Nghiên cứu sử dụng nước thải thủy sản để nuôi chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis tạo chế phẩm sinh học diệt ấu trùng muỗi

israelensis khi nuôi cấy trên môi trường nước thải có khả năng diệt ấu trùng muỗi cao tại nồng độ 104 bào tử/ml.. israelensis có thể sinh trưởng và phát triển tốt trên một số môi trường

TÓM TẮT

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát 3 vấn đề sau: Tối ưu hai yếu tố

là pH nuôi cấy và độ pha loãng của nước thải Surimi để nuôi cấy Bacillus thuringensis var israelensis Quan sát, so sánh hình thái tế bào vi khuẩn khi nuôi

trên môi trường này với nuôi trên môi trường chọn lọc GYS (Glucose-Men-Muối)

Cuối cùng là khảo sát hoạt lực diệt ấu trùng muỗi của bào tử vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis sau khi nuôi cấy trên môi trường nước thải Kết quả

cho thấy: Hình thái tế bào vi khuẩn khi nuôi trên hai môi trường không có sự khácbiệt Ở pH = 6,7, độ pha loãng của nước thải = 1/2 và thời gian nuôi 30 giờ lượng

sinh khối vi khuẩn nuôi cấy đạt giá trị lớn nhất Bào tử vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis khi nuôi cấy trên môi trường nước thải có khả năng

diệt ấu trùng muỗi cao tại nồng độ 104 (bào tử/ml)

ABSTRACT

In this project, we investigated three problems: optimal two elements cultured

pH and the dilution of wastewater fishery Surimi cultured Bacillus var israelensis.

Comparing the bacterial cell morphology when cultured on medium wastewaterSurimi with cultured on selective medium GYS (Glucose-Yeast-Salt) We

investigated degree of activity kill mosquito larvae of spores Bacillus thuringensis var israelensis The results show that: Morphology of bacterial cells when cultured

on two culture medium no the differences At pH = 6,7, the dilution of waste water

= 1/2 and 30 hour of cultivation to reach maximum biomass Spores of Bacillus thuringensis var israelensis has the ability to kill mosquito larvae in high

concentrations 104 (spores/ml)

LỜI MỞ ĐẦU

Muỗi là côn trùng truyền nhiều bệnh rất nguy hiểm Các bệnh sốt rét, sốt xuấthuyết, sốt vàng da, viêm não Nhật Bản, giun chỉ, sùi chân voi, … do muỗi truyền đã

và đang đe dọa sinh mạng của hàng triệu người [21, 22, 30]

Việt Nam có khí hậu thích hợp cho nhiều loài muỗi truyền bệnh sinh trưởng vàphát triển Để diệt muỗi, một biên pháp phổ biến là dùng thuốc diệt muỗi hóa học.Tuy nhiên, việc sử dụng này đã có hiện tượng kháng thuốc, ô nhiễm môi trường vàgây hại đối với côn trùng có ích [7, 12, 17, 22] Do vậy biện pháp an toàn và hiệu

quả nhất là sử dụng chế phẩm sinh học diệt ấu trùng muỗi từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) [8] Bti đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới

hơn 20 năm nay nhưng vẫn chưa có một báo cáo nào về sự xuất hiện tính kháng [21,30] Hiện nay Bti được sử dụng rộng rãi trên thế giới với các dạng chế phẩm thươngmại Vecto Bac, Teknac, … Tuy nhiên giá của các loại chế phẩm này còn tương đốicao so với nền kinh tế của nước ta

Những nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng, vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis có thể sinh trưởng và phát triển tốt trên một số môi trường như nước thải

của nhà máy tinh bột sắn, nước thải từ lò giết mổ, … [4, 5] Những nghiên cứu này

có ý nghĩa to lớn vừa có thể tận dụng được nguồn nước thải của các nhà máy chếbiến thực phẩm, giảm chi phí xử lí đồng thời nuôi cấy vi sinh vật tạo ra chế phẩmsinh học diệt trừ được ấu trùng muỗi

Ngành công nghiệp chế biến thủy sản phát triển, đem lại nhiều lợi ích to lớntrong việc phát triển kinh tế của vùng Tuy nhiên chất thải ngành thủy sản sẽ tácđộng nghiêm trọng đến môi trường đặc biệt là môi trường đất, nước [3]

Với mong muốn tìm ra một nguồn nguyên liệu sẵn có đồng thời tận dụng được

phần nào nguồn nước bị ô nhiễm vào mục đích nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis từ đó sản xuất ra chế phẩm diệt trừ ấu trùng muỗi Em

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng nước thải thủy sản để nuôi chủng vi khuẩn

Bacillus thuringiensis var israelensis tạo chế phẩm sinh học diệt ấu trùng muỗi ”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.1.1 Tóm tắt về lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis

Lịch sử về Bacillus thuringiensis bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện thấy một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm, ông đặt tên là Bacillus bombyces.

Năm 1901, Ishiwata phân lập ra một loại vi khuẩn từ ấu trùng tằm bị bệnh và đặt tên

là Bacillus sotto Năm 1911 Berliner đã phân lập được một loại vi khuẩn tương tự

từ xác ấu trùng bướm Địa Trung Hải Đến năm 1915 vi khuẩn này chính thức mang

tên Bacillus thuringiensis [14]

Năm 1928, Huszddax phân lập chủng Bacillus thuringiensis (Bt) từ Ephestia,

thử nghiệm nó trên sâu đục thân ngô ở Châu Âu, đây được coi là ứng dụng đầu tiên

của Bacillus thuringiensis Chế phẩm thương mại đầu tiên, Sporeine, được sản xuất

ở Pháp năm 1938 Năm 1951 - 1956 Steinhaus nghiên cứu khả năng diệt côn trùng

của Bacillus thuringiensis và đã được sản xuất ở Mỹ Trong suốt những năm 1960,

lần lượt các chế phẩm thương mại của Bt đã được sản xuất ở nhiều nơi như Mỹ,Pháp, Đức, … với quy mô khác nhau Sau đó Howard Dulmage và Clayton Beeslecủa viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA đã thu thập được bộ sưu tầm đầu tiên vềcác chủng Bt Năm 1970, Dulmage đã phân lập được chủng HD - 1 và đến nay vẫnđược sử dụng cho nhiều nghiên cứu và sản xuất chế phẩm Bt Thập niên 80, nhiềucông ty sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh đã đăng ký sản xuất và kinh doanh các chếphẩm Bt Đầu những năm 90 tại một số quốc gia như Cuba, Trung Quốc, Mỹ đã sảnxuất chế phẩm Bt ở quy mô công nghiệp Ngày nay một số lượng lớn thương phẩmtrừ sâu sinh học Bt được sử dụng trong việc kiểm soát ấu trùng bộ cánh vẩy, haicánh và cánh cứng [15]

1.1.2 Đặc điểm sinh thái và sinh hóa của Bacillus thuringiensis

Đặc điểm sinh thái

Bacillus thuringiensis là thành viên của nhóm I, chi Bacillus Đây là loại vi

khuẩn Gram dương, sinh bào tử, hô hấp hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc Tếbào có kích thước 3 x 6 µm, có phủ tiêm mao không dày, có khả năng di động, tếbào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi

Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi như thiếu

dinh dưỡng, nhiệt độ cao, khô hạn… Bt có khả năng sinh nội bào tử giúp cho chúngchống chịu với điều kiện khắc nghiệt đó Bào tử của vi khuẩn có dạng hình trứngvới kích thước 1, 5 x 2 µm và có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng khi có điềukiện thuận lợi

Sự hình thành bào tử diễn ra đồng thời với sự tạo thành protein tinh thể có khảnăng diệt côn trùng Tinh thể có nhiều hình dạng khác nhau (hình vuông, chữ nhật,hình tháp, hình ôvan hoặc vô định hình) Khi tế bào phân giải tinh thể và bào tửđược giải phóng ra ngoài Tinh thể có kích thước khoảng 0,6 x 0,2 µm, và có thểchiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào Tinh thể này được gọi là thể vùi Tinhthể và bào tử có thể quan sát dưới kính hiển vi đối pha ở vật kính dầu Tinh thể bắtmàu sẫm còn bào tử không bắt màu nhưng có mép sáng Hình dạng của tinh thểđược quyết định bởi gen mã hoá cho tổng hợp protein của tinh thể nằm trênplasmid [3]

Hình 1.1: Tinh thể độc của Bt dưới kình hiển vi điện tử [25]

Đặc điểm sinh hoá

Đa số Bacillus thuringiensis không lên men sinh axít đối với arabinoza,

xiloza, và manitol, khử nitơrat thanh nitơrit, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà, pháttriển được trong môi trường thạch kị khí có chứa 1% lizozym Sinh trưởng tốtnhất ở nhiệt độ 28 - 300C, pH = 6,8 - 7,2 [26]

1.1.3 Phân loại Bacillus thuringiensis

Bt được chia làm nhiều loại phụ dựa trên các đặc điểm sau:

+ Khả năng hình thành enzyme leucitinase

+ Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng

1.1.4 Sự phân bố của Bacillus thuringensis

Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá, ở đất

rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trường có điều kiện thuận lợi cho sâu bọ pháttriển như bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản ngũ cốc…Sựphân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích Tuy nhiên, Btthường có xu hướng tồn tại nhiều trong môi trường có nhiều sâu bọ phát triển vàgiàu dinh dưỡng Có thể phân lập Bt từ nhiều loại môi trường khác nhau Bt dễ dàngphát triển trong môi trường thí nghiệm chỉ với một lượng tối thiểu chất dinh dưỡng.Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhưng chúng không nảy mầm và nhânlên như các tế bào sinh dưỡng trong đất tự nhiên Điều này chứng tỏ rằng Bt khôngthích nghi với môi trường đất [14]

1.2 Tìm hiểu về loài Bacillus thuringensis var israelensis (Bti)

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu

Bacillus thuringensis được chia làm nhiều loài phụ Theo bộ sưu tập của trung tâm Bacillus diệt côn trùng Quốc tế, Viện Pastuer Paris năm 1996, đã có tới hơn 69 loài phụ khác nhau như: cánh vẩy, cánh cứng, hai cánh, ở một số loài phụ Bacillus thuringensis var berliner, Bacillus thuringensis var thompsoni…

Khác với loài Bacillus thuringensis, loài phụ Bacillus thuringensis var israelensis mới được phát hiện gần đây Loài phụ này có tác dụng diệt ấu trùng

muỗi Các nhà khoa học Goldberg, Margarit là nhưng người đầu tiên phân lập,

nghiên cứu loài vi khuẩn này và De Bajac đặt tên cho là Bacillus thuringensis var israelensis Họ đã phân lập và nuôi cấy, thử hoạt lực diệt ấu trùng muỗi với hàng

trăm chủng khác nhau Tuy nhiên chỉ có một số chủng có hoạt lực diệt các loài

muỗi Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và Anopheles sergentti…

Chủng đầu tiên đó được kí hiệu là ORN - 60A và thuộc typ huyết thanh H14…

Ngày nay đã có rất nhiều chủng Bacillus thuringensis var israelensis được tìm thấy

và được phân loại làm phong phú thêm bộ sưu tập về Bacillus diệt côn trùng Các

chủng thường được sử dụng trong việc sản xuất chế phâm sinh học diệt muỗi vớicác tên gọi khác nhau: Bactimos, Skeetam, Vectobac…chế phẩm dạng lỏng dạngbột thấm nước, dạng viên, bánh nổi có tác dụng diệt ấu trùng của nhiều loài ruồi

muỗi trong đó có loài Aedes Aegypti Chế phẩm Bacillus thuringensis var israelensis có tác dụng tốt trong môi trường nước sạch, nước có nồng độ muối

loãng và được Tổ chức Y tế thế giới lựa chọn để diệt trừ các vectơ truyền bệnh sốtrét, sốt xuất huyết ở các nước nhiệt đới [21, 28]

1.2.2 Đặc điểm sinh học của Bacillus thuringiensis var israelensis

- Trực khuẩn, kích thước 1-1,2 x 3-5 µm

- Phủ tiêm mao, di chuyển được, Gram +

- Sinh bào tử hình trứng dài, kích thước 1,6 – 2 µm

- Hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc

- Nhiệt độ sinh trưởng 15º - 45ºC

- Phổ biến trong tự nhiên, cư trú trong đất, trên bề mặt cây và trên xác sâu

- Tạo ra tinh thể protein trong giai đoạn tạo bào tử, kích thước 0,6 – 2 µm.Bản chất là protein [14].

Hình 1.2: Hình dạng dưới kính hiển vi và khuẩn lạc của vi khuẩn

Bacillus thuringensis var israelensis [27]

1.2.3 Đặc điểm phân loại

Bacillus thuringensis var israelensis là loài phụ của loài Bacillus thuringensis De Bajac là người đầu tên phân loại loài phụ Bacillus thuringensis var israelensis thuộc typ huyết thanh H14 Tuy nhiên vào năm 1988, Ohba và

Aiawa (Nhật Bản) đã phân lập được hai chủng Bacillus thuringensis thuộc typ

huyết thanh H14 nhưng lại không có hoạt lực diệt muỗi, ruồi đen Trước đó (năm1982) Pachun và cộng sự đã phân lập được chủng PG - 14 thuộc typ huyết thanh

H8A, B có hoạt lực cao đối với ấu trùng muỗi Aedes Aegypti, Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và Anopheles sergentti…

Do đó nếu chỉ dựa trên đặc điểm typ huyết thanh thì không thể đảm bảo đượcphân loại một cách chính xác mà phải dựa trên những đặc điểm khác nhau như lớpCry, thành phần và hình dạng protein tinh thể Hofte và Whiteley là những người

đầu tiên đưa ra ý tưởng phân loại Bacillus thuringensis var israelensis dựa trên sự

kết hợp của tất cả các đặc điểm: gen Cry, thành phần và hình dạng protein tinh thể,hoạt lực diệt côn trùng và typ huyết thanh Ý tưởng này đa được rất nhiều nhà khoa

học hưởng ứng và được sử dụng chủ yếu cho đến nay để phân loại Bacillus thuringensis var israelensis [14, 15, 22]

Bảng 1.1: Đặc điểm phân loại loài phụ Bacillus thuringensis var israelensis

(theo Hofte và Whiteley, 1989) [14]

Lớp gen

Cry

Thành phần protein (Kda)

Hình dạng tinh thể

Typ huyết thanh

Hoạt lực diệt côn trùng

Muỗi,ruồi đen

Muỗi,ruồi đen

Muỗi,ruồi đen

Muỗi,ruồi đen

Muỗi,ruồi đen

1.2.4 Protein diệt muỗi của loài phụ Bacillus thuringensis var israelensis

Sự hình thành protein tinh thể Bacillus thuringensis thường xảy ra trong quá

trình hình thành bào tử và nhiều nghiên cứu gần đây đã cho thấy nó có liên quanmật thiết tới sự có mặt của DNA plasmit Gen mã hóa protein độc thường nằm trêncác plasmit cỡ lớn trên 3kb gồm một phần là gen mã hóa protein độc và phần cònlại mã hóa protein liên quan đến tính gắn

Khi nghiên cứu các cách chủng Bacillus thuringensis var israelensis có hoạt

lực đối với côn trùng thuộc bộ hai cánh, người ta thấy protein độc của chúng baogồm các tiểu phần protein có trọng lượng phân tử: 130KDa, 128KDa, 78KDa,67KDa, 28KDa do các lớp gen Cry4A, Cry4B, Cry4C, Cry4D và Cyt mã hóa tổng

hợp nên Đây cũng chính là đặc điểm quan trọng nhất để phân biệt loài phụ Bacillus thuringensis var israelensis với các loài khác.

Nhóm Cry4 mã hóa tổng hợp các protein tinh thể có trọng lượng 130, 128, 78

và 67 KDa, có kích thước thông thường khoảng từ 0,7- 1,2 µm Nhóm gen Cry4 mãhóa tổng hợp các protein tinh thể có trọng lượng 130, 128, 78 và 67KDa có kíchthước thông thường đạt từ 0,7 – 1,2 µm Nhóm gen Cyt bao gồm hai lớp CytA và

CytB thường tồn tại ở các chủng Bacillus thuringensis var israelensis mang nhóm

gen Cry4 và tổng hợp các protein có trọng lượng phân tử khoảng 28KDa Các

chủng Bacillus thuringensis var israelensis thường tổng hợp các tinh thể protein

hình cầu chỉ gây độc đối với côn trùng hai cánh Tinh thể độc của Bti gồm hai loạithể vùi protein khác nhau gắn với nhau bằng các lớp vỏ bọc Mỗi thể vùi được bảoquản bởi một hay nhiều lớp nguyên liệu giống thành phần vỏ bọc mà đây cũng là

một đặc điểm chỉ có vỏ Bacillus thuringensis var israelensis giúp cho tinh thể độc

vẫn giữ được độc tính với côn trùng dưới tác dụng của proteaza cùng một số hóachất khác mà cụ thể như sau:

Protein 28KDa có trong thể vùi lớn nhất (chiếm khoảng 40 - 50% tinh thể) Nóthể hiện rõ trên gen polyarcylamide (SDS - PAGE) bởi tính hòa tan của nó cao hơn

hắn các protein khác Đối với protein này dưới tác dụng của enzyme proteaza, nó bị

thủy phân thành protein có trọng lượng chỉ còn là 25KDa và hoạt lực diệt ấu trùngmuỗi rất thấp

Protein 67KDa có trong thể vùi lớp thứ hai chiếm khoảng 15 - 20% tinh thể.Cũng giống như tiểu phần 28KDa thì protein này cũng bị thủy phân thành các tiểuphần nhỏ hơn 31KDa, 35KDa bởi enzyme proteaza và hoạt tính đối với ấu trùngmuỗi cũng kém

Cuối cùng các protein 128KDa và 135KDa có trong thể vùi nhỏ nhất, bị phânhủy thành các nhân độc 58 - 73KDa dưới tác dụng của proteaza nhưng có hoạt lựcdiệt ấu trùng muỗi cao nhất Hiện nay protein này đang được tập trung nghiên cứunhiều nhất và người ta cho rằng hai protein này là thành phần quan trọng đối vớihoạt lực diệt ấu trùng của tinh thể [15, 20, 28]

Các thử nghiệm thực tế bằng cách tách riêng rẽ từng loại protein tinh thể của

Bacillus thuringensis var israelensis cho thấy rằng các protein 28, 67, 128, 135

KDa đều có hoạt tính độc đối với ấu trùng muỗi [13, 20] Tuy nhiên, Chichott vàEllar đã chứng minh rằng việc sử dụng cả 4 loại protein tinh thể sẽ cho hiệu quả caohơn do có sự tác động qua lại giữa 2 hay nhiều protein [15]

Bảng 1.2: So sánh hoạt lực diệt ấu trùng muỗi Aedes aegypti của protein riêng

rẽ và hỗn hợp protein (theo Chichott và Ellar, 1988) [14]

Chế phẩm LC50 (µg/ml)

Hỗn hợp tinh thể 0.32Tinh thể hòa tan 1

độc chủ yếu diễn ra trong ruột của côn trùng Bởi khi nuốt phải tinh thể (hay còn gọi

là tiền độc tố) dưới tác dụng của pH cao và enzyme proteaza của đường ruột màtinh thể độc được hòa tan, thủy phân và hoạt hóa thành các nhân độc có hoạt tính.Sau đó các nhân tố độc này bám dính lên tế bào thượng bì ruột, làm phá hủy cấutrúc tế bào ruột và tạo nên các lỗ rò rỉ Vì vậy, trong ruột côn trùng có sự chênh lệch

áp suất thẩm thấu giữa ruột côn trùng với môi trường ngoài tạo điều kiện cho cácion cũng như nước khuếch tán từ ngoài vào gây nên sự phình của tế bào ruột Cuốicùng, côn trùng ngừng ăn trở nên chậm chạp và sau đó chết hắn [8, 11, 16, 20]

1.2.6 Cơ chế tác dụng của bào tử vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis

- Bước 1: Xâm nhập vào các ấu trùng của côn trùng qua đường tiêu hóa.

- Bước 2: Protein tinh thể do Bacillus thuringensis var israelensis tổng hợp

được hoạt hóa dưới tác động của môi trường kiềm trong ruột ấu trùng muỗi

- Bước 3: Chọc thủng ruột giữa gây ra sự tổn thương làm chúng ngừng ăn Sau

đó một vài ngày thì ấu trùng muỗi chết

Bti sẽ diệt ở giai đoạn ấu trùng (lăng quăng) Sau khi trứng muỗi được đẻ vàonơi ngập nước hay ẩm ướt (lá khô đọng nước, nước mưa ), trứng sẽ nở thành lăngquăng Lăng quăng ăn các hạt thức ăn và cả vi sinh vật để phát triển Đây là thờiđiểm thích hợp để người ta diệt chúng bằng Bti Giai đoạn tuổi ấu trùng kéo dàikhoảng 10 - 12 ngày Khi ấu trùng hoá nhộng (khoảng 24 giờ), chúng không ăn nữa,rồi lột vỏ nhộng chui ra thành muỗi

Không chỉ tiêu diệt một cá thể, Bti còn được lây lan cho các ấu trùng khác qua phân, xác chết của ấu trùng bị nhiễm Do đó, có thể tạo ra sự lây nhiễm trên một diện tích lớn Khi ấu trùng nhiễm Bti bị tiêu diệt tới 90% thậm chí đạt tới 99% [10,

máu Cũng có một nhánh muỗi, tên là Toxorhynchites, không hút máu Muỗi cái

dựa vào nhiệt độ cơ thể con mồi, mùi mồ hôi, mùi cơ thể, axit lactic, cacbon dioxit

để tìm ra con mồi Trong nước bọt của muỗi cái chứa protein chống máu đông nênmáu sẽ không bị đông lại Khi muỗi đốt xong và bay đi, nước bọt của chúng vẫnđọng lại trong vết thương Lượng protein trong nước bọt này sẽ khiến cơ thể phảnứng lại qua việc da căng phồng lên và cảm thấy ngứa, chỉ đến khi các protein nướcbọt bị các tế bào miễn dịch trong cơ thể phá vỡ thì cơn ngứa mới chấm dứt [16, 24]

1.3.1 Vòng đời và đặc tính sinh học của muỗi.

Muỗi thuộc loài biến thái hoàn toàn, vòng đời trải qua 4 giai đoạn: Trứng, ấutrùng, nhộng, trưởng thành Mỗi giai đoạn có thể dễ dàng nhận biết bởi những đặcđiểm khác biệt Toàn bộ thời gian từ trứng đến muỗi trưởng thành, ở điều kiện tốtnhất là khoảng 7 - 13 ngày Nhiệt độ môi trường càng cao, vòng đời phát triển củamuỗi càng ngắn, nhưng nếu cao quá 350C thì muỗi không phát triển được Nhiệt độmôi trường thích hợp cho muỗi phát triển khoảng 250C - 300C [24]

1.3.1.1 Giai đoạn trứng

Muỗi đẻ trứng trên mặt nước, trứng của chúng kết lại với nhau thành mảng trôinổi trên mặt nước, một mảng có thể bao gồm đến 100 - 300 trứng, giống như vếtváng bẩn trôi nổi trên mặt nước Một con muỗi cái có thể cứ sau 3 đêm lại đẻ ra một

mảng trứng như vậy trong suốt cuộc đời Phần lớn trứng muỗi sẽ nở thành ấu trùngtrong vòng 24 - 48 giờ Ở một số loài như ở loài Aedes và Ochlertatus trứng có thểchịu được điều kiện khô hạn và chỉ nở khi có nước ngập trở lại hoặc có loài thìtrứng có thể tồn tại được trong điều kiện nhiệt độ dưới 00C trong mùa đông, sau đókhi ấm áp sẽ nở ra Nước là điều kiện quan trọng trong đời sống của muỗi Phần lớncác loài muỗi thường đẻ trứng trên mặt nước sạch hoặc những nơi chứa nước tùđọng như: trong bể nước, vại nước, vỏ lon, chậu cảnh, bể tắm, mảnh chậu vỡ, vũngnước đọng v.v Đặc biệt là ở những nơi nước đọng được che khuất ánh sáng và gió.[24]

Hình 1.3: Muỗi đẻ trứng [24]

1.3.1.2 Giai đoạn ấu trùng

Ấu trùng muỗi thường sống trong nước từ 4 – 14 ngày tùy vào nhiệt độ củamôi trường Trong quá trình sống phải chạm vào mặt nước để thở Phần lớn ấutrùng muỗi treo ngược mình gần mặt nước và có một ống thở thò lên trên mặt nước.Riêng ấu trùng của loài muỗi Anopheles không có ống thở do đó nó phải nằm songsong với mặt nước Ở giai đoạn ấu trùng này muỗi cần rất nhiều thức ăn là các loài

vi sinh vật hoặc các chất hữu cơ trong nước như tảo, sinh vật phù du, nấm, vikhuẩn v.v Đặc biệt, loài muỗi Toxorhynchites với cơ thể khá lớn lại là thiên địchcủa muỗi thông thường vì ấu trùng của nó ăn ấu trùng của các loài muỗi khác.Trong quá trình phát triển, ấu trùng lột xác 4 lần và lớn dần sau mỗi lần lột xác Ởlần thứ nhất, ấu trùng có kích thước khoảng 1,5 mm và ở lần thứ tư nó có kíchthước khoảng 8 - 10mm Trong lần lột xác thứ tư ấu trùng chuyển sang giai đoạnnhộng [24]

Hình 1.4: Ấu trùng muỗi [24]

1.3.1.3 Giai đoạn nhộng

Đây là giai đoạn ngủ nghỉ nhưng nhộng muỗi vẫn di chuyển đồng thời là thờigian để chuyển đổi cơ thể thành muỗi trưởng thành Giai đoạn này kéo dài 1 - 4ngày Tùy thuộc vào sự thay đổi ánh sáng, bằng một cái búng mình hoặc quẫy đuôi,nhộng muỗi có thể dịch chuyển xuống đáy nước hoặc khu vực an toàn hơn Nhộngmuỗi thường có màu sáng hơn so với màu nước Chúng bám vào mặt nước và sửdụng 2 ống thở để hô hấp Khi đã phát triển hoàn chỉnh, muỗi trưởng thành sẽ phá

vỡ bọc nhộng để thoát ra

Hình 1.5: Nhộng muỗi [24]

1.3.1.4 Giai đoạn trưởng thành

Khi vừa mới thoát ra khỏi bọc nhộng, cơ thể trưởng thành còn yếu ớt, chúngphải lưu lại trên mặt nước một thời gian ngắn để cơ thể cứng cáp, cánh mở hẳn ra và

đủ khô rồi mới bay đi.một vài ngày sau khi vũ hóa nhu cầu hút máu làm thức ăn và

giao phối chưa xuất hiện Muỗi trưởng thành của những loài như Aedes vàOchlerotatus có khả năng bay xa khỏi nơi sinh ra đến cả chục cây số Tuy nhiênphần lớn chúng thích lẩn quẩn trong khu vực nhà ở của người, gia súc hoặc nơi cưtrú quen thuộc, chỉ khi nào thời tiết thuận lợi và nhu cầu tìm nguồn nước để đẻtrứng chúng mới di chuyển xa.

Hình 1.6: Quá trình vũ hóa của muỗi [24]

Hình 1.7: Các giai đoạn ấu trùng muỗi [16]

1.3.2 Tác hại của muỗi

Muỗi là tác nhân lây truyền những căn bệnh nguy hiểm Muỗi Anopheles

mang ký sinh trùng sốt rét Một số loài muỗi có khả năng là vật trung gian truyền

bệnh giữa người với người, hay giữa động vật và người Các bệnh do muỗi truyền

có thể gây tử vong cao chủ yếu là sốt xuất huyết, sốt rét, sốt vàng da,

Trên thế giới, bệnh sốt rét hiện dẫn đầu trong số ca tử vong, nhất là đối với trẻ

em dưới 5 tuổi, với khoảng 5,3 triệu trẻ em chết mỗi năm Muỗi gây ra bệnh sốt rét

có tên Khoa học là Anopheles Ở Việt Nam có 3 loại muỗi truyền sốt rét là Anopheles dirut, Anopheles sundaiais và Anopheles Chúng thường trú đậu trên

tường, mái, vách, gầm, gập, vật treo, hốc cây, hố đất, lùn bụi Chúng thường chíchđốt máu người suốt đêm, đỉnh cao là từ 8 giờ tối đến 3 giờ sáng

Hầu hết các loài muỗi đều mang ký sinh trùng giun chỉ, loại ký sinh trùng gâynên biến dạng trên cơ thể phổ biến là bệnh chân voi thông qua việc gây sưng phồnglớn một vài bộ phận trên cơ thể Trên thế giới có khoảng 40 triệu người đang sốngtàn phế do ký sinh trùng giun chỉ gây ra Các bệnh do virút gây ra như sốt vàng da

và dịch hạch được lan truyền chủ yếu bởi loài muỗi vằn có tên khoa học là Aedes aegypti.

Ở Việt Nam, vào mùa hè và mùa mưa hàng năm, sự phát triển của muỗithường xuyên diệt trừ muỗi gây nên các dịch bệnh gây tử vong ở nhiều người Theo nhận định của Tổ chức Y tế Thế giới ( World Health Organization –WHO), trong 5 – 8 năm tới tất cả các loại bệnh này đều chưa có vắcxin phòng ngừa.[23, 24]

1.3.3 Các biện pháp phòng và diệt trừ muỗi

Để tiêu diệt và khống chế muỗi có hiệu quả cần nghiên cứu kỹ địa bàn tậptrung và chọn lựa giai đoạn phát triển dễ tác động Một số biện pháp phòng trừ tổnghợp đối với loài muỗi như sau:

- Khống chế trứng và bọ gậy: San lấp các hố nước đọng, khai thông cống rãnh,

đổ hết nước đọng tại các dụng cụ tồn lưu nước như chum, vại, làm mất nơi cư trúcủa bọ gậy và nơi sinh sản của muỗi trưởng thành Dọn dẹp, phát quang bụi cây, thudọn rác thải xung quanh khu vực cần xử lý Dọn dẹp đồ đạc gọn gàng làm mất môitrường sinh sống của muỗi trưởng thành

- Phun hoá chất định kỳ để diệt côn trùng và các vectơ truyền bệnh, thời gianphun tốt nhất là vào đầu và cuối mùa mưa Các diện tích cần phun bao gồm: Tường,

các khoảnh sân, khoảng trống, các tường phía ngoài bao quanh diện tích cần xử lý,các rèm cửa, quần áo nơi muỗi có thể trú ngụ; các nắp cống rãnh nơi trú ẩn của bọgậy Phun với độ cao 2m trở xuống.

- Đốt hương muỗi: Được sử dụng nhiều do giá thành rẻ và không tốn nănglượng nhưng có nhược điểm là gây mùi khó chịu đối với một số người đặc biệt làtrẻ em

- Dùng đèn bẫy và vợt bắt muỗi: Đèn bẫy muỗi được bao quanh bởi lưới kimloại có hiệu điện thế thấp với một đèn phát ánh sáng hấp dẫn muỗi và côn trùng tụtập đến Khi muỗi và côn trùng sa vào lưới, dòng điện nhỏ sẽ phóng qua và tiêu diệtchúng Phương pháp này sử dụng được cả trong nhà và ngoài trời [24]

Những phương pháp phòng và diệt trừ muỗi trên đây đã và đang mang lạinhững hiệu quả nhất định Tuy nhiên, còn tồn tại nhiều nhược điểm như cần phảithực hiện định kỳ, tốn thời gian, công sức, hóa chất, dụng cụ Do vậy, việc sử dụng

chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis đang là lựa

chọn hàng đầu của nhiều nước trên thế giới bởi những ưu điểm vượt trội của nó TạiViệt Nam chế phẩm này đã được sản xuất và thử nghiệm thành công Tuy nhiên, giáthành còn khá cao Việc nghiên cứu thành công môi trường là nước thải thủy sản cóthể thay thế môi trường ban đầu để nuôi chủng vi khuẩn này sẽ giúp giảm đáng kểgiá thành của sản phẩm

1.4 Thành phần nước thải thủy sản Surimi

Thuật ngữ Surimi của Nhật bản là cách nói thông dụng để gọi tắt tên của cácsản phẩm làm từ thịt cá xay nhuyễn Surimi còn được gọi là chả cá, là một loạiprotein trung tính, được chế biến qua nhiều công đoạn rửa, nghiền và định hình cấutrúc Các protein đã làm sạch phối trộn với các chất phụ gia và sau đó đem đi cấpđông, nó sẽ hình thành gieo cứng và đàn hồi Tính tạo gel, tính giữ nước và tạo nhũtương tạo nên cấu trúc để làm nguyên liệu cho việc sản xuất Kamaboko, Chikuwacủa Nhật hay mô phỏng các loại hải sản khác như tôm, cua, sò rất được ưa thíchtrên thế giới Các sản phẩm có tên gọi Surimi có những đặc tính rất nổi bật như làkhông có mùi tanh và độ kết dính cao Nguồn nguyên liệu để sản xuất Surimi rất đadạng và phong phú nhưng để cho ra sản phẩm có chất lượng cao, màu sắc và độ bềncủa gel Surimi đảm bảo thì thường là các loại cá kích thước nhỏ, giá trị kinh tế thấp,

có lượng thịt trắng nhiều, mỡ ít và khai thác được quanh năm khi đó viêc sản xuấtSurimi có ý nghĩa kinh tế cao hơn Ở nước ta thường sử dụng các loại cá sản xuấtSurimi như: cá rô phi, cá phèn, cá mối, cá chuồn, …[31]

Quy trình sản xuất Surimi bao gồm nhiều công đoạn như: làm sạch cá, phile,xay, lọc, ép tách nước, phối trộn…Người ta ước tính để sản xuất được 1kg thànhphẩm sẽ phải thải ra 30 lít nước thải và mức độ nhiễm bẩn của nước thải từ các nhàmáy sản xuất Surimi là rất lớn [31] Nếu như lượng nước thải ra này không được xử

lý triệt để thì khi thải ra ngoài sẽ gây ra mức độ ô nhiễm môi trường nghiêm trọnglàm ảnh hưởng tới sự phát triển lâu dài của nhà máy và chất lượng sống của ngườidân khi môi trường sống bị tác động [3]

Bảng 1.3: Tính chất nước thải thủy sản Surimi [3]

STT Thông số Đơn vị Giá trị

2.1 Vật liệu

- Chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis do phòng thí nghiệm

thuộc Bộ môn công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng cung cấp

- Nước thải từ nhà máy sản xuất Surimi của công ty Bắc Đẩu có địa chỉ tạiThọ Quang - Đà Nẵng Thời gian lấy nước thải từ tháng 11/2013 tới tháng 5/2014

Nước thải sau khi thu nhận tại nhà máy được lưu trong tủ lạnh 40C nếu chưa được

sử dụng Thời gian lưu không quá 2 tuần

- Ấu trùng muỗi: Được mua tại tiệm bán cá cảnh có địa chỉ tại 132 Trưng NữVương - Đà Nẵng Vì ấu trùng muỗi có 4 giai đoạn phát triển, nên cần sử dụng ấutrùng giai đoạn 1 - 2 (chiều dài từ 1,5 - 5 mm) để thời gian chuyển hóa thành nhộng

và muỗi không ảnh hưởng kết quả khảo sát Do vậy, sau khi mua về cần thực hiệnquá trình chọn lựa

Hình 2.1: Ấu trùng muỗi thích hợp

- Hóa chất và môi trường

+ Môi trường nuôi cấy Glucose-men-muối (GYS): 0,1% Glucose; 0,2% chiếtnấm men; 0,05% K2HPO4; 0,2% (NH 4 )2SO4; 0,002% MgSO4; 0,005% MnSO4;0,008% CaCl2. [5]

- Thiết bị trong phòng thí nghiệm: Cân phân tích model E1240 – OHAUS –

Mỹ, cân kỹ thuật model ARC 120 OHAU – Mỹ, tủ ấm MEMMERT, box cấy vô

trùng, máy lắc khô, máy đo pH, máy đo mật độ quang, … và các dụng cụ thínghiệm cần thiết trong phòng thí nghiệm

2.2 Phương pháp

2.2.1 Hoạt hóa, cấy chuyền và nhân giống chủng vi khuẩn Bacillus

thuringensis var israelensis

2.2.1.1 Hoạt hóa

Hình 2.2: Sơ đồ quy trình thực hiện

Nhân giống cấp 1, 2

Thu sinh khối

Hoạt hóa

Giống gốc

Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy

Môi trường (GYS) + agar

Bình Erlenmeyer 250ml

- Môi trường nuôi cấy Glucose – Men - Muối (GYS): 0,1% Glucose; 0,2%Chiết nấm men; 0,05% K2HPO4; 0,2% (NH4)2SO4; 0,002% MgSO4; 0,005%MnSO4; 0,008% CaCl2.

Cho môi trường GYS lỏng vào ống nghiệm (môi trường chiếm khoảng 1 4ốngnghiệm), sau đó nút bông, hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, 2 giờ Nếu chưa dùngngay có thể được bảo quản ở 2 - 80C Tiến hành cấy giống và nuôi trong máy lắc150vòng/phút, nhiệt độ 300C, thời gian 24 – 48 giờ [15, 29]

Cấy giống

Mẫu ban đầu ở dạng rắn phải đưa về dạng lỏng bằng cách:

+ Cho 1 ít mẫu chế phẩm có chứa bào tử vi khuẩn vào ống Eppendorf đã chứasẵn môi trường GYS và trộn đều mẫu trên máy voltex Sau đó cho toàn bộ hỗn hợpvào ống nghiệm chứa môi trường hoạt hóa

2.2.1.2 Cấy chuyền và nhân giống chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis.

israelensis

Hình 2.3: Sơ đồ qui trình nhân giống và cấy chuyền

Ủ ấm 300C, 24 - 48 giờ Bảo quản 4 - 50C

Tăng sinh khối

 Đồ án Tốt nghiệp

 Chọn khuẩn lạc tốt nhất để nhân giống

Để chọn được khuẩn lạc tốt cần tiến hành cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãngkhác nhau để thu được khuẩn lạc đơn Thu nhận khuẩn lạc đơn có một số đặc điểmnổi bật như: Khuẩn lạc xuất hiện sớm, màu sắc trên khuẩn lạc đồng đều, …

Chuẩn bị môi trường pha loãng

Nước cất được đậy bằng nút bông không thấm nước, có giấy bọc, hấp khửtrùng ở nhiệt độ 121oC , 1at, 20 phút, sau đó để nguội Lấy 1ml dịch giống cho vàoống nghiệm chứa 9ml nước cất được độ pha loãng 101 Lấy 1ml từ độ pha loãng 101

cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất được độ pha loãng 102 Cứ tiếp tục như vậycho đến khi đạt được độ pha loãng cần thiết [1]

Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứagiống vi sinh vật lên bề mặt môi trường thạch trong đĩa pêtri

Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa để khửtrùng 3 lần Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa

Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa pêtri

Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch Trong khi trải,thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện chothanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường

Hình 2.4: Pha loãng mẫu lỏng theo dãy thập phân [26]

Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợptrong tủ ấm

Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá

30 phút Sau đó, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 300C, 24 - 48 giờ

Khi thạch đông, lật úp đĩa, cho vào tủ ấm 300C trong thời gian từ 24 - 48 giờ

Làm thạch nghiêng, đổ thạch vào đĩa pêtri

+ Đổ thạch vào đĩa pêtri

Môi trường sau khi tiệt trùng được đổ từ bình đựng vào từng đĩa Toàn bộ quytrình đổ thạch vào đĩa pêtri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng

+ Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừakết thúc và môi trường chưa đông đặc

Hình 2.5: Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và đĩa pêtri

Phương pháp cấy trên thạch nghiêng

- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên

- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác:

+ Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm

+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo đường thẳng [15, 21]

Tăng sinh khối

- Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác

- Dán nhãn ghi: Tên giống vi sinh vật, ngày cấy lên thành ống nghiệm.

- Cấy truyền bằng que cấy

+ Cầm que cấy thẳng đứng, đốt đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, đưa ngangphần kim loại trên đèn vài lần để có que cấy đã vô trùng

+ Lấy một vòng que cấy đầu tròn vi khuẩn từ đĩa thạch trong điều kiện vôtrùng

+ Khi đầu que cấy chạm vào môi trường thì lắc khẽ que cấy cho vi khuẩn tantrong môi trường

+ Khử trùng que cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn

- Sau khi cấy truyền xong đặt môi trường vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C, thời gian

24 – 48 giờ

Bảo quản và kiểm tra môi trường

+ Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế ánh sáng,nhiệt độ từ 2-8 0C và không để môi trường bị khô [1, 25]

2.2.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc

Mục đích

Xác định mật độ tế bào của lượng giống đưa vào khảo sát và mật độ bào tử

chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis sau khi nuôi trên môi trường

nước thải Surimi

Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật cònsống hiện diện trong mẫu Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thànhkhuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Do vậy phương pháp này có tên gọi là phươngpháp đếm khuẩn lạc hay đếm đĩa

Tiến hành

Phương pháp này cần thực hiện 3 bước kỹ thuật cơ bản

Bước 1: Mẫu tế bào cần đo tiến hành pha loãng mẫu theo dãy thập phân 10-5;

10-6; 10-7; 10-8 Hút 0,1 ml tương ứng ở mỗi độ pha loãng vào mỗi đĩa (tiến hành lặplại 3 lần ở mỗi độ pha loãng) Các đĩa đã được đổ môi trường dinh dưỡng GYSAgar Môi trường đã được khử trùng 1210C, 1at, thời gian 20 giờ và chuẩn bị trước

2 ngày để khô bề mặt và kiểm tra sự vô trùng

Bước 2: Đem ủ ở 300C, 24 giờ

Bước 3: Chọn đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 30 - 300 khuẩn lạc/đĩa, đánh

dấu đếm, lấy giá trị trung bình của 3 đĩa ở mỗi độ pha loãng

Bước 4: Tính kết quả M1( tế bào/ml) =

A V

D



Trong đó: A1: Số khuẩn lạc trung bình/đĩa

D1: Độ pha loãng cuối cho khuẩn lạc đơn

V : Dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml) [1, 26]

2.2.3 Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ (OD) và mật độ

+ Rửa sinh khối bằng nước muối sinh lý

+ Hút nước muối sinh lý vào sinh khối cho đủ 10ml

+ Tiến hành pha loãng mẫu với các hệ số pha loãng khác nhau và đo OD ứngvới các hệ số pha loãng đó Từ các giá trị OD tương ứng và các giá trị mật độ tế bàopha loãng tiến hành lập đường chuẩn

Phương pháp đo độ đục

Ở phương pháp này mật độ vi sinh vật có thể được xác định một cách gián tiếpthông qua đo độ đục Nguyên tắc dựa trên sự cản ánh sáng bởi các phần tử khôngtan lơ lửng trong pha lỏng hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do sự hiệndiện của chúng làm phân tán chùm ánh sáng tới Độ đục của huyền phù tỷ lệ với

mật độ tế bào Trong giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào có thể xác lậpquan hệ tuyến tính giữa chúng, thông qua máy so màu ở bước sóng 600nm

Bước 1: Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào.

Tiến hành pha loãng huyền phù vi sinh vật theo bảng 2.1:

Bảng 2.1: Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào

- Xác định số lượng tế bào (CFU/ml) tương ứng theo từng mẫu ở bảng trên,

Vẽ đường biểu diễn mật độ tế bào (CFU/ml) theo OD (600nm)

Bước 2: Xác định mật độ tế bào theo trị số OD (600nm) của các mẫu có tế bào

vi sinh vật tương ứng cần đo được Kết hợp với đồ thị vừa lập cho phép xác địnhnồng độ tế bào trong dịch nuôi

2.2.4 Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bacillus

thuringensis var israelensis trên môi trường nước thải

Mục đích

Xác định các giai đoạn sinh trưởng của giống để lựa chọn thời điểm mà giống

đạt chất lượng tốt nhất cho quá trình lên men và thời điểm dừng lên men

+ Cấy lượng giống bằng 5% so với thể tích môi trường lên men, tiến hànhnuôi cấy nuôi trên máy lắc khô với chế độ làm việc: t = 300C, tốc độ lắc 150vòng/phút Sau 6 giờ đầu tiên rút mẫu ra đo mật độ quang tại bước sóng 600 nm.

2.2.5 Quan sát và so sánh các đặc tính tế bào trên môi trường GYS và môi trường nước thải.

Quan sát tế bào

Dùng kính hiển vi quang học vật kính 100, quan sát sau 24 giờ bằng cáchnhuộm bào tử Thực hiện tiêu bản giọt ép từ canh trường trong các môi trường GYSlỏng có giống vi khuẩn đã tăng sinh hoặc từ ống giống thạch nghiêng và sinh khối ởmôi trường nuôi cấy là nước thải sau khi tiến hành gây shock nhiệt 800C trong 10phút, đặt lên băng 5 phút và cuối cùng là ly tâm 8000 vòng/phút, nhiệt độ 40C trong

20 phút Sau khi có tiêu bản giọt ép, thực hiện nhuộm bằng thuốc nhuộm xanhmetylen để quan sát đại thể bào tử vi khuẩn [1]

Các bước thực hiện

Pha dung dịch nhuộm xanh methylen: pha 0,1g xanh methylen vào 10 mlmethanol 96% hòa vào dung dịch 0,01% KOH

Bước 1: Làm vết bôi và nhuộm tiêu bản

- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít bào tử vi khuẩn vào 1 giọt thuốc nhuộmxanh metylen ở giữa lam kính làm khô trong không khí hoặc ngược lại

- Cố định vết bôi bằng cách đặt nhẹ nhàng phiến kính lên, đậy lá kính sao chochân của lá kính chạm vào giọt nước hay giọt màu, nghiêng một góc 45o và hạ lákính xuống để không có bọt khí

- Đặt tiêu bản lên trên giá đỡ

Bước 2: Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học với vật kính dầu (x100)Đặt phiến kính lên bàn mẫu, hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng, dùng ốc chỉnhthô nâng bàn vật mẫu chạm tới vật kính, đặt mắt vào quan sát, dùng ốc chỉnh thô hạbàn mẫu xuống cho đến khi thấy ảnh VSV rồi dùng nút chỉnh vặn để xem rõ ảnh.Trên bàn mẫu, dùng ốc di chuyển mẫu vật di chuyển phiến kính đến vùng muốnquan sát [1, 26]

2.2.6 Xác định một số thông số và thành phần trong nước thải Surimi

+ Xác định hàm lượng Photpho bằng phương pháp Amoni Molipdat

Quá trình xác định được tiến hành tại phòng thí nghiệm của khoa Môi trường

2.2.7 Tối ưu yếu tố pH và độ pha loãng trong nuôi cấy vi khuẩn Bacillus

thuringensis var israelensis trên môi trường nước thải Surimi

2.2.7.1 Lập phương án thực nghiệm

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng

vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis: nhiệt độ, tốc độ lắc, pH, Các nhà nghiên cứu đã công bố các tài liệu liên quan về điều kiện lên men vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis và chỉ ra các giá trị cụ thể đồng thời đã được áp dụng

và mang lại hiệu quả trong thực tế Như nhiệt độ nuôi là 300C, tốc độ lắc150vòng/phút Mặt khác, nhiệt độ 300C gần với nhiệt độ phòng hơn nên giảm chiphí về cung cấp nhiệt Do vậy, trong phạm vi đề tài này ta chỉ nghiên cứu ảnhhưởng của pH môi trường lên men và độ pha loãng của nước thải thu nhận đến mật

độ tế bào (y; số tế bào/ml) Vậy y là hàm mục tiêu y  max Thực ra mục tiêucuối cùng là độc tính diệt ấu trùng muỗi sinh ra trong quá trình hình thành bào tử

Để xây dựng mô tả toán học cho quá trình lên men, ở đây ta chọn qui hoạchthực nghiệm trực giao cấp II, với 2 yếu tố ảnh hưởng (k=2) Căn cứ vào thành phần

C, N, P trong môi trường nuôi cấy GYS ban đầu kết hợp tính chất của nước thảithủy sản Surimi Tiến hành các thí nghiệm thăm dò và chọn được điều kiện thínghiệm, mức các yếu tố (mức trên, mức dưới, mức cơ sở, mức *) như sau: [2]

Bảng 2.2: Mức, khoảng biến thiên của các yếu tố

biến Mức * Mức trên Mức cơ sở Mức dưới Mức *