XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var. israelensis QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var. israelensis QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var. israelensis QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 2010 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ….  …. HỒ THỊ ÁNH TUYẾT XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var. israelensis QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hướng dẫn khoa học: TS. BS. HỒ THỊ HỒNG NHUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 92010 ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên là Hồ Thị Ánh Tuyết. Sinh ngày 05 tháng 12 năm 1963 tại tỉnh Thái Nguyên. Con Ông Hồ Văn Duyệt và Bà Nguyễn Thị Ninh. Tốt nghiệp tú tài tại trường Trung học phổ thông Trần Quốc Tuấn, thành phố Quảng Ngãi, tỉnh Quảng Ngãi, năm 1981. Tốt nghiệp đại học ngành Dâu tằm, hệ đại học chính quy tại Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, năm 1986. Hiện công tác tại phòng Công tác Học sinh Sinh viên trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 9 năm 2006 trúng tuyển và theo học cao học ngành Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Tình trạng hôn nhân: Lập gia đình, năm kết hôn: 1987. Họ tên chồng: Đinh Thành Ngân. Các con: Đinh Nhật Huy sinh năm 1988. Đinh Bảo Huy, sinh năm 1991. Địa chỉ liên lạc: Phòng Công tác Học sinh Sinh viên trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh, số 01. Võ Văn Ngân, Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh. Điện thoại: (08) 38 999 866. Email: tuyethtahcmute.edu.vn iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hồ Thị Ánh Tuyết iv Lời cảm ơn Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh. Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, các Giáo sư, Giảng viên và CBVC phòng Sau Đại học, Bộ môn Công nghệ Sinh học. Đã tạo điều kiện cho tôi tham gia khoá học, tận tâm truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm chuyên sâu thuộc chuyên ngành tôi theo học và nghiên cứu, cũng như đã góp ý, chỉnh sửa đề tài, giúp đề tài được thực hiện tốt nhất. Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh, Phòng Nghiên cứu thử nghiệm côn trùng y học, Khoa Dịch tễ học, các nhà nghiên cứu và các cộng sự đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cung cấp đầy đủ vật liệu ấu trùng muỗi thí nghiệm với chất luợng chuẩn thức suốt quá trình thực hiện đề tài. Ban Giám đốc Công ty TNHH Sinh học Mai Việt đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được sử dụng phòng thí nghiệm, trang thiết bị thực hiện đề tài. TS. BS. Hồ Thị Hồng Nhung hướng dẫn khoa học. Cùng toàn thể đồng nghiệp, anh chị em tại Trường, Viện, Công ty Sinh học Mai Việt đã giúp tôi hoàn thành công việc và nghiên cứu trong khoá học. Gia đình và nhiều bạn bè thân hữu đã cổ vũ động viên tôi. Xin chân thành cảm ơn. Hồ Thị Ánh Tuyết v TÓM TẮT Đề tài: “Xây dựng quy trình kiểm tra hoạt tính sinh học diệt LQ của chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) quy mô phòng thí nghiệm” đã tiến hành tại phòng Kiểm nghiệm Công ty TNHH Sinh học Mai Việt từ tháng 62008 đến tháng 82010. Mục tiêu của đề tài là hoàn chỉnh qui trình nuôi LQ A. aegypti từ qui trình chuẩn nuôi muỗi tại Viện Pasteur; xác định liều gây chết LD50, LD90, LD99 của Bti chuẩn và Bti thử; xác định công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti thử theo đơn vị độc tố quốc tế trong 1 mg sinh phẩm (ITUmg) và suy ra liều dự đoán của Bti thử áp dụng diệt LQ muỗi ngoài thực địa. Kết quả cho thấy từ qui trình chuẩn nuôi muỗi của Viện Pasteur có thể cung cấp LQ cùng tuổi bằng cách lấy các băng giấy mà trứng muỗi đẻ cùng một ngày (24 giờ) nhúng chìm trong khay chứa nước cất hoặc nước không có clo ở 25 ± 20C. Thức ăn của LQ là các mảnh protein như thức ăn chế biến sẵn cho cá, thỏ, gà. Cần cho thức ăn vừa đủ để vi khuẩn không phát triển mạnh quá (giết chết lăng quăng). Cho ăn nhiều lần cách quãng trong 1 2 ngày và quan sát mỗi ngày. Quần thể LQ đồng nhất L3 hoặc L4 (5 ngày tuổi và dài 4 5 mm) được thu hoạch (tương ứng 6 7 ngày sau khi trứng nở). Ở các liều gây nhiễm từ 4x102 mgl đến 5x103 mgl Bti chuẩn sau 24 giờ phơi nhiễm có hoạt tính diệt LQ cao (trên 99%) ở tất cả các liều gây nhiễm. Đối với Bti thử, tỷ lệ LQ chết tương ứng giảm dần từ 98,99% xuống 6,12% nên kết quả được xử lý để tính các giá trị LD50, LD90, LD99 của Bti thử. Ở liều gây nhiễm Bti chuẩn từ 4x103 mgl đến 5x104 mgl có tỷ lệ chết tương ứng giảm dần từ 94,91 % xuống 13,90 % nên kết quả được xử lý để tính các giá trị LD50, LD90 . Trong khi đó Bti thử có tỷ lệ LQ chết dưới 5% nên kết quả không được sử dụng để tính các giá trị LD50, LD90 . Tương tự ở liều 4x104 mgl đến 5x105 mgl của Bti vi chuẩn lẫn Bti thử đều có tỉ lệ LQ chết dưới 5%. Như vậy đã xây dựng được quy trình kiểm định công hiệu Bti gồm 3 bước cơ bản: 1) Tiêu chuẩn chọn LQ dùng trong thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti. 2) Quy trình gây nhiễm Bti trên LQ để xác định hàm lượng hoạt tính diệt LQ LD50, LD90, LD99 của Bti trong thí nghiệm. 3) Xác định công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti theo đơn vị độc tố quốc tế (ITUmg sản phẩm) và suy ra liều dự đoán của Bti áp dụng diệt LQ muỗi trên thử nghiệm thực địa. Quy trình này được áp dụng thành công vào kiểm định chế phẩm Bti do công ty TNHH sinh học Mai Việt sản xuất, đã tính được công hiệu diệt LQ của chế phẩm Bti có LD50 = 0,0148 mgl, LD90 = 0,0317 mgl; liều chết LD99 = 0,0589 mgl; liều dự đoán áp dụng ngoài thực địa là 0,1178 mgL; hàm lượng đơn vị độc tố quốc tế trong 1mg sinh phẩm Bti là 595,945 ITUmg. vii ABSTRACT The research project “Designing a process for testing the biological activity in killing mosquito larvae of biological products containing bacteria Bacillus thuringgiensis subsp. Israelensis (Bti), laboratory scale” was conducted in the Testing laboratory of Maivietbio Ltd., from June 2008 to August 2010. The objectives of the project were to complete the mosquito larvae breeding process based on the standard process of breeding the mosquito A. aegypti adopted at Pasteur Institute; determine the lethal doses LD50, LD90, LD99 of standard Bti and sampling Bti; determine the efficacy in killing mosquito larvae of sampling Bti biological products based on international toxic units (ITUmg); and find out the expected doses of sampling Bti to kill mosquito larvae in field tests. Results showed that Pasteur Institute’s standard mosquito breeding process could provide sameage mosquito larvae by immersing paper tapes containing mosquito eggs laid on the same day (24 hours) in a tray of distilled water or chlorineless water at 25 ± 20C. The food for mosquito larvae was protein fragments, such as processed food for fish, rabbits, and chickens. It was important to provide just enough food so that the bacteria would not develop too fast (and kill the mosquito larvae). The larvae were fed many times a day at regular intervals, for 12 days, and observed daily. Homogeneous populations of mosquito larvae L3 or L4 (5dayold and 45 mm long) were collected (67 days respectively after hatching). After 24 hours of exposure, all infected doses from 4x102 mgl to 5x103 mgl of standard Bti showed high activities in killing mosquito larvae (over 99%). As for sampling Bti, the corresponding death rates of mosquito larvae gradually declined from 98,99% to 6,12%. The results were subsequently processed to calculate the value of lethal doses LD50, LD90, LD99 of sampling Bti. With standard Bti infected doses from 4x104 mgl to 5x105 mgl, the death rates of mosquito viii larvae decreased from 94,91% to 13,90%, so the results were processed to calculate the value of LD50, LD90. As for sampling Bti, the corresponding death rates of mosquito larvae were under 5%, so the results were not used to calculate the value of LD50, LD90. Similarly, with doses of 4x104 mgl to 5x105 mgl of both standardized Bti and sampling Bti, the death rates of mosquito larvae were under 5%. The project as such established a process for testing Bti efficacy consisting of 3 basic steps: 1) selecting mosquito larvae used in experimental tests of Bti products, based on definite criteria 2) infecting mosquito larvae with Bti to determine its level of biological activity in killing mosquito larvae LD50, LD90, LD99 in experiments. 3) determining the mosquito larvae killing efficacy of Bti biological products in terms of international toxic units, and deriving predicted doses of Bti applied to kill mosquito larvae in field tests. This process was successfully applied to test Bti products of Maivietbio Ltd. The proven mosquito larvae killing efficacy of these Bti products is: LD50 = 0,0148 mgl, LD90 = 0,0317 mgl; lethal dose LD99 = 0,0589 mgl. The predicted dose for field tests is 0,1178mgl. The content of ITU in 1mg of Bti product is 595,945 ITUmg. ix MỤC LỤC Trang LÝ LỊCH CÁ NHÂN ..............................................................................................1 LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................. iii Lời cảm ơn .............................................................................................................iv TÓM TẮT...............................................................................................................v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................xi DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ.............................................................xii DANH SÁCH CÁC BẢNG..................................................................................xiv Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG.........................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................1 1.2. Mục tiêu chung và mục tiêu cụ thể...................................................................3 1.2.1. Mục tiêu chung ..............................................................................................3 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ..............................................................................................4 Chương 2 TỔNG QUAN.......................................................................................5 2.1. Giới thiệu chung ...............................................................................................5 2.1.1. Chế phẩm vi sinh diệt lăng quăng ..................................................................5 2.1.2. Muỗi..............................................................................................................5 2.1.3. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis H 14 ....................................8 2.2. WHOPES và chế phẩm vi sinh Bacillus thuringiensis var. israelensis H 14 diệt LQ muỗi........................................................................................................12 2.2.1. Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc Bti trên thế giới ........................................13 2.2.2. Sử dụng Bti tại Việt Nam.............................................................................16 2.3. Tình hình nghiên cứu Bti tại Việt Nam ...........................................................16 2.4. Các phòng thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti...............................................17 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................18 3.1. Thời gian và địa điểm .....................................................................................18 3.1.1. Thời gian .....................................................................................................18 x 3.1.2. Địa điểm ......................................................................................................18 3.2. Vật liệu và trang thiết bị .................................................................................18 3.2.1. Vật liệu ........................................................................................................18 3.2.2. Trang thiết bị ...............................................................................................20 3.3. Nội dung.........................................................................................................21 3.4. Mô tả thí nghiệm ............................................................................................22 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................29 4.1. Kết quả ...........................................................................................................29 4.1.1. Tiêu chuẩn chọn LQ (LQ) A. aegypti dùng trong thí nghiệm........................29 4.1.2 Tỉ lệ LQ hoá nhộng sau 24 giờ phơi nhiễm Bti chuẩn và Bti thử...................35 4.1.3. Quy trình gây nhiễm Bti trên LQ và tính tỷ lệ LQ chết sau 24 giờ phơi nhiễm ứng với các liều của sản phẩm Bti chuẩn và Bti thử ....................................37 4.1.4 Xác định các liều chết LD50, LD90, LD99 của Bti trong thí nghiệm...............41 4.1.5 Cách tính công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti thử theo đơn vị độc tố quốc tế (ITUmg) và xác định liều dự đoán của Bti thử để áp dụng thử nghiệm diệt LQ muỗi trên thực địa .............................................................47 4.2. Một số nhận xét và bàn luận ...........................................................................48 Chương 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................51 5.1. Kết luận ..........................................................................................................51 5.2. Đề nghị...........................................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................53 PHỤ LỤC..............................................................................................................56 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  ASEAN: Association of Southeast Asia Nations  Bti: Bacillus thuringiensis var. israelensis  PRMA: Canadas Pest Management Regulatory Agency  Công ty TNHH: Công ty trách nhiệm hữu hạn  EPA: Environmental Protection Agency  ITU: International Toxic Units  LC: Lethal Concentration  LD: Lethal Dose  LQ: Lăng quăng  PTN: Phòng thí nghiệm  WHO: World Heath Organization  WHOPES: WHO Pesticide Evaluation Scheme xii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Trang Hình 2.1 Một số loại LQ muỗi ................................................................................6 Hình 2.2 Vòng đời muỗi ........................................................................................7 Hình 2.3 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis: .....................................10 Hình 2.4 Hình ảnh minh họa cơ chế diệt LQ của Bti .............................................11 Biểu đồ 2.1. Hiệu quả về chỉ số LQ trước và sau giám sát bởi Bti (2004)..............13 Biểu đồ 2.2. Hiệu quả về chỉ số LQ trước và sau giám sát bởi Bti (2005)..............14 Hình 2.5. Trực thăng rải Bti ..................................................................................14 Hình 2.6. Các vùng ngập sau tuyết tan vào mùa xuân và vùng nước đọng vào mùa hè được chọn để dùng Bti ở Norfolk. .......................................................15 Hình 3.1. Chế phẩm Bti MOSQUITO BITS..........................................................19 Hình 3.2. Chế phẩm vi sinh Bti TN06 sản xuất tại Công ty TNHH SH Mai Việt...20 Hình 4.1 Nuôi muỗi tại Phòng Côn trùng y học viện Pasteur Tp HCM .................30 Hình 4.2 Nuôi LQ thí nghiệm Bti theo quy trình của Viện Pastuer........................31 Hình 4.3 Quần thể LQ không đồng đều về tuổi ....................................................31 Hình 4.4 Băng giấy có trứng muỗi chuẩn bị ngâm nước cho ấp nở thu LQ............32 Hình 4.5 Băng giấy có trứng muỗi ngâm nước cho ấp nở thu LQ..........................32 Hình 4.6 Chọn LQ làm thí nghiệm .......................................................................33 Hình 4.7 Quần thể LQ A. aegypti .........................................................................34 Hình 4.8 LQ A. aegypti phân theo theo tuổi (L1: LQ tuổi 1; L2: LQ tuổi 2; L3: LQ tuổi 3; L4: LQ tuổi 4).........................................................................35 Biểu đồ 4.1 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ 4x102 – 5x103 mgl (lần 1).....................................................................42 Biểu đồ 4.2 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ 4x102 – 5x103 mgl (lần 2).....................................................................43 Biểu đồ 4.3 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ 4x102 – 5x103 mgl (lần 3).....................................................................44 xiii Biểu đồ 4.4. Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti chuẩn ở các liều gây nhiễm từ 4x103 – 5x 104 mgl (lần 1)...................................................................45 Biểu đồ 4.5 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti chuẩn ở các liều gây nhiễm từ 4x103 – 5x 104 mgl (lần 2) .....................................................................46 Biểu đồ 4.6 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti chuẩn ở các liều gây nhiễm từ 4x103 – 5x 104 mgl (lần 3) .....................................................................47 xiv DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Phân loại gen Cry theo giải trình tự ........................................................12 Bảng 3.1. Tóm tắt bố trí thí nghiệm.......................................................................26 Bảng 4.1. Tỷ lệ LQ hoá nhộng trong các thí nghiệm gây nhiễm Bti ......................36 Bảng 4.2 Tỷ lệ chết của LQ sau 24g phơi nhiễm với Bti từ 4x102 đến 5x103 mgl 38 Bảng 4.3 Tỷ lệ chết của LQ sau 24g phơi nhiễm với Bti từ 4x103 đến 5x104mgl39 Bảng 4.4 Tỷ lệ chết của LQ sau 24g phơi nhiễm với Bti từ 4x104 đến 5x105 mgl 40 Bảng 4.5 Tóm tắt kết quả xử lý LQ với các liều Bti từ 4x102 đến 5x105 mgl ......40 Bảng 4.6 Các giá trị LD của Bti chuẩn và Bti thử..................................................41

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ….  … HỒ THỊ ÁNH TUYẾT XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var israelensis QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng / 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ….  … HỒ THỊ ÁNH TUYẾT XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var israelensis QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hướng dẫn khoa học: TS BS HỒ THỊ HỒNG NHUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2010 ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Hồ Thị Ánh Tuyết Sinh ngày 05 tháng 12 năm 1963 tỉnh Thái Nguyên Con Ông Hồ Văn Duyệt Bà Nguyễn Thị Ninh Tốt nghiệp tú tài trường Trung học phổ thông Trần Quốc Tuấn, thành phố Quảng Ngãi, tỉnh Quảng Ngãi, năm 1981 Tốt nghiệp đại học ngành Dâu tằm, hệ đại học quy Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, năm 1986 Hiện cơng tác phòng Cơng tác Học sinh - Sinh viên trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh Tháng năm 2006 trúng tuyển theo học cao học ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Tình trạng nhân: Lập gia đình, năm kết hơn: 1987 Họ tên chồng: Đinh Thành Ngân Các con: Đinh Nhật Huy sinh năm 1988 Đinh Bảo Huy, sinh năm 1991 Địa liên lạc: Phòng Cơng tác Học sinh - Sinh viên trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP Hồ Chí Minh, số 01 Võ Văn Ngân, Thủ Đức, Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: (08) 38 999 866 Email: tuyethta@hcmute.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Hồ Thị Ánh Tuyết iii Lời cảm ơn Tôi xin chân thành cám ơn - Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp Hồ Chí Minh - Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Giáo sư, Giảng viên CBVC phòng Sau Đại học, Bộ môn Công nghệ Sinh học Đã tạo điều kiện cho tơi tham gia khố học, tận tâm truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm chuyên sâu thuộc chuyên ngành theo học nghiên cứu, góp ý, chỉnh sửa đề tài, giúp đề tài thực tốt - Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh, Phòng Nghiên cứu thử nghiệm trùng y học, Khoa Dịch tễ học, nhà nghiên cứu cộng tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cung cấp đầy đủ vật liệu ấu trùng muỗi thí nghiệm với chất luợng chuẩn thức suốt trình thực đề tài - Ban Giám đốc Công ty TNHH Sinh học Mai Việt tạo điều kiện tốt cho tơi sử dụng phòng thí nghiệm, trang thiết bị thực đề tài - TS BS Hồ Thị Hồng Nhung hướng dẫn khoa học - Cùng toàn thể đồng nghiệp, anh chị em Trường, Viện, Công ty Sinh học Mai Việt giúp tơi hồn thành cơng việc nghiên cứu khố học - Gia đình nhiều bạn bè thân hữu cổ vũ động viên Xin chân thành cảm ơn Hồ Thị Ánh Tuyết iv TĨM TẮT Đề tài: “Xây dựng quy trình kiểm tra hoạt tính sinh học diệt LQ chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) quy mơ phòng thí nghiệm” tiến hành phòng Kiểm nghiệm Cơng ty TNHH Sinh học Mai Việt từ tháng 6/2008 đến tháng 8/2010 Mục tiêu đề tài hồn chỉnh qui trình ni LQ A aegypti từ qui trình chuẩn ni muỗi Viện Pasteur; xác định liều gây chết LD50, LD90, LD99 Bti chuẩn Bti thử; xác định công hiệu diệt LQ chế phẩm vi sinh Bti thử theo đơn vị độc tố quốc tế mg sinh phẩm (ITU/mg) suy liều dự đoán Bti thử áp dụng diệt LQ muỗi thực địa Kết cho thấy từ qui trình chuẩn ni muỗi Viện Pasteur cung cấp LQ tuổi cách lấy băng giấy mà trứng muỗi đẻ ngày (24 giờ) nhúng chìm khay chứa nước cất nước khơng có clo 25 ± 20C Thức ăn LQ mảnh protein thức ăn chế biến sẵn cho cá, thỏ, gà Cần cho thức ăn vừa đủ để vi khuẩn không phát triển mạnh (giết chết lăng quăng) Cho ăn nhiều lần cách quãng - ngày quan sát ngày Quần thể LQ đồng L3 L4 (5 ngày tuổi dài - mm) thu hoạch (tương ứng ngày sau trứng nở) Ở liều gây nhiễm từ 4x10-2 mg/l đến 5x10-3 mg/l Bti chuẩn sau 24 phơi nhiễm có hoạt tính diệt LQ cao (trên 99%) tất liều gây nhiễm Đối với Bti thử, tỷ lệ LQ chết tương ứng giảm dần từ 98,99% xuống 6,12% nên kết xử lý để tính giá trị LD 50, LD90, LD99 Bti thử Ở liều gây nhiễm Bti chuẩn từ 4x10-3 mg/l đến 5x10-4 mg/l có tỷ lệ chết tương ứng giảm dần từ 94,91 % xuống 13,90 % nên kết xử lý để tính giá trị LD 50, LD90 Trong Bti thử có tỷ lệ LQ chết 5% nên kết khơng sử dụng để tính giá trị LD50, LD90 Tương tự liều 4x10-4 mg/l đến 5x10-5 mg/l Bti v chuẩn lẫn Bti thử có tỉ lệ LQ chết 5% Như xây dựng quy trình kiểm định cơng hiệu Bti gồm bước bản: 1) Tiêu chuẩn chọn LQ dùng thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti 2) Quy trình gây nhiễm Bti LQ để xác định hàm lượng hoạt tính diệt LQ LD50, LD90, LD99 Bti thí nghiệm 3) Xác định cơng hiệu diệt LQ chế phẩm vi sinh Bti theo đơn vị độc tố quốc tế (ITU/mg sản phẩm) suy liều dự đoán Bti áp dụng diệt LQ muỗi thử nghiệm thực địa Quy trình áp dụng thành công vào kiểm định chế phẩm Bti công ty TNHH sinh học Mai Việt sản xuất, tính cơng hiệu diệt LQ chế phẩm Bti có LD50 = 0,0148 mg/l, LD90 = 0,0317 mg/l; liều chết LD99 = 0,0589 mg/l; liều dự đoán áp dụng thực địa 0,1178 mg/L; hàm lượng đơn vị độc tố quốc tế 1mg sinh phẩm Bti 595,945 ITU/mg vi ABSTRACT The research project “Designing a process for testing the biological activity in killing mosquito larvae of biological products containing bacteria Bacillus thuringgiensis subsp Israelensis (Bti), laboratory scale” was conducted in the Testing laboratory of Maivietbio Ltd., from June 2008 to August 2010 The objectives of the project were to complete the mosquito larvae breeding process based on the standard process of breeding the mosquito A aegypti adopted at Pasteur Institute; determine the lethal doses LD 50, LD90, LD99 of standard Bti and sampling Bti; determine the efficacy in killing mosquito larvae of sampling Bti biological products based on international toxic units (ITU/mg); and find out the expected doses of sampling Bti to kill mosquito larvae in field tests Results showed that Pasteur Institute’s standard mosquito breeding process could provide same-age mosquito larvae by immersing paper tapes containing mosquito eggs laid on the same day (24 hours) in a tray of distilled water or chlorineless water at 25 ± 20C The food for mosquito larvae was protein fragments, such as processed food for fish, rabbits, and chickens It was important to provide just enough food so that the bacteria would not develop too fast (and kill the mosquito larvae) The larvae were fed many times a day at regular intervals, for 1-2 days, and observed daily Homogeneous populations of mosquito larvae L3 or L4 (5-day-old and 4-5 mm long) were collected (6-7 days respectively after hatching) After 24 hours of exposure, all infected doses from 4x10-2 mg/l to 5x10-3 mg/l of standard Bti showed high activities in killing mosquito larvae (over 99%) As for sampling Bti, the corresponding death rates of mosquito larvae gradually declined from 98,99% to 6,12% The results were subsequently processed to calculate the value of lethal doses LD50, LD90, LD99 of sampling Bti With standard Bti infected doses from 4x10-4 mg/l to 5x10-5 mg/l, the death rates of mosquito vii larvae decreased from 94,91% to 13,90%, so the results were processed to calculate the value of LD50, LD90 As for sampling Bti, the corresponding death rates of mosquito larvae were under 5%, so the results were not used to calculate the value of LD50, LD90 Similarly, with doses of 4x10-4 mg/l to 5x10-5 mg/l of both standardized Bti and sampling Bti, the death rates of mosquito larvae were under 5% The project as such established a process for testing Bti efficacy consisting of basic steps: 1) selecting mosquito larvae used in experimental tests of Bti products, based on definite criteria 2) infecting mosquito larvae with Bti to determine its level of biological activity in killing mosquito larvae LD50, LD90, LD99 in experiments 3) determining the mosquito larvae killing efficacy of Bti biological products in terms of international toxic units, and deriving predicted doses of Bti applied to kill mosquito larvae in field tests This process was successfully applied to test Bti products of Maivietbio Ltd The proven mosquito larvae killing efficacy of these Bti products is: LD50 = 0,0148 mg/l, LD90 = 0,0317 mg/l; lethal dose LD99 = 0,0589 mg/l The predicted dose for field tests is 0,1178mg/l The content of ITU in 1mg of Bti product is 595,945 ITU/mg viii MỤC LỤC Trang LÝ LỊCH CÁ NHÂN LỜI CAM ĐOAN iii Lời cảm ơn .iv TÓM TẮT .v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ xii DANH SÁCH CÁC BẢNG xiv Chương GIỚI THIỆU CHUNG .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu chung mục tiêu cụ thể 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Chương TỔNG QUAN .5 2.1 Giới thiệu chung .5 2.1.1 Chế phẩm vi sinh diệt lăng quăng 2.1.2 Muỗi 2.1.3 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis H 14 2.2 WHOPES chế phẩm vi sinh Bacillus thuringiensis var israelensis H 14 diệt LQ muỗi 12 2.2.1 Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc Bti giới 13 2.2.2 Sử dụng Bti Việt Nam 16 2.3 Tình hình nghiên cứu Bti Việt Nam 16 2.4 Các phòng thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti .17 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Thời gian địa điểm .18 3.1.1 Thời gian .18 ix 71 Phụ lục Bảng kết xử lý thống kê mức LD Bti thử đậm độ gây nhiễm 10 mg/l lần II (4x10-2 đến 5x10-3 mg/l) 72 73 Phụ lục 10 Bảng kết xử lý thống kê mức LD Bti thử ở đậm độ gây nhiễm 10 mg/l lần III (4x10-2 đến 5x10-3 mg/l) 74 75 Phụ lục 11 Bảng kết xử lý thống kê tính mức LD Bti chuẩn đậm độ gây nhiễm 1mg/l lần I (4x10-3 đến 5x10-4 mg/l) 76 77 Phụ lục 12 Bảng kết xử lý thống kê tính mức LD Bti chuẩn đậm độ gây nhiễm mg/l lần II (4x10-3 đến 5x10-4 mg/l) 78 79 Phụ lục 13 Bảng kết xử lý thống kê tính mức LD Bti chuẩn đậm độ gây nhiễm mg/l lần III (4x10-3 đến 5x10-4 mg/l) 80 81 Phụ lục 14 Tên loại thương phẩm chứa Bti lưu hành Mỹ Tên sản phẩm đăng ký Tên nhãn bao bì Số đăng ký (U.S EPA Reg No.) Bactimos granules Bactimos granules 73049-52 Bactimos pellets Bactimos pellets 73049-51 Bmp (144 200 g) Acrobe mosquito biolarvicide granule Bmp (144 200 g) Bayer advanced garden mosquito preventer readyto-use granules 62637-3 62637-3 Sản phẩm Tên nhà máy sản xuất Mỹ (U.S (Manufacturer Name) Product Tên nhà phân phối Reg Status) (Distributor Name) 1.Valent biosciences Đang lưu corporation hành (Active) Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Active Valent biosciences corporation 2.Becker microbial Active products inc Basf corporation Active Bmp (144 200 g) Bmp (144 200 g) 62637-3 Active Bmp (144 200 g) Dexol mosquito free granules 62637-3 Active Bmp (144 200 g) Dexol ready-to-use mosquito free granules 62637-3 Active Bmp (144 200 g) Green thumb ready-to -use 62637-3 mosquito free granules insecticide Bmp (144 200 g) Healthy ponds mosquito 62637-3 control, aqua-force mosquito control, maccourt 82 Becker microbial products inc Bayer advanced Becker microbial products inc Becker microbial products inc Becker microbial products inc Value gardens supply, llc Becker microbial products inc Value gardens supply, llc Active Becker microbial products inc Truserv corporation Active Becker microbial products inc Bioverse, inc Bmp (144 200 g) Sentry-mosquito biolarvicide granule 62637-3 Active Bmp 144 (2x) Acrobe(tm) biolarvicide 62637-1 Active Bmp 144 (2x) Bmp 144 (2x) 62637-1 Active Bmp 144 (2x) Microbe-lift bmc 62637-1 Active Bmp 144 (3x) Bmp 144 (3x) 62637-2 Active Bmp 144 (400 g) Bmp 144 (400 g) 62637-13 Active Bmp 144df 3000 Bmp 144df 3000 62637-14 Active Bonide mosquito beater wsp Bonide mosquito beater wsp Bonide mosquito beater wsp Mosquito depth charges water soluble pouches Bti granule larvicide Bti granule larvicide Bti granule larvicide No-squito! mosquito bioinsecticide Becker microbial products inc Cleary chemical corporation Becker microbial products inc Basf corporation Becker microbial products inc Becker microbial products inc Becker microbial products inc Ecological laboratories, inc Becker microbial products inc Becker microbial products inc Becker microbial products inc Becker microbial products inc Becker microbial products inc Becker microbial products inc Active Bonide products, inc Bonide products, inc 4-455 Active Bonide products, inc Drummond american corporation 70051-102 Active Certis usa, llc Certis usa, llc 70051-102 Active Certis usa, llc Gardens alive! inc 4-455 83 8329-39 Active Clarke mosquito control products inc Clarke mosquito control products inc 9688-212 Active Chemsico Chemsico 9688-212 Active Chemsico Spectrum group 81045-1 Active Plant defense boosters, inc Plant defense boosters, inc 69504-1 Active Meridian, llc Meridian, llc 6218-47 Active 6218-47 Active 6218-47 Active 6218-47 Active 6218-73 Active Teknar g Teknar g 73049-403 Active Teknar hp-d Teknar hp-d 73049-404 Active Bti granules Bti granules Chemsico insect granules ml Chemsico insect granules ml Chemsico insect granules ml Spectracide mosquito stop mosquito larvae killer Healthy outdoors brand sustained release mosquito larvicide Healthy outdoors brand sustained release mosquito larvicide Prehatch (tm) sg biological larvicide sand granules Prehatch (tm) sg biological larvicide sand granules Summit b.t.i briquets Anti-mos briquets Summit b.t.i briquets Brazos matalarva 10 Summit b.t.i briquets Moskeeto(tm) biological mosquito control briquets Summit b.t.i briquets Summit b.t.i briquets Summit mosquito bits Summit mosquito bits 84 Summit chemical co Allied chemicals Summit chemical co Brazos international inc Summit chemical co Pbi/gordon corp Summit chemical co Summit chemical co Summit chemical co Summit chemical co Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Teknar tech tc Teknar tech tc 73049-408 Active V60035 cg V60035 cg 73049-429 Active Vectobac - as Knock-out gnats 73049-11 Active Vectobac - as Vectobac - as 73049-11 Active Vectobac biological larvicide primary powder 73049-355 Vectobac biological larvicide primary powder Vectobac-12as-ii biological larvicide 73049-18 Vectobac-12as-ii biological larvicide 85 Active Active Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Gardens alive! inc Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation Valent biosciences corporation ... tài: Xây dựng quy trình kiểm tra hoạt tính sinh học diệt LQ chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) quy mơ phòng thí nghiệm tiến hành phòng Kiểm nghiệm. .. lượng để sản phẩm tương đương nhập ngoại Xây dựng quy trình kiểm tra hoạt tính sinh học diệt LQ chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis quy mô phòng thí nghiệm đề... TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ….  … HỒ THỊ ÁNH TUYẾT XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var israelensis