 (Không phát hiện): Nếu kết quả có màu nhạt hơn so màu của ống chuẩn ở LOD (25,0 µg/kg) thì kết luận là trong mẫu thử không có Tinopal CBS-X Kết thúc quy trình - Trường hợp 2 (Phát hiện): Nếu kết quả có màu đậm hơn so với màu của ống chuẩn ở LOD (25,0 µg/kg) thì kết luận là trong mẫu thử có Tinopal CBS-X Tiếp tục thực hiện phép thử định lượng bằng phương pháp HPLC UV-VIS - Định lượng mẫu thử bằng phương pháp HPLC UV-VIS theo quy trình được trình bày ở hình 3.15 - Xử lý phổ, ghi nhận và xử lý kết quả bằng phần mềm Excel Như vậy khi tiến hành thực hiện theo quy trình trên tuy phải thực hiện thêm phép thử định tính bằng UV ở bước sóng 365 nm nhưng lại tiết kiệm được chi phí vận hành máy HPLC, thời gian cũng như dung môi hóa chất khi định tính bằng HPLC UV-VIS trước khi thực hiện phép thử định lượng Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua thời gian nghiên cứu thực hiện đề tài xác định hàm lượng Tinopal CBS-X 90 thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột và rau củ muối chua Đề tài đã thu được những kết quả sau: 1- Giới hạn phát hiện của phương pháp định tíng Tinopal CBS-X bằng đèn UV ở bước sóng 365 nm trước khi bắt đầu thực hiện định lượng bằng máy HPLC UV-VIS là 25,0 µg/kg 2- Điều kiện tối ưu trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò UV-VIS để phân tích Tinopal CBS-X Cột sắc ký: Cột sắc ký lỏng pha đảo Eclipse C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và cột bảo vệ Bước sóng: 347 nm Pha động: ACN:Đệm ammonium formate pH 5 (gradient) Tốc độ dòng: 1,0 ml/min Thể tích tiêm: 10 µl Chương trình gradien pha động của dung môi ACN:Đệm (%) có tỷ lệ như sau: + Tại thời điểm 0 – 1 phút có tỷ lệ 25:75 + Tại thời điểm 2 – 11 phút có tỷ lệ 45:55 + Tại thời điểm 11,1 – 16 phút có tỷ lệ 25:75 3- Để tách chiết hàm lượng Tinopal CBS-X thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột và rau củ muối chua thì dung môi thích hợp được khảo sát là acetonitril có mặt 4 % H3PO4 4- Khoảng tuyến tính của đường chuẩn phân tích chất Tinopal CBS-X bằng HPLC UV-VIS nằm trong khoảng từ 0,5 mg/kg đến 5,0 mg/kg 5- Kết quả tính được của các mẫu thêm chuẩn cho thấy kết quả lặp lại tốt, không bị ảnh hưởng của nền mẫu Từ đó kết luận phương pháp phù hợp đối với các nền mẫu cần khảo sát 6- Độ lặp lại và độ tái lặp của mẫu khảo sát được thêm chuẩn ở lần lượt các nồng độ 0,5 mg/kg; 2,5 mg/kg và 5,0 mg/kg thì độ của quy trình phân tích đạt được từ 81 % đến 108 %, RSD < 9 % đáp ứng được yêu cầu của thẩm định phương pháp[2] 7- Độ thu hồi của của phương pháp: từ 81 % đến 108 % 8- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của Tinopal CBS-X tính trên nền mẫu thử với lượng cân 5,0 g mẫu thử và chiết với lượng dung môi chiết là 20 ml, LOD là 91 0,4 mg/kg và LOQ là 2,0 mg/kg 9- Nồng độ của Tinopal CBS-X trong mẫu sau khi qua bước xử lý nhiệt đã giảm đi 50,0 % so với ban đầu Như vậy khi đối chiếu kết quả thu được sau khi thực hiện khảo sát với yêu cầu đã đề ra ở mục 2.2.4, đề tài đã thỏa mãn các điều kiện cũng như yêu về xây dựng thẩm định trong phân tích hóa học và khi so sánh với kết quả công trình nghiên cứu của tác giả Phạm Duy[3], đề tài có những điểm mới như sau: + Rút ngắn được thời gian phân tích mẫu với phương pháp định tính bằng đèn UV ở bước sóng 365 nm để sàng lọc các mẫu không phát hiện trước khi phân tích định lượng + Đã xây dựng được phương pháp định lượng Tinopal CBS-X bằng đầu dò UVVIS được sử dụng phổ biến, thông dụng trong các phòng thí nghiệm + Mở rộng được quá trình tách chiết cũng như định lượng trên các sản phẩm rau củ muối chua + Đạt được độ thu hồi cao hơn cụ thể từ 73,91 %[3] tăng lên 81 % đến 108 % 4.2 Kiến nghị Nhìn chung, qua các nghiên cứu về giảm ảnh hưởng của nồng độ Tinopal CBS-X trong quá trình chế biến có giảm Từ đó cho thấy cẩn thận trong việc ăn uống hằng ngày rất quan trọng Bên cạnh đó các cơ quan thẩm quyền cần thường xuyên giám sát các cơ sở sản xuất và kinh doanh một các chặt chẽ kết hợp tuyên truyền nâng cao ý thức người dân trong việc nấu nướng hằng ngày Do điều kiện thực nghiệm và thời gian có hạn Để mở mở rộng, đề tài nên thực hiện tiếp các nghiên cứu: + Mở rộng phạm vi áp dụng đề cho các nền thực phẩm cần độ trắng cảm quan khác + Tiếp tục đánh giá các phương pháp, quy trình và kết quả thu được; ứng dụng nhiều trong thực tiễn để phát triển phương pháp có độ thu hồi cao và giới hạn phát hiện thấp hơn trong việc xác định nồng độ Tinopal CBS-X trong thực phẩm 92 DANH MỤC TÀI LIỆU KHAM KHẢO [1]- Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế (2013), Công văn về việc áp dụng quy trình kiểm nghiệm Tinopal CBS-X trong thực phẩm, 1731/ATTP-KN, thành phố Hồ Chí Minh 93 [2]- Trần Cao Sơn, Thẩm Định Phương Pháp Trong Phân Tích Hóa Học Và Vi Sinh Vật, Viện Kiểm Nghiệm Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm Quốc Gia [3]- Phạm Duy, (2014), Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng Tinopal CBS- X trong thực phẩm nền tinh bột bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao, luận văn (thạc sĩ), khoa Hóa, trường đại học y Vinh [4]- Lê Thanh Huy (2011) Nghiên cứu xây dựng công thức viên nang chưa cao diếp cá, luận văn (thạc sĩ), khoa Dược, trường đại học y dược Cần Thơ [5]- Bộ Y Tế (2017), Kỹ thuật lấy mẫu thực phẩm phục vụ thanh tra, kiểm tra chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm theo thông tư 14/2011/TT-BYT, Bộ Y Tế Viện y tế công cộng thành phố Hồ Chí Minh [6]- Lê Văn Hoàng , (2007), Tinh bột khai thác và ứng dụng, nhà xuất bản Đà Nẵng [7]- Adapted from Klimisch et al, (1997), Criteria for reliability Categories [8]- Ciba Specialty Chemicals, (Inc 2004), Human and environmental risk assessment on ingredients of European household cleaning products: Fluorescent Brightener FWA-5 [9]- Anal.Cham, (1997), Determination of Detergent – Derived Fluorescent Whitening Agent Isomers in Lake Sediments and Surface Waters by Liquid Chromatography, 2594 – 2597 [10]- Charles Hagedorn, Professor; Mike Saluta, Senior Research Specialist,et al, (2005), Fluorometric Detection of Optical Brighteners as an Indicator of Human Sources of Water Pollution Part I Description and Detection of Optical Brighteners [11]- Wei-Chuan Shu, Wang-Hsien Ding (2009), Determination of Fluorescent Whitening Agents in Infant Clothes and Paper Materials by Ion- 60 pair Chromatography and Fluorescence Detection, Journal of the Chinese Chemical Society, 56, 797-803 94 [12]- Ciba Specialty Chemicals, (Inc 2004) Human and environmental risk assessment on ingredients of European household cleaning products: Fluorescent Brightener FWA-1 [13]- Kyung Yuk Ko, Chae A Lee, Jae Chon Choi, Meehye Kim (2014), Determination of Tinopal CBS-X in rice papers and rice noodles using HPLC with fluorescence detection and LC-MS/MS [14]- Ciba Specialty Chemicals, Additives, (1999), Optical Brighteners, Fluorescent Whitening Agents for Plastics, Paints, Imaging and Fibers [15]- Hsin-Chang Chen, Shu-Ping Wang, Wang-Hsien Ding, (2005), Determination of fluorescent whitening agents in environmental waters by 58 solid-phase extraction and ion pair liquid chromatography tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1102 (2006) 135–142 [16]- Hsin-Chang Chen, Wang-Hsien Ding, (2006), Hot-water and solid-phase extraction of fluorescent whitening agents in paper materials and infant clothes followed by unequivocal determination with ion – pair chromatography – tandem, Journal of Chromatography A, 1108, 202–207 [17]- Jeong Soo Kim, Do Hwan Kim, and Keon Kim, (2012); Determination of Fluorescent Whitening Agents in Paper Materials by IonPair Reversed – Phase High – Performance Liquid Chromatography, Bull Korean Chem Soc 2012, Vol 33, No 12 [18]- L Lepri, P G Desideri and W Coas, (1984), High-performance thin-layer Chromatography of fluorescent whitening agents and their identification in detergents, Journal of Chromatography, 322 (1985) 363-370 [19]- Mai-Ling Jao, Mei-Ing Liao, Chung-Tzu Hang, Chieu-Chen Cheng and ShinShu Chou, (1999); Studies on Analytical Method for Determination of Fluorescent Whitening Agent in Paper Containers for Food, Journal of Food and Drug Analysis, 53-63 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM - TRẦN THÁI THÀNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINOPAL CBS-X TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ TINH BỘT VÀ RAU CỦ MUỐI CHUA BẰNG... Phẩm – Thực phẩm quan tâm đến vấn đề phân tích định lượng hàm lượng Tinopal CBS-X loại thực phẩm Trên sở đó, đề tài ? ?Nghiên cứu xác định hàm lượng Tinopal CBS-X số thực phẩm có nguồn gốc từ tinh. .. bột rau củ muối chua phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao? ?? thực Trong luận văn này, đề tài có mục tiêu nghiên cứu: + Xây dựng phương pháp định tính Tinopal CBS-X đèn UV 365 nm + Xây dựng phương pháp